Los efectos beneficiosos del verbascósido de la hierba Cistanche
Mar 08, 2022
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Verbascoside protege a los ratones de la gangrena gaseosa clostridial al inhibir la actividad de la toxina alfa y la perfringolisina O
La gangrena gaseosa, causada principalmente por la bacteria anaeróbica Clostridium perfringens (C. perfringens), provoca la muerte dentro de las 48 h posteriores al inicio. Las estrategias terapéuticas disponibles son limitadas y se asocia con una mortalidad extremadamente alta. Tanto la toxina alfa (CPA) como la perfringolisina O (PFO) de C. perfringens son factores de virulencia importantes en el desarrollo de la gangrena gaseosa, lo que sugiere que son dianas terapéuticas. Aquí encontramos queverbascoside, a glucósido fenilpropanoideampliamente distribuido en Hierbas medicinales chinas Cistanche, podría inhibir eficazmente la actividad biológica tanto de CPA como de PFO en ensayos hemolíticos.
La oligomerización de PFO fue notablemente inhibida por verbascoside. Aunque no se observó actividad antibacteriana,verbascosideel tratamiento protegió a las células Caco-2 del daño causado por CPA y PFO. Además, los ratones infectados tratados converbascosidemostró significativamentedaño aliviado, carga bacteriana reducida, ydisminución de la mortalidad. En resumen,verbascoside tiene un efecto terapéutico eficaz contra la virulencia de C. perfringens tanto in vitro como in vivoapuntando simultáneamente a CPA y PFO. Nuestros resultados proporcionan una estrategia prometedora y un posible compuesto principal para las infecciones por C. perfringens, especialmente la gangrena gaseosa.
Palabras clave: alfa-toxina, antiinfeccioso, Clostridium perfringens, gangrena gaseosa, perfringolisina O, verbascósido
Clostridium perfringens (C. perfringens) es una bacteria anaeróbica grampositiva que se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza y en el intestino humano (Fraser y Collee, 1975). C. perfringens puede secretar cuatro toxinas principales ( , , ε y Ì) y, en consecuencia, se divide en cinco serotipos, A–E (Titball, 2005). En los humanos, C. perfringens puede causar una variedad de enfermedades, como intoxicación alimentaria y gangrena gaseosa, la última de las cuales también puede ocurrir en animales, como gatos, vacas, perros, ovejas, caballos y cabras (Verherstraeten et al. , 2015). El período de incubación de la gangrena gaseosa es breve y la infección puede establecerse en 6 a 8 h (Uzal et al., 2015). Más grave aún, más del 50 por ciento de las personas infectadas continuarán desarrollando toxemia sistémica, lo que eventualmente conducirá a la muerte; por lo tanto, sin la administración oportuna y eficaz del tratamiento, la gangrena gaseosa puede generar graves pérdidas económicas (Low et al., 2018). Sin embargo, los tratamientos habituales, como el tratamiento con antibióticos y el tratamiento quirúrgico para la gangrena gaseosa, tienen ciertas desventajas que incluyen, entre otras, la resistencia a los antibióticos y la amputación de los pacientes (Park et al., 2010; Osman y Elhariri, 2013). Por lo tanto, es necesario encontrar nuevos métodos o ideas para el tratamiento de la gangrena gaseosa.
La gangrena gaseosa por clostridios es la enfermedad infecciosa fulminante causada principalmente por la interacción de una toxina de C. perfringens (CPA) y la perfringolisina O (PFO) (Hifumi et al., 2018). La CPA, perteneciente a la familia de enzimas bacterianas zinc-metalo fosfolipasa, es producida por todos los C. perfringens, está codificada por los cromosomas, es una toxina importante en C. perfringens y exhibe actividades tanto de fosfolipasa C como de esfingomielinasa (van Bunderen et al. , 2010; Masataka et al., 2015). En la década de 1990, Awad et al. (1995) utilizaron mutantes de CPA para probar un modelo de ratón con gangrena gaseosa y descubrieron que las cepas que carecían del gen CPA mostraban una menor patogenicidad y menos daño tisular después de la infección. Este trabajo confirmó que el CPA es la principal toxina en la gangrena gaseosa. En 2000, Alberto realizó estudios en profundidad mediante la construcción de un modelo molecular de toxina a y mutantes de tres bucles en el dominio C-terminal, y la actividad hemolítica y la citotoxicidad de los mutantes se redujeron en comparación con las del tipo salvaje. Se demostró que la actividad de esfingomielinasa y el dominio C-terminal son necesarios para la miotoxicidad in vivo (Alape-Giron et al., 2000). El PFO, una citolisina dependiente del colesterol (CDC), interactúa con la membrana celular como un monómero y el complejo preparado se inserta luego en la bicapa de la membrana mediante oligomerización, finalmente lisando las células huésped (Johnson y Heuck, 2014). Aunque el PFO no es necesario para la letalidad, puede causar citotoxicidad de macrófagos en las primeras etapas de la mionecrosis y es importante para la formación de trombos en las últimas etapas de la infección, lo que contribuye a la patogenia de la gangrena gaseosa (Verherstraeten et al., 2015). El CPA puede combinarse con el PFO para dañar los neutrófilos acumulados en el sitio infectado e inducir disfunción de las células endoteliales, edema e isquemia, lo que finalmente conduce a la hipoxia tisular y proporciona un entorno anaeróbico favorable para el crecimiento y la reproducción de C. perfringens (Bryant y Stevens, 1996). ). Por lo tanto, este estudio se enfoca en CPA y PFO y tiene como objetivo revelar un nuevo método para tratar la gangrena gaseosa.
En este estudio, se seleccionaron dos inhibidores de toxinas de 17 compuestos naturales mediante hemólisis para encontrar un posible inhibidor de la gangrena gaseosa. Los datos hemolíticos para varios compuestos se muestran en la Tabla 1. Entre los 17 tipos de compuestos naturales, el verbascósido tiene el mejor efecto inhibitorio sobre ambas toxinas y, por lo tanto, seleccionamos el verbascósido como el compuesto objetivo para este estudio. El verbascoside está ampliamente distribuido en varias hierbas medicinales chinas, como la cistanche, y se aisló y extrajo deVerbascosidepor un científico italiano en 1963 (Speranza et al., 2010; Zhu et al., 2016). Los estudios han demostrado queverbascoside tiene muchos efectos biológicos y farmacológicos, comopropiedades antiinflamatorias, antioxidantes, antibacterianas, antitumorales, antifúngicas y quelantes, yse puede utilizar en cosméticos para la pielypreparaciones tópicas.Otros informes han demostrado que el verbascósido se puede absorber por completo en 1 h y alcanzar una alta concentración en sangre y que su biodisponibilidad en el momento de la administración a través de varios métodos de inyección no supera el 25 % (Dai et al., 2017; Feng et al., 2018). Con base en las actividades farmacológicas antes mencionadas, este estudio encontró y estudió la inhibiciónefectos del verbascósidosobre la gangrena gaseosa a través de una serie de experimentos in vitro e in vivo.
Verbascoside inhibió la actividad hemolítica de PFO y CPA
Se ha informado que algunos flavonoides son inhibidores efectivos contra las toxinas que forman poros (Li et al., 2013; Wang et al., 2017; Zhou et al., 2017). Aquí, se encontró que el verbascoside, un fenilpropanoide, inhibía la actividad hemolítica de las toxinas PFO y CPA secretadas por C. perfringens. Cuando las concentraciones de verbascósido oscilaron entre 2 y 32 µg/mL, el tratamiento con verbascósido inhibió significativamente la actividad hemolítica de estas toxinas de manera dependiente de la dosis, lo que indica que el verbascósido es un inhibidor eficaz tanto del PFO como del CPA.
Verbascoside no afecta el crecimiento de C. perfringens
We further performed MIC and bacterial growth curve studies to determine the antibacterial activity of verbascoside against C. perfringens, revealing a MIC assay result (Figure 2A) >256 |ig/mL. De manera similar, los resultados de la curva de crecimiento bacteriano (Figura 2B) indican que el verbascósido no afecta el crecimiento normal de las bacterias. Juntos, nuestros resultados indican que el tratamiento con verbascósido no tiene influencia en la viabilidad de C. perfringens en las concentraciones requeridas para la inhibición de la actividad de PFO y CPA.
Verbascoside protege las células del daño inducido por PFO o CPA
La toxina alfa de Clostridium perfringens y el PFO en C. perfringens son las principales toxinas que causan la gangrena gaseosa; por lo tanto, también se examinó si el verbascósido podría proteger a las células de estas dos toxinas. En primer lugar, realizamos una prueba de citotoxicidad con el fármaco verbascósido, que no dañó las células (Figura 3A). Luego, este compuesto se agregó al sistema de cocultivo de células y PFO o CPA. Verbascoside inhibió la citotoxicidad de estas dos toxinasen Caco{{0}} celdas. En comparación con las muestras no tratadas con verbascósido, el daño inducido por las toxinas en las células Caco-2 tratadas con verbascósido a 0,5 µg/mL se redujo significativamente de forma dependiente de la dosis. Especialmente para la proteína PFO, las células se protegieron eficazmente a una concentración de fármaco de 0,25 ug/mL (P < 0,05).="" se="" empleó="" además="" un="" ensayo="" de="" viabilidad/muerte="" celular="" posterior="" (figuras="" 3d-k)="" para="" probar="" este="" efecto="" protector.="" como="" era="" de="" esperar,="" el="" tratamiento="" con="" verbascósido="" protegió="" visiblemente="" contra="" la="" lesión="" celular="" inducida="" por="" pfo="" o="" cpa.="" tomados="" en="" conjunto,="" nuestros="" resultados="" establecieron="" que="" el="" verbascósido="" inhibe="" significativamente="" el="" daño="" celular="" inducido="" por="" pfo="" o="" cpa="" de="" manera="" dependiente="" de="" la="">
Verbascoside inhibe la actividad hemolítica del PFO al disminuir su oligomerización
La actividad hemolítica del PFO debe ir acompañada de la ocurrencia de oligomerización y formación de poros (Johnson y Heuck, 2014). Aquí, la oligomerización de PFO fue inducida por KCl y sangre de conejo, y se detectó la oligomerización de PFO (Figura 4), lo que reveló una disminución de la intensidad de la banda de oligomerización cuando se incrementó la concentración de verbascósido. Juntos, nuestros resultados sugieren que el tratamiento con verbascósido inhibe la oligomerización de PFO y, por lo tanto, reduce la actividad hemolítica de esta toxina.
Verbascoside protege a los ratones de la infección por C. perfringens
Se estableció un modelo de gangrena en el músculo de la pata de un ratón para determinar si la protección observada in vitro también podía observarse in vivo. Las patas de los ratones infectados con ATCC13124-fueron En contraste, la cantidad de células inflamatorias en el grupo del fármaco se redujo significativamente y el tejido permaneció intacto después del tratamiento con verbascósido. Además, el número de bacterias colonizadas en los músculos de las piernas se redujo significativamente después del tratamiento con verbascoside. Como se muestra en los resultados del experimento, el 93,33 por ciento de los ratones infectados murió 32 h después de la infección. Como se esperaba, la tasa de supervivencia de los ratones que recibieron verbascósido aumentó en un 33,33 %, ya que solo murió el 60 % de los ratones infectados (P=00,015 mediante una prueba de rango logarítmico). Además, el tratamiento con verbascósido retrasó el pico del período de muerte en casi 8 h (de 32 h para los ratones infectados con ATCC 13124-a 40 h para los ratones tratados con verbascósido) y, por lo tanto, podría extender el valioso tiempo requerido para el rescate clínico. En conjunto, nuestros resultados indicaron que en ratones, el verbascósido puede brindar una protección sistemáticamente efectiva contra la gangrena gaseosa causada por C. perfringens.
Como bacteria anaeróbica grampositiva, C. perfringens está ampliamente distribuida en la naturaleza y puede secretar una variedad de toxinas, que pueden conducir a una variedad de enfermedades en humanos y animales, incluida la gangrena gaseosa (Fraser y Collee, 1975; Verherstraeten et al. ., 2015). La gangrena gaseosa es causada principalmente por la combinación de toxinas a y theta secretadas por C. perfringens, lo que puede conducir a la muerte de los animales infectados, lo que resulta en grandes pérdidas económicas. Sin embargo, hasta la fecha, los métodos efectivos para tratar la gangrena gaseosa incluyen oxígeno hiperbárico, cirugía y antibióticos. Entre ellos, la cirugía puede causar daños físicos sustanciales a los pacientes y tener un impacto muy inconveniente en la vida posoperatoria. Se han encontrado numerosos genes de resistencia a la tetraciclina en aislamientos de C. perfringens de Suecia, Noruega, Dinamarca y otros lugares. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias o agentes para combatir esta infección bacteriana (Park et al., 2010; Osman y Elhariri, 2013). En este estudio, el verbascósido fenilpropanoide, que difiere de los tratamientos antibacterianos tradicionales (antibióticos), podría inhibir la actividad hemolítica tanto de CPA como de PFO, dos importantes toxinas formadoras de poros que contribuyen de manera crítica a la patogenicidad de C. perfringens. A nivel celular, el verbascósido también podría proteger eficazmente a las células Caco-2 de estas dos toxinas en concentraciones bajas (0,25-2 ig/mL). En particular, el verbascósido podría reducir las actividades de las toxinas al inhibir la oligomerización de PFO. Estos resultados podrían proporcionar suficientes datos básicos para la investigación in vivo.
