Identificación sistemática y comparación de los perfiles expresados ​​de miARN exosomales en cerdos infectados con NADC30-como la cepa PRRSV

Resumen sencillo:Los exosomas desempeñan un papel único en la infección viral, la presentación de antígenos y la supresión/promoción de la inmunidad corporal. El virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) es uno de los patógenos más dañinos en la industria porcina. En este caso, utilizamos la cepa CHsx1401 similar a PRRSV NADC30-para infectar artificialmente 42-cerdos de un día de edad, aislar exosomas séricos e identificar 33 miARN exosomales expresados ​​de manera significativamente diferencial (DE) entre los grupos de infección y control, y Se seleccionaron 18 miARN DE asociados con la infección y la inmunidad por PRRSV como posibles moléculas funcionales implicadas en la regulación de la infección por el virus PRRSV mediante exosomas.

Abstracto:Los exosomas son vesículas biológicas secretadas y liberadas por células que actúan como mediadores de la comunicación intercelular y desempeñan un papel único en la infección viral, la presentación de antígenos y la supresión/promoción de la inmunidad corporal. El virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) es uno de los patógenos más dañinos en la industria porcina y puede causar trastornos reproductivos en las cerdas, enfermedades respiratorias en los cerdos, reducción del crecimiento y otras enfermedades que conducen a la mortalidad de los cerdos. En este estudio, utilizamos la cepa CHsx1401 similar a PRRSV NADC30-para infectar artificialmente 42-cerdos de un día y aislar exosomas séricos. Con base en la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, se identificaron 305 miARN en exosomas séricos antes y después de la infección, entre los cuales 33 miARN se expresaron de manera significativamente diferencial entre los grupos (13 relativamente regulados al alza y 20 relativamente a la baja). El análisis de conservación de secuencia del genoma CHsx1401 identificó 8 regiones conservadas, de las cuales se predijo que un total de 16 miARN expresados ​​diferencialmente (DE) se unirían a la región conservada más cercana a las 30 UTR del genoma CHsx1401, incluidos 5 miARN DE capaces de unirse al CHsx1401 30 UTR (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486, ssc-miR-6529). Un análisis más detallado reveló que los genes diana de los miARN expresados ​​diferencialmente estaban ampliamente involucrados en las vías de señalización relacionadas con la función exosomal y la inmunidad innata, y 18 miARN DE (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 , ssc-miR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, etc.) asociados con la infección por PRRSV y la inmunidad. como potenciales moléculas funcionales implicadas en la regulación de la infección por el virus PRRSV mediante exosomas.

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Palabras clave:PRRSV; exosoma sérico; miARN

1. Introducción

El virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) es un virus de ARN monocatenario de cadena positiva con una estructura de envoltura que pertenece al orden Nidovirales, familia Arteriviridae, género Betaarterivirus [1,2]. Es esférico o elipsoidal con un diámetro de 50 a 65 nm bajo un microscopio electrónico de congelación [3,4]. El genoma del PRRSV tiene aproximadamente 15 kb de longitud con una tapa de 50 y una cola de 30 poliA y contiene al menos 10 marcos de lectura abiertos (ORF) flanqueados por regiones no traducidas (UTR) en los extremos 50 y 30 [5,6] y está envuelto por una proteína de nucleocápside, con una doble capa lipídica para formar partículas de virus. Los exosomas pertenecen a vesículas con estructuras de membrana monocapa y tienen la misma estructura topológica que las células [7]. La forma es "en forma de copa" o "en forma de disco" bajo un microscopio electrónico [8,9]. Los exosomas pueden existir en el sistema circulatorio durante mucho tiempo, y las sustancias de los exosomas pueden ser absorbidas por células adyacentes o células receptoras distantes y luego regular las células receptoras para que participen en el intercambio de material genético entre células [10,11]. Están compuestos principalmente por sustancias de la superficie de la membrana y contenidos transportados, incluidos receptores de la superficie celular, proteínas de membrana, proteínas solubles, lípidos, ARN (ARNm, miARN, ARNc y ARN viral, etc.), ADN genómico, ADN mitocondrial [12-14 ]. Los microARN (miARN) son una clase de ARN pequeños monocatenarios no codificantes endógenos evolutivamente conservados de 18 a 25 nucleótidos (nt), que inhiben el proceso de traducción al inducir la degradación del ARNm objetivo o al unirse con 30 UTR del ARNm objetivo, lo que lleva a al silenciamiento génico postranscripcional, y luego regulando la expresión génica en el nivel postranscripcional [15-17]. Se estima que los miARN regulan postranscripcionalmente más del 60% de los genes de los mamíferos [18,19]. Los miRNA juegan un papel importante en la comunicación intercelular y también pueden usarse como una molécula funcional potencial para la infección, transmisión y defensa de enfermedades y virus [20]. Un número creciente de estudios ha demostrado que los miARN pueden estar presentes en los fluidos corporales, como la saliva, la orina, la leche materna y la sangre, y actuar a través del sistema circulatorio de fluidos del cuerpo [21,22]. Los miARN exosomales se consideran reguladores endógenos de la expresión genética y el metabolismo y pueden indicar diversas condiciones patológicas [23, 24].

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En las últimas dos décadas, se ha demostrado que los miARN desempeñan funciones cruciales en la regulación del desarrollo de las células inmunitarias, las respuestas inmunitarias innatas y las respuestas inmunitarias adquiridas. Se informa que algunos otros miARN perjudican la infección por PRRSV de las siguientes maneras, se dirigen directamente al genoma de PRRSV o al receptor de PRRSV, o desempeñan un papel al regular la respuesta inmune innata del huésped. La familia miR-26 puede dañar significativamente la replicación del virus, y miR-26a puede inhibir la replicación de cepas de PRRSV tipo 1 y tipo 2 en macrófagos alveolares porcinos (PAM) mediante la regulación del interferón tipo I (IFN). vía, que es más eficiente que miR-26b [25,26]. Se identifica que miR-30c y miR-125b modulan la respuesta inmune innata del huésped al dirigirse a la vía de IFN tipo I y a la vía de NF-κB, respectivamente [27-29]. MiR-23, miR-378 y miR-505 son factores antivirales del huésped dirigidos a PRRSV y tienen sitios objetivo conservadores en las cepas de PRRSV tipo 2 [30]. Al mismo tiempo, se ha identificado que el huésped miR-506 inhibe la replicación de PRRSV al apuntar directamente al receptor CD151 de PRRSV en las células MARC-145 [31]. miR-181 también puede inhibir indirectamente la replicación de PRRSV al regular negativamente el receptor CD163 de PRRSV en monocitos sanguíneos y PAM [32]. Además, los miARN pueden promover la replicación del PRRSV al interferir con la fisiología celular básica. MiR-24-3py miR-22 se dirigen directamente a 30 UTR de HO-1 durante la infección por PRRSV para escapar de la inhibición de la hemo oxigenasa-1 (HO-1), una proteína de choque térmico (también conocida como HSP32) en PRRSV [33,34]. Se sabe que los cerdos son más susceptibles al PRRSV y menos capaces de defenderse de la entrada de este patógeno en el organismo [35]. En el presente estudio, se estudió a nivel molecular la inmunidad innata y la inmunidad adquirida de cerdos infectados con este virus utilizando una cepa prevalente en el campo. Se utilizó un kit de aislamiento de exosomas séricos, microscopía electrónica de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y Western blot (WB) para aislar e identificar exosomas séricos antes y después de la infección con PRRSV, seguido de un pequeño análisis de secuenciación de ARN, identificación, y análisis de los resultados de expresión diferencial utilizando métodos bioinformáticos para obtener varios miARN de exosomas séricos asociados a PRRSV, seguido de la identificación de los resultados de los datos mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR).

2. Materiales y métodos

2.1. Experimentos con animales

Se colocaron seis cerdos blancos grandes, sanos, de 42- días de edad, con doble negativo para antígenos y anticuerpos de PRRSV, en el sistema de alimentación limpia para cerdos para aislamiento, atención médica y adaptación ambiental. Todos los cerdos tenían libertad para comer y beber sin restricciones. Cuando se familiarizaron con las condiciones en el aislador, los cerdos fueron inoculados por vía nasal con 2 ml de 105 TCID50/mL PRRSV NADC30-como CHsx1401, que fue mencionado por sus predecesores [36,37]. La sangre de los cerdos antes (grupo de control, n=6) y 7 días después (grupo de tratamiento, n=6) de la inoculación del virus se recogió de la vena cava anterior para el aislamiento del suero. Los restos celulares del suero se eliminaron mediante centrifugación a 3000 g durante 15 min. Todos los experimentos con animales de nuestro estudio fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Ciencia Animal de la Academia China de Ciencias Agrícolas (CAAS) (Beijing, China), IAS2022-130.

2.2. Aislamiento y purificación de exosomas séricos.

El aislamiento y la purificación de exosomas se llevaron a cabo utilizando el kit exoEasy Maxi (QIAGEN, Hilden, Alemania, nº de catálogo 76064) según el protocolo del fabricante.

2.3. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Las suspensiones de exosomas extraídas se colocaron sobre la malla de cobre recubierta con carbo formvar, y los exosomas se enjuagaron con PBS y se sometieron a tinción estándar con acetato de uranilo durante 3 minutos a temperatura ambiente. Después de secar durante varios minutos a temperatura ambiente, la rejilla se visualizó y fotografió a 100 kV mediante un microscopio electrónico de transmisión (HT-7700, Hitachi-High Tech, Tokio, Japón).

2.4. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)

Los exosomas extraídos se diluyeron con 1 x PBS cambiando el volumen de 10 a 30 µl. Después de analizar la muestra, la concentración y el tamaño de los exosomas séricos se analizaron mediante un nanoanalizador de flujo N30E siguiendo las instrucciones del fabricante (NanoFCM, Xiamen, China).

2.5. Transferencia occidental

Las muestras de exosoma extraídas se agregaron a lisado de RIPA mezclado con inhibidor de proteasa (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) para extraer la proteína del exosoma, que se lisó en hielo durante 30 minutos. Luego, según las instrucciones del kit de Bradford, cuantificamos la concentración de proteína del exosoma sérico. Las proteínas exosomas sufrieron desnaturalización térmica. La misma cantidad de proteína se separó en un gel SDS-PAGE al 12 % y luego se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Burlington, MA, EE. UU.). Se empapó en TBST que contenía un 5% de leche desnatada en polvo y se selló durante 1 h a temperatura ambiente. Remojamos la membrana en el anticuerpo primario diluido (anticuerpo anti-CD9, Abcam, Boston, MA, EE. UU., #ab92726; anticuerpo anti-CD81, Abcam, Boston, MA, EE. UU., #ab109201) durante la noche a 4 ◦C y la recuperamos. el anticuerpo primario. Empapamos la membrana en el anticuerpo secundario diluido, la incubamos a temperatura ambiente durante 1 h y recuperamos el anticuerpo secundario. Colocamos la película lavada de PBST sobre la película de mantenimiento fresco, agregamos una solución cromogénica ECL a / b mixta de igual volumen y la colocamos en el generador de imágenes de quimioluminiscencia.

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2.6. Secuenciación de ARN pequeño exosomal y análisis de datos

El ARN total de los exosomas se extrajo con Trizol según las instrucciones del fabricante. Luego detectamos la concentración de ARN y el valor de densidad óptica (OD) y detectamos la degradación y pureza del ARN con electroforesis en gel de agarosa al 1%. Mientras tanto, se utilizó Agilent Bioanalyzer 2100 para detectar la integridad del ARN. Utilizamos el ARN total de los exosomas después de la inspección de calidad. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizamos el conjunto de preparación de biblioteca de ARN pequeño multiplex NEB NEXT para Illumina® (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). El kit preparó una pequeña biblioteca de ADNc de ARN y la secuenció para producir lecturas de un solo extremo de 50 nt mediante la plataforma Illumina Novaseq 6000. Todos los procedimientos para la preparación de pequeñas bibliotecas de ARN fueron realizados por Novogene (Beijing, China). Los datos después del control de calidad se alinearon con el genoma de referencia porcino (Sus scrofa 11.1) usando una pajarita. Los miARN conocidos fueron identificados mediante la base de datos miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org, consultada el 14 de enero de 2022), miRdeep2 (v0.0.5) [39] y miRevo (v1.1). ) [40] y se utilizaron para predecir nuevos miARN. Al mismo tiempo, DESeq (v1.24.0) [41] realizó el análisis de expresión diferencial de miARN, lo que requirió un |cambio de veces| > 1,6 y p < 0,05. La alineación se realizó usando MEGA (V11) [42] seguido de una puntuación de base única usando PHAST (v1.6.9) [43] y la evaluación de las regiones más conservadas de 10 genes de virus, incluido WUH3 (n.º de acceso de GenBank HM853973), VR2332 ( N.º de acceso de GenBank U87392), JXA1 (n.º de acceso de GenBank EF112445), CH-1a (n.º de acceso de GenBank AY032626), NADC30 (n.º de acceso de GenBank HN654459), HUN4 (n.º de acceso de GenBank EF635006), HLJZD 22-1812 (n.º de acceso de GenBank MN648450), SC/DJY (n.º de acceso de GenBank MT075480) y Lelystad (n.º de acceso de GenBank M96262.2). Se utilizó RNAhybrid (V2.0) [44] para predecir la unión de la secuencia de miRNA identificada a la 3 0 UTR del genoma del virus CHsx1401. Se utilizaron Miranda (v3.3a) y RNAhybrid para apuntar a la predicción de genes. El paquete cluster perfil [45] R se utilizó para el análisis de enriquecimiento funcional GO (Gene Ontology) de genes diana y el análisis de enriquecimiento de vías KEGG (Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto).

2.7. Validación de la expresión de miARN por RT-qPCR.

El ARN total se aisló de los exosomas séricos utilizando Trizol (Invitrogen, Shanghai, China) según el protocolo del fabricante. El ARN aislado se verificó mediante RT-qPCR en muestras (n=6 por grupo). El ADNc se sintetizó de acuerdo con las instrucciones del kit de síntesis de ADNc de la primera cadena de miARN (mediante tallo-loop) (Vazyme, Nanjing, China), y la cuantificación de la fluorescencia se realizó usando ABI 7500 de acuerdo con las Instrucciones de la mezcla maestra de qPCR SYBR universal de miARN (Vazyme, Nanjing, China). Los parámetros del ciclo térmico utilizados fueron los siguientes: primera etapa: 95 ◦C durante 30 s; Etapa 2: 95 ◦C por 5 s, 60 ◦C por 34 s y 40 ciclos; Etapa 3: 95 ◦C durante 15 s, 60 ◦C durante 1 min y 95 ◦C durante 15 s. Las secuencias de cebadores de miARN, el gen U6, se utilizaron como referencia [46] y se enumeran en la Tabla complementaria S1. Todas las verificaciones de qRT-PCR se realizaron utilizando tres réplicas biológicas y con tres réplicas para cada muestra. La abundancia relativa de las transcripciones se calculó mediante el método 2-Ct y se utilizaron SPSS (v22.0) y GraphPad Prism (v8.0) para el análisis y el mapeo de datos, respectivamente. p < 0,05 significa que la diferencia es estadísticamente significativa.

3. Resultados

3.1. Valor relativo del antígeno y el anticuerpo después de la inoculación del virus

Los resultados de las pruebas de antígeno y anticuerpos de PRRSV antes (día 0) y después de la exposición (día 7) se muestran en la Tabla 1. La detección serológica del antígeno y anticuerpo de PRRSV antes de la exposición fue negativa y el antígeno fue positivo después del desafío, lo que indica que los cerdos se infectaron exitosamente con CHsx1401.

3.2. Aislamiento e identificación de exosomas séricos.

Las vesículas aisladas del suero fueron descubiertas mediante TEM. En la mayoría de las vesículas se pueden ver los exosomas cóncavos en forma de platillo o disco en el medio. El borde de la membrana de los exosomas es visible y la morfología es relativamente completa (Figura 1A, B). El análisis de seguimiento de nanopartículas mostró que el 95,73% de los exosomas tenían un diámetro de 30 a 150 nm, principalmente alrededor de 72,25 nm, con un diámetro promedio de 76,22 nm, lo que concordaba con las características de tamaño de los exosomas (Figura 1C). Este rango de tamaño fue similar al detectado por TEM y confirmó aún más la identidad de estas vesículas como exosomas. El análisis de transferencia Western mostró que las vesículas aisladas de las muestras de suero fueron positivas para las proteínas CD9 y CD81 (Figura 1D). Las características anteriores se ajustan a los estándares de identificación de exosomas formulados por la Sociedad Internacional de Vesículas Extrace (ISEV) en MISEV2018 [47].

Tabla 1. Antígeno y anticuerpo de (día 0) y (día 7) con virus de desafío.

Figura 1. Principales características de los exosomas séricos. (A, B) muestran las características morfológicas de las vesículas por TEM. Las barras de escala son 500 nm y 100 nm, respectivamente. (C) NTA muestra el diámetro y la concentración de la mayoría de las vesículas. (D) La transferencia Western mostró la presencia de marcadores de exosomas CD81 y CD9 en los exosomas séricos. Nota: Los resultados de mezcla en WB son la suspensión mezclada de muestra aislada por el kit exoEasy Maxi.

3.3. Secuenciación de ARN pequeño de exosomas séricos

Para cada muestra, los datos limpios alcanzaron 0.5 Gb y el porcentaje base Q30 estuvo por encima del 96,20%. Las lecturas limpias de cada muestra se alinearon con el genoma de referencia del cerdo. Entre las 12 muestras, el grupo de control obtuvo 10.920.887, 10.248.696, 10.109.117, 10.655.494, 9.217.285 y 9.782.523 lecturas, respectivamente. El grupo de tratamiento obtuvo 11.889.518, 10.593.504, 10.593.504, 12.846.080, 10.105.325, 11.729.451 y 9.789.542 lecturas, respectivamente. En promedio, el 77,96% del total de lecturas limpias comprendía entre 19 y 22 nucleótidos (nt) de longitud (Figura 2A). Las lecturas después del control de calidad representaron más del 92,59% del total de lecturas. Las lecturas limpias procesadas se alinearon con el genoma de referencia porcino, y la tasa mapeada de 12 bibliotecas en el genoma fue superior al 92,30 %, y la tasa mapeada fue del 94,98 % (Figura 2B). Indicó que la biblioteca de miARN exosomal en suero construida era de alta calidad y adecuada para análisis posteriores. Los detalles se enumeran en la Tabla complementaria S2.

Figura 2. Descripción general de los datos del transcriptoma de ARN pequeño. (A) Distribución de longitud de los recuentos de lectura de muestras de exosomas séricos (nt=nucleótidos); (B) tasa de 12 muestras asignadas al genoma de referencia

3.4. Análisis de expresión diferencial de miARN.

Después del análisis cuantitativo de la expresión de miARN identificada, los miARN se examinaron según los umbrales descritos anteriormente en la Sección 2.6. Se obtuvieron un total de 305 miARN antes y después de la inoculación de la cepa CHsx1401 (control, n=6; tratamiento, n=6). Se identificaron un total de 33 miARN expresados ​​diferencialmente (DE) entre los dos grupos, 13 miARN DE se regularon positivamente y 20 miARN DE se regularon negativamente en el grupo de tratamiento (Figura 3 y Tabla complementaria S3).

3.5. Análisis de enriquecimiento funcional de genes diana de miARN

33 miARN DE predijeron un total de 7283 genes diana, y las funciones de los genes diana se concentraron principalmente en la regulación positiva de la cascada MAPK, el proceso de metabolismo de los lípidos, la regulación de la transducción de señales intracelulares, la cascada ERK1 y ERK2, etc. (Figura 4A ). En términos de funciones moleculares, los genes diana de miARN expresados ​​diferencialmente se centran principalmente en la actividad reguladora de la enzima GTP, la actividad quinasa, la actividad reguladora de la nucleósido trifosfatasa y otras funciones relacionadas con la transducción de señales y el metabolismo energético (Figura 4B). Además, entre los componentes celulares, los genes diana participan principalmente en las funciones biológicas de polímeros supramoleculares, Golgi, autofagosomas, superficie celular, endosomas tempranos, etc. (Figura 4C). Las funciones de estos componentes están estrechamente relacionadas con la formación de exosomas, lo que también explica la precisión de la secuenciación. El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG mostró que los genes diana se enriquecieron significativamente en la endocitosis, la vía de señalización MAPK, la vía de señalización Rap1, la vía de señalización de esfingolípidos y la vía de señalización PI3K Akt (p <0.05) (Figura 5A ). Al mismo tiempo, se clasificaron y analizaron las vías enriquecidas. Los resultados mostraron que la vía KEGG del gen objetivo se enriqueció principalmente en el procesamiento de información ambiental, enfermedades humanas y sistemas biológicos (Figura 5B).

Figura 3. Expresión diferencial de miARN en exosomas. (A) Gráfico de volcán de miARN entre los grupos de control y tratamiento; (B) mapa de calor de agrupamiento jerárquico de miARN DE entre los grupos de control y tratamiento.

Figura 4. Análisis de enriquecimiento de la función GO de genes diana de miARN DE. (A) Proceso biológico de los genes diana de miARN DE; (B) funciones moleculares de los genes diana de los miARN DE; (C) componentes celulares de los genes diana de los miARN DE

Figura 5. Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de genes diana. (A) Vía KEGG significativamente enriquecida con genes diana de miARN DE; (B) clasificación de vías KEGG significativamente enriquecidas.

3.6. Predicción dirigida al miARN exosomal sérico y al genoma CHsx1401 de PRRSV

Según la puntuación phastCons de una sola base después del alineamiento mediante PHAST, se obtuvieron un total de ocho segmentos más conservados (bandas negras sobre el mapa de picos) entre los genomas virales (Figura 6). Se encontró que un total de 31 miARN DE se unían al segmento conservado al predecir los miARN unidos al segmento conservado. Entre ellos, en la región conservada (14.644–15.020 nt) más cercana a las 30 UTR (14.870–15.020) del genoma CHsx1401, se predice que 16 miARN DE se unirán a ella, incluidos 5 miARN (ssc-miR-34 c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 y ssc-miR-6529) que pueden unirse a las 30 UTR de CHsx1401. Entre estos miARN, solo ssc-miR-223 se reguló positivamente después de la infección, y otros miARN se regularon negativamente después de la infección. Consulte la Tabla complementaria S4 para obtener más detalles.

Figura 6. Segmentos conservados en el genoma de la cepa CHsx1401 predicha por PHAST

3.7. Detección de miARN DE relacionados con la función exosoma y PRRSV

Se encontró una variedad de miARN expresados ​​diferencialmente relacionados con la función de los exosomas y el PRRSV mediante análisis de enriquecimiento funcional de genes diana. Entre ellos, 11 miARN DE, como ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 y ssc-miR-320, están implicados en la captación de exosomas y sus genes diana se concentran principalmente en la familia de genes Ras, la familia de las anexinas y la familia de genes de ribosilación de ADP. Dieciocho miARN DE, incluidos sscmiR-10b, ssc-miR-124a y ssc-miR-128, participan en vías relacionadas con el sistema inmunológico y sus genes diana se concentran principalmente en MAPK. familia de genes, familia de genes PIK3 y familia de genes de proteína fosfatasa. Si bien 11 miARN DE están involucrados en la invasión del virus, los genes diana relacionados se concentran principalmente en la familia de genes MAPK y la familia de genes de la proteína fosfatasa. Además, múltiples miARN expresados ​​diferencialmente, como novel_102. Seis miARN DE, incluidos ssc-miR-320, ssc-miR-423-5p, ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-7137-3p y ssc-miR{{ 25}}, se coexpresan en la función del exosoma, la invasión del virus PRRSV y las vías relacionadas con el sistema inmunológico, como se muestra en la Figura 7. Los detalles se muestran en la Tabla complementaria S5.

Figura 7. DE miARN relacionados con la captación de exosomas, la invasión de PRRSV y la inmunidad

3.8. Ensayo QRT-PCR de miARN DE entre los dos grupos

Se seleccionaron aleatoriamente cinco miARN DE para su verificación. Según los resultados de qRT-PCR, la expresión de ssc-miR-19a y ssc-miR-32 aumentó en el grupo de tratamiento, mientras que ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}} y ssc-miR-34c mostraron una expresión más alta en el grupo de control, lo que coincide con los datos de secuenciación (Figura 8).

Figura 8. Cinco miARN DE validados por qRT-PCR

4. Discusión

El PRRSV sigue siendo un patógeno persistente en la industria porcina mundial y causa enormes pérdidas económicas en el mundo. En la actualidad, la vacunación se utiliza principalmente para prevenir y controlar el PRRSV, entre los cuales la vacuna de virus vivo modificado (MLV) es la más utilizada [48]. Aunque esta vacuna fue eficaz para reducir los brotes y la incidencia del PRRS, también aumentó considerablemente la variación genética y la diversidad del virus y condujo a la recombinación viral entre los virus de la vacuna vivos y salvajes en el campo [49,50]. En los últimos años, la propagación y prevalencia del virus recombinante NADC30-como la cepa PRRSV han provocado múltiples brotes de síndrome respiratorio y reproductivo porcino en China. La similitud entre CHsx1401 y NADC30 utilizados en este estudio se mantuvo entre 92,2% y 99,1%. Desde entonces, se ha convertido en una cepa epidémica en China. Los exosomas, como mediadores de la comunicación celular, se encuentran ampliamente en diversos fluidos corporales y tienen ventajas únicas en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades [51,52]. Según informes anteriores, los exosomas desempeñan un papel de comunicación importante en la presentación de antígenos [53], la respuesta inmune [53,54], la replicación de virus [54], el cáncer [55], las enfermedades neurodegenerativas [56], la angiogénesis [57], las células tumorales. migración [58] e invasión [59], y tienen un alto valor de investigación.

En este estudio, se utilizó tecnología de secuenciación de alto rendimiento para construir el perfil de expresión de miARN de los exosomas séricos y se identificaron 33 miARN DE. Como todos sabemos, el miARN codificado por el huésped puede unirse al genoma viral y luego regular la replicación, síntesis y liberación del virus para limitar la infección y afectar el proceso patológico [15]. También se han informado repetidamente en animales estudios de miARN dirigidos al genoma viral. gga-miR-454 y gga-miR-130b en la bursitis infecciosa del pollo pueden atacar el genoma viral para inhibir la replicación viral, mientras que gga-miR-21 ataca directamente a la proteína viral VP1 para inhibir traducción de proteínas virales [60,61]. En estudios de PRRSV, ssc-miR-181 se une específicamente a una región altamente conservada aguas abajo del genoma viral ORF4 e inhibe fuertemente la replicación de PRRSV [62]. En este estudio, la diferencia de expresión de ssc-miR-181 entre los dos grupos no alcanzó un nivel significativo. En nuestro estudio, se compararon los genomas de nueve virus PRRSV diferentes con los de la cepa CHsx1401, y se identificaron los ocho segmentos más conservados. Se predijo que 31 miARN DE podrían unirse a los 8 segmentos más conservados de CHsx1401, y 16 miARN DE podrían unirse a las secuencias conservadas cercanas a las 30 UTR de CHsx1401. Entre ellos, 5 miARN DE (ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR-486 y ssc-miR{{ 36}}) puede unirse simultáneamente a CHsx1401 30 UTR. Además, se predijo que la expresión regulada positivamente de ssc-miR-223 se uniría al objetivo de 30 UTR del genoma de PRRSV. Los resultados mostraron que las secuencias conservadas del genoma del virus podrían desempeñar un papel clave en su patogenicidad, y los miARN que pueden unirse a las secuencias conservadas entre los genomas de diferentes cepas de PRRSV pueden tener una importancia importante en el control de la patogenicidad del virus. Estudios previos han demostrado que algunos miARN expresados ​​diferencialmente están relacionados con el PRRSV e incluso participan directamente en la regulación del PRRSV, incluidos ssc-miR-10b [63], ssc-miR-378 [30]. , ssc-miR-124a [64], sea-7f-5p [65], ssc-miR-744 [66] y ssc-miR{{57 }}a [67].

PRRSV puede evadir la defensa del huésped al interferir con la respuesta inmune innata. Este proceso está regulado por muchas vías de señalización, incluida la vía de señalización MAPK, la vía de señalización PI3K Akt, la autofagia, las quimiocinas y la vía de señalización TNF. En la actualidad, la vía de señalización MAPK incluye tres vías principales: ERK1/2, JNK y p38. La activación de la cascada MAPK puede promover la apoptosis de la célula huésped, ayudar al virus a escapar de la respuesta de defensa inmune del huésped y promover la replicación del PRRSV [68]. Además, la activación de las quinasas N-terminales (JNK) c-Jun y p38 también puede promover la liberación del factor inflamatorio IL-10 [68-70] y mejorar el efecto inflamatorio. Además de inducir la apoptosis, el PRRSV también puede inducir autofagia, lo que puede promover la replicación del PRRSV. La activación de PI3K/Akt es necesaria para la entrada del virus y la promoción de su replicación, y Akt activado por PRRSV inhibe la apoptosis de la célula huésped al regular negativamente la vía JNK [71]. TNF Puede desempeñar un papel importante en la inducción y regulación de la respuesta inflamatoria junto con otros factores inflamatorios, pero la expresión de TNF se ve afectada por la regulación negativa de la replicación de PRRSV [72]. En el presente estudio, los miARN (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p, etc.) enriquecidos en estas vías están involucrados en la apoptosis, la autofagia y la inflamación inducidas por PRRSV y están estrechamente asociados con la respuesta inmune viral, la evasión inmune y la replicación.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

La membrana plasmática celular es rica en una variedad de balsas lipídicas, y los esfingolípidos ricos en esfingolípidos y colesterol (esfingomielina y glicoesfingolípidos) son moléculas clave de las balsas lipídicas. El reconocimiento de lípidos por algunas proteínas del virus puede ser una condición necesaria para la entrada del virus [73]. Los virus de la envoltura insertan glicoproteínas de la envoltura viral en balsas lipídicas en la etapa de entrada del virus, interactúan con receptores ubicados en las balsas lipídicas o cambian de su estado natural a una forma activada para iniciar o promover la internalización/fusión viral, como el VHS, el coronavirus del SARS y virus de la diarrea epidémica de los lechones [73,74]. Estudios anteriores encontraron que la eliminación del colesterol de la superficie de las células MARC-145 reducía significativamente la infección por PRRSV, lo que demuestra que la inhibición de la infección por PRRSV estaba mediada específicamente por la eliminación del colesterol celular. El agotamiento del colesterol de la membrana celular inhibió significativamente la entrada del virus, particularmente la unión y liberación del virus [75]. El metabolismo de los esfingolípidos puede regular la estructura y la adhesión de la membrana, lo cual es de gran importancia en la invasión del virus PRRSV. La endocitosis fue el enriquecimiento más significativo en este estudio. La endocitosis es un mecanismo importante de captación de exosomas por parte de las células diana. Estudios anteriores han demostrado que la captación de exosomas es un proceso que requiere energía y depende del citoesqueleto, lo que resalta el papel potencial de la endocitosis en este proceso [76]. Se ha demostrado que varias vías pueden mediar en este proceso, incluidas la fagocitosis, la macropinocitosis, la clatrina, etc. [77,78], lo que condujo a diferentes clasificaciones y funciones de las sustancias endocitosadas. El enriquecimiento de miARN exosomales expresados ​​diferencialmente en esta vía indica que los exosomas desempeñan un papel importante en la infección por PRRSV, y la regulación del transporte y la absorción de contenido en los exosomas puede conducir a cambios fisiopatológicos en las células y órganos diana.

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5. Conclusiones

A través de la identificación y el análisis bioinformático de miARN exosomales séricos de cerdos infectados con PRRSV, en este estudio se obtuvieron una variedad de vías relacionadas con PRRSV y miARN expresados ​​diferencialmente, como ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}, sscmiR-320, ssc-miR-10b, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, etc., que desempeñan posibles roles funcionales en PRRSV -respuesta inmune inducida, invasión y captación de exosomas. Además, debido a que un solo miARN puede apuntar a múltiples genes y un solo gen también está regulado por múltiples miARN, varios miARN realizan múltiples funciones en las vías anteriores. Se ha verificado que algunos miARN regulan la infección por PRRSV actuando sobre receptores clave o dirigiéndose directamente al genoma del virus, como ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, let-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a, etc. Mientras tanto, el presente estudio también predijo una variedad de miARN que pueden unirse a el fragmento más conservado de las 30 UTR del genoma del virus CHX1401, que incluye ssc-miR-34c, ssc-miR-375, ssc-miR-378, ssc-miR{{34} } y ssc-miR-6529, que pueden ser importantes para regular la patogenicidad viral.

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