Resistencia temporal de los beneficios inducidos por el ejercicio sobre la memoria dependiente del hipocampo y la plasticidad sináptica en ratones hembra, parte 2

2.5. Preparación de cortes de hipocampo in vitro.

Poco después de la adquisición de OLM, los ratones se anestesiaron con isoflurano, se decapitaron y los cerebros se extrajeron rápidamente y se sumergieron en un medio de disección oxigenado y helado que contenía (en mM): 124 NaCl, 3 KCl, 1,25 KH 2 PO 4, 5 MgSO 4, 0 CaCl 2, 26NaHCO 3 y 10 glucosa.

Todos sabemos que la glucosa es la principal fuente de energía del cuerpo, pero ¿sabías que ayuda a mejorar la memoria?

La glucosa es excelente para la función cerebral porque la glucosa es el combustible principal del cerebro. Nuestros cerebros requieren un suministro constante de energía para realizar diversas tareas complejas como el pensamiento, la cognición y la memoria. A medida que aumentan nuestras actividades diarias, también aumentan las demandas de energía del cerebro, por lo que necesitamos consumir suficiente glucosa para mantener el cerebro funcionando.

Además, los estudios muestran que la glucosa puede mejorar la capacidad de memoria del cerebro. Al realizar tareas de memoria, el cerebro requiere grandes cantidades de glucosa para respaldar la comunicación y la transmisión de información entre una gran cantidad de neuronas. Si el suministro de glucosa es insuficiente, la función de memoria del cerebro se verá afectada. Por lo tanto, obtener suficiente glucosa es una de las claves para mantener una función cerebral saludable.

Existen muchas fuentes de glucosa, como cereales, frutas, verduras y carbohidratos de alta calidad. Sólo necesitamos consumir estos alimentos de forma razonable en nuestra dieta diaria para obtener suficiente glucosa, promoviendo así un desarrollo cerebral saludable.

En resumen, la glucosa es uno de los factores importantes para mantener la salud del cerebro y puede ayudarnos a registrar y recordar mejor la información. Por lo tanto, comer adecuadamente y consumir suficiente glucosa no sólo es bueno para el cuerpo, sino también extremadamente importante para el cerebro. Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria. Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, la carne también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Cortes coronales del hipocampo (340 μm) (n=11 (0–0–0), 6 (14–0–{ {12}}), se prepararon 10 (14–7–0), 8 (14–7–2) cortes de 6, 3, 5 y 5 ratones) utilizando un cortador de tejido vibratorio Leica (Modelo: VT1000S) antes de transferirlos a una grabación de interfaz que contiene líquido cefalorraquídeo (LCR) artificial precalentado de la siguiente composición (inmM): 124 NaCl, 3 KCl, 1,25, KH 2 PO 4, 1,5 MgSO 4, 2,5 CaCl 2, 26 NaHCO 3 y 10 glucosa y se mantiene a 31 ± 10C. Las rebanadas se perfundieron continuamente con esta solución a una velocidad de 1,75 a 2 ml/min mientras la superficie de las rebanadas se exponía a O2 al 95%/CO2 al 5% humidificado y tibio. Los registros comenzaron después de al menos 2 h de incubación.

Los potenciales postsinápticos excitadores de campo (fEPSP) se registraron a partir de dendritas apicales del estrato radiado de CA1b utilizando una sola pipeta de vidrio llena con NaCl 2 M (2–3 MΩ) en respuesta a la estimulación ortodrómica (alambre de nicrom retorcido, 65 μm de diámetro) de proyecciones comisurales colaterales de Schaffer en CA1c. estrato radiado. Los pulsos se administraron a 0.05 Hz usando una corriente que provocó una respuesta libre de picos máxima del 50 %. Después de establecer una línea de base estable de 10–20- minutos, se indujo la potenciación a largo plazo (LTP) mediante la administración de un solo episodio de 5 ráfagas 'theta', cada ráfaga constaba de cuatro pulsos a 100 Hz y las ráfagas mismas estaban separadas por 200 ms ( es decir, estimulación theta burst o TBS). La intensidad de la estimulación no aumentó durante el TBS.

Las cifras se presentan como media ± SEM. La pendiente de fEPSP se midió con una caída de la pendiente de 10–90 % y los datos de las figuras sobre LTP se normalizaron hasta los últimos 20 minutos de la línea base. Las medidas electrofisiológicas se analizaron utilizando un ANOVA unidireccional, a menos que se especifique lo contrario en el texto. y el nivel de significancia se fijó en p Menor o igual a 0,05.

2.6. RT-qPCR

El tejido del hipocampo dorsal se mantuvo congelado a -80 grados hasta su procesamiento. El ARN se aisló utilizando RNeasy Mini Kits (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y el ARN total (50 ng) se transcribió de forma inversa. La síntesis de ADNc se realizó utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Roche AppliedScience). Los cebadores se diseñaron utilizando la biblioteca de sondas universales de Roche; Todos los cebadores se obtuvieron de IDT y las sondas de la Roche Universal Probe Library y se utilizaron para la multiplexación en la máquina Roche Light-Cycle 480 II (Roche).

Para la transcripción del exón VI de bdnf y Hprt, diseñamos un ensayo PrimeTime qPCR (IDT) ya que no había ningún ensayo de la Biblioteca de sonda universal disponible. Se utilizaron los siguientes cebadores: bdnf exón I: cebador directo (5′–3′): GCATCTGTTGGGGAGACAAG, cebador inverso (5′–3′): TCACCTGGTG-GAACATTGTG, sonda 56, bdnfexon IV: cebador directo (5′–3′) : GCTGCCTTGATGTTTACTTTGA, cebador inverso (5′–3′): AAGGATGGT-CATCACTCTTCTCA, sonda 31, bdnf exonVI: cebador directo (5′–3′): CTGGGAGGCTTTGATGAGAC, cebador inverso (5′–3′): GCCTTCATG-CAACCGAAGTA, sonda: / 56-FAM/AGA CAG/Zen/AAGCGTGA-CAACAAT/3IABkFQ/; bdnf exón IX: cebador directo (5′–3 ′): GCCTTTGGAGCCTCTCTAC, cebador inverso (5′–3 ′): AAGGATGGTCATCACTCTTCTCA, sonda 31. Todas las sondas diana se conjugaron con el coloranteFAM.

Todos los valores se normalizaron a la expresión de Hprt, que utilizó los siguientes cebadores: cebador directo (5′–3′): TGCTCGAGATGTCATGAAGG, cebador inverso (5′–3′):CTTTTATGTCCCCCGTT-GAC, sonda: /5HEX/AT CAC ATT G/Zen /T GGC CCT CTGT/3IABkFQ/. La normalización de valores se ajusta a la expresión Hprt. Los datos y el análisis estadístico se realizan utilizando algoritmos propietarios de Roche y el software REST 2009 basado en el método Plaffl (Pfaffl, 2001; Pfaffl et al., 2002).

2.7. análisis estadístico

Los tamaños de muestra en este estudio fueron similares a los utilizados generalmente en el campo, incluidos los informados en publicaciones anteriores (por ejemplo, Butler et al., 2019; Keizer et al., 2021; Kwapis et al., 2018, 2020). ; López et al., 2019; Vogel-Ciernia et al., 2013) aunque no se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA de una vía (Figs. 1, 2D, 3B, 4, S1C – F, S2 C – F) o ANOVA de dos vías (Figs. 2A – C, S1A – B, S2 A – B) seguido de pruebas t corregidas por Tukey para comparar grupos individuales. Se realizaron comparaciones planificadas simples para evaluar las puntuaciones del índice de discriminación (DI) dentro del grupo para comparar el entrenamiento y probar el DI utilizando la prueba t de Student (Fig. 1D). El ANOVA bidireccional tenía factores de fase estral y condición de ejercicio (Fig. 2A – B), fase estral y día (Fig. 2C) o condición de ejercicio y día (Fig. S1 A – B, S2 A – B). Todas las estadísticas se realizaron con el software GraphPad Prism 8. Los principales efectos e interacciones de todos los ANOVA se describen en el texto. Todos los análisis fueron de dos colas y requirieron un valor de 0,05 para ser significativos. Las barras de error en todas las figuras representan SEM.

3. Resultados
3.1. El ejercicio permite la formación de memoria a largo plazo en condiciones de adquisición por debajo del umbral en ratones hembra

Anteriormente hemos demostrado que 14 días de ejercicio en ratones macho facilitan el aprendizaje en condiciones de adquisición por debajo del umbral de la tarea OLM que abolió los siguientes 7 días de retraso sedentario (Butler et al., 2019). Además, un ejercicio de reactivación de 2 días por debajo del umbral después de este período de retraso sedentario puede reactivar los beneficios iniciales del ejercicio de 14 días para inducir los beneficios en la cognición. A nivel molecular, el BDNF del hipocampo inducido por el ejercicio también disminuye significativamente de 7 a 14 días después del ejercicio y puede volver a facilitarse con una serie posterior de 2 días de carrera sobre ruedas (Berchtold et al., 2005, Berchtold et al., 2010). El paradigma de ejercicio que consiste en 14 días de ejercicio inicial, 7 días de retraso sedentario y 2 días de ejercicio reactivador parece capturar la dinámica temporal de los beneficios inducidos por el ejercicio en los hombres.

Es decir, el ejercicio inicial genera beneficios cognitivos, que, aunque quedan inactivos cuando cesa el ejercicio, pueden reactivarse mediante un ejercicio posterior de bajo nivel. Por lo tanto, examinamos si parámetros de ejercicio similares también activan y mantienen los beneficios cognitivos del ejercicio en las mujeres. Sometimos a ratones hembra a diferentes regímenes de ejercicio que consistían en un ejercicio inicial (14 días o 0 días) seguido de un retraso sedentario (7 días o 0 días) y un ejercicio de reactivación (2 días o 0 días). ) antes de la adquisición y prueba de OLM (Fig. 1A).

Para probar los efectos beneficiosos del ejercicio sobre el rendimiento de la memoria, los ratones recibieron una sesión de adquisición subumbral de 3-minutos durante la cual aprendieron las distintas ubicaciones (A1 y A2) de dos objetos idénticos. En ratones macho, esta duración del entrenamiento se ha demostrado como un subumbral para la codificación en animales sedentarios (Butler et al., 2019; Intlekofer et al., 2013; Malvaez et al., 2013; McQuown et al., 2011). El día de la prueba, uno de los objetos en las ubicaciones originales se movió a una ubicación nueva (A3) y se examinó el tiempo dedicado a explorar la ubicación de cada objeto. Dado que los ratones exhiben una preferencia innata por la novedad, la OLM a largo plazo se evidencia por una mayor exploración de la ubicación del objeto nuevo en comparación con el objeto en la ubicación fija.

Los parámetros del ejercicio afectaron el rendimiento de la memoria el día de la prueba (Fig. 1D; ANOVA unidireccional, Grupo F (3,27)=7.66, p=0.{{10}} 007), donde 14 días de ejercicio inicial (14–0–0) condujeron a un rendimiento sólido de la memoria a largo plazo en relación con el grupo de control sedentario ({{ 22}}–0–0) (Fig.1D Prueba post hoc de Tukey, p=0.003). Un retraso sedentario de 7- días resultó en una disminución del rendimiento en relación con el grupo de ejercicio inicial 14-0-0 (Fig. 1D Prueba post hoc de Tukey, p =0.007) y una diferencia no significativa con respecto al grupo de control. (0–0–0) (Fig. 1D Prueba post hoc de Tukey, p=0.985).

Para investigar si los beneficios del ejercicio inicial se mantienen durante el retraso sedentario, un grupo de animales fue sometido a 2 días de ejercicio de reactivación antes de la adquisición de OLM después de un retraso sedentario (14–7–2). Los ratones de la cohorte de ejercicio activador (14–7–2) mostraron puntuaciones DI significativamente más altas en comparación con ambos controles sedentarios (0–0–0) (Fig. 1D Prueba post hoc de Tukey, p.=0.019) y cohortes de retraso sedentario (14–7–0) (Fig. 1D Prueba post hoc de Tukey, p=0.043).

Las comparaciones dentro del grupo (Fig. 1D, significación indicada con el símbolo # dentro de las barras) de las puntuaciones DI del día de adquisición en comparación con el día de la prueba revelan puntuaciones DI mayores durante la prueba en comparación con el entrenamiento solo para los 14–0–{{4} } (t (12)=8.449, p=0.00{{20}}1) y 14–7–2 grupos (t (14)= 4.991, p=0.0002), pero no el 0–{{55 }}–0 (t (14)=1.871, p=0.082) o 14–7–0 grupos (t(14 ) {{30}}.844, p=0.086), lo que confirma aún más la formación exitosa de OLM a largo plazo solo en el ejercicio inicial (14–0–0) y el ejercicio de reactivación (14–7 –2) cohortes. El rendimiento de la prueba no se vio influenciado por las diferencias en el tiempo de exploración de objetos el día de la prueba (Fig. 1E; ANOVA unidireccional: F (3,27)=2.264, p=0.1038). Es importante destacar que cada grupo de ejercicio se habituó al contexto experimental, medido por una reducción significativa en la distancia recorrida y la velocidad media en las sesiones de habituación (Figura complementaria S1 A–B; habituación post hoctest de Tukey el día 1 frente a 6, p <0,05 para 0–0–0 , 14–7–0 y 14–7–2 grupos; p=0.07 para el grupo 14–0–0).

Durante la sesión de adquisición, los ratones de todos los grupos exhibieron puntuaciones de índice de discriminación (DI) relativamente bajas y similares, lo que indica una falta de preferencia por cualquiera de los objetos en el día de entrenamiento en las ubicaciones A1 y A2 (Fig. 1B; ANOVA unidireccional, DI: Grupo F ( 3,27) =2.604, p= 0.0724). La exploración general de objetos también fue similar entre los grupos (Fig. 1C; ANOVA unidireccional, DI: Grupo F (3,27)=1.243, p=0.3137), lo que indica que las preferencias o diferencias de objetos en exploración no contribuyen a las diferencias observadas en el rendimiento de la prueba. En conjunto, estos datos demuestran que 14 días de un ejercicio inicial mejora la formación de la memoria de ubicación de objetos en condiciones de adquisición subumbral en ratones hembra. Este efecto se mantiene durante todo el período de retraso sedentario y los beneficios se pueden recuperar con una segunda sesión de ejercicio estimulante.

3.2. La fase estral afecta la actividad voluntaria de rodar la rueda pero no el rendimiento de OLM

El ciclo estral de las hembras de roedores suele durar de 4 a 5 días, durante los cuales las hormonas reproductivas fluctúan naturalmente (Becker et al., 2017; Becker & Koob, 2016). De hecho, la actividad de correr varía a lo largo del ciclo estral, lo que sugiere el papel de las hormonas sexuales circulantes en la modulación de la actividad física de las roedoras hembra (Novak et al., 2012; Sherwin, 1998). Por lo tanto, comparamos la distancia de carrera en diferentes fases del ciclo estral para evaluar el papel del ciclo estral en el comportamiento de correr sobre ruedas.

En cuanto al aprendizaje y la memoria, si bien algunos estudios no informan ningún efecto de la fase estral en el desempeño conductual de las tareas de memoria espacial (Berry et al., 1997; Ter Horst et al., 2013; Keizer et al., 2017), otros han sugerido lo contrario (Cordeira et al., 2018; Hokenson et al., 2021; Milad et al., 2009; Pompili et al., 2010; Tuscher et al., 2015; Warren & Juraska, 1997; Trask et al.,2020), incluido el rendimiento mejorado de la tarea OLM durante la fase de proestro y estro (Frick & Berger-Sweeney, 2001; Frye et al., 2007; Paris & Frye, 2008; Pompili et al., 2010).

Por lo tanto, también comparamos el desempeño de OLM entre las etapas estrales durante la adquisición y los días de prueba para identificar cualquier efecto del ciclo estral en el desempeño de OLM dentro del grupo. Debido al bajo tamaño de la muestra, los ratones en las fases de proestro y estro se agruparon y los ratones en metestro y diestro se agruparon. colocados en otro grupo en el análisis del estro en adquisición y recuperación. En un análisis de la distancia de carrera, se graficó la carrera diaria con las fases estrales colapsadas debido al bajo tamaño de la muestra y se analizó con todas las fases separadas al evaluar la distancia media de carrera durante el período inicial de 14-día.

No se observó un efecto del estro en la distancia de carrera en las evaluaciones de la carrera diaria (Fig. 2A; ANOVA de dos vías, Fase F (1,63)=0.10, p=0.748; Fase × Día F (13,424) =0.66, p=0.798), pero se observó un efecto de la fase estral cuando se separaron las fases estrales y se evaluó la distancia media de carrera (Fig. 2B; unidireccional). ANOVA, Fase F(3,511)=2.88, p=0.035), donde las hembras en estro corrieron significativamente más que las hembras en diestro (Fig. Prueba post hoc de Tukey, p=0 .034), pero no las fases de proestro (p=0.133) o metestro (p=0.949).

Fase estral en el entrenamiento (Fig. 2C; ANOVA de dos vías, FaseF (1,23)=0.11, p=0.738; Fase × Grupo de ejercicio F (3,23) {{10 }}.70, p=0.559) o día de la prueba (Fig. 2D; ANOVA de dos vías, Fase F (1,23)=1.79, p=0.193 ; Fase × Grupo de ejercicios F(3,23)=0.20, p=0.894) no afectó el rendimiento. En conjunto, nuestros datos indican que, en línea con otros informes sobre el estro y la distancia de carrera, los ratones en estro dan como resultado una mayor distancia de carrera general.

3.3. La LTP del hipocampo mejorada con ejercicio se mantiene durante la inactividad

Como se muestra arriba, nuestros paradigmas de ejercicio facilitan la OLM a largo plazo después de 14 días de ejercicio y 2 días de ejercicio de reactivación. Por lo tanto, nos preguntamos si la plasticidad sináptica del hipocampo también mejoró después del aprendizaje facilitado por el ejercicio en estos mismos animales (Fig. 1A). Se recolectaron y procesaron cortes agudos de hipocampo para medir los registros de potenciales postsinápticos excitadores de campo (fEPSP) del estrato radiado del CA1b en respuesta a la estimulación de las proyecciones comisurales colaterales de Schaffer en el estrato radiado de CA1c.

Para examinar los cambios en la plasticidad sináptica después del aprendizaje, aplicamos un tren único de estimulación de ráfaga 5 theta (TBS) para inducir la potenciación a largo plazo (LTP) en cortes recolectados durante la ventana de consolidación de la memoria, 1 h después de la adquisición de OLM. Se ha informado previamente que esta forma de estimulación dependiente de BDNF induce una potenciación estable en ratones (Acharya et al., 2019; Keizer et al., 2021; Kramár et al., 2004; Kwapis et al., 2018; Vogel-Ciernia et al., 2013; White et al., 2016). Veinte minutos después del TBS, la pendiente fEPSP comienza a estabilizarse a medida que LTP entra en la fase de consolidación, durante la cual ocurren eventos dinámicos sinápticos para mantener la fuerza sináptica a largo plazo (G. Lynch, 1998).

En cortes preparados de todos los ratones, TBS produjo una potenciación robusta inmediata que decayó y luego se estabilizó durante los siguientes 20 min (Fig. 3A). Se observó una LTP estable, medida 50–60 minpost-TBS, en condiciones de ejercicio (Fig. 3B; ANOVA F unidireccional (3,31) =9.32, p=0.0002) donde todos los grupos que se sometieron a ejercicio mostraron un aumento en la potenciación media en relación con el control sedentario (14–0–0: p=0.003, 14–7–0: p {{21} }.0002, 14–7–2: p=0.033), lo que indica una plasticidad sináptica mejorada. Para examinar si este fortalecimiento sináptico se debió a cambios en la función neuronal basal dentro del hipocampo, generamos curvas de entrada/salida y medimos cambios en la facilitación de pulsos pareados.

No hubo diferencias significativas entre los grupos en la pendiente de las curvas para las respuestas de pendiente de fEPSP en relación con la magnitud de la volea de fibra (Fig. 3C; ANOVA unidireccional F (3,31)=0.35, p= 0. 79) o facilitación de pulsos emparejados (Fig. 3D; ANOVA de dos vías, grupo: F (3,31)=1.49, p =0.24, interacción: F (6,62) 1,70, p= 0.13). En conjunto, estos datos sugieren que un período de ejercicio inicial mejora la plasticidad sináptica del hipocampo que persiste incluso después de suspender el ejercicio y después de una sesión de ejercicio de reactivación sin alterar las funciones neuronales basales. Vale la pena señalar que esta mejora duradera de la LTP del hipocampo es inconsistente con la disminución del rendimiento de OLM observada después del retraso sedentario, que abordamos en la discusión.

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