Cómo las proteínas de reparación de la membrana celular regulan la transducción de señales del factor de transcripción para controlar la fibrosis renal

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Riñónla fibrosis se asocia con la progresión de lariñóndaño a la enfermedad renal crónica. Se ha demostrado que MG53, una proteína reparadora de la membrana celular, protege contra la lesión de las células epiteliales renales y la lesión renal aguda. Aquí, evaluamos el papel de MG53 en la modulación deriñónfibrosis en ratones envejecidos y en ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO), un modelo conocido de fibrosis renal progresiva. Los ratones con ablación de MG53 desarrollaron más fibrosis intersticial con la edad que los ratones MG53-intactos de la misma edad. Del mismo modo, en ausencia de MG53,riñónla fibrosis fue exagerada en comparación con ratones con MG53 intacto en el riñón obstruido en comparación con el riñón contralateral no obstruido o los riñones de ratones con operación simulada. El ureteral obstruidoriñonesde ratones deficientes en MG53 también mostraron significativamente más inflamación que los riñones ureterales obstruidos de ratones intactos en MG53. Los experimentos in vitro demostraron que MG53 podría entrar en los núcleos de las células epiteliales tubulares proximales e interactuar directamente con el componente p65 del factor de transcripción NF-kB, lo que proporciona una posible explicación del aumento de la inflamación en ausencia de MG53. Para probar esto, se administró expresión mejorada de MG53 a través de células modificadas o administración directa de proteína recombinante a ratones sujetos a UUO. Esto redujo la activación e inflamación de NF-kB y atenuó la fibrosis renal. Por lo tanto, MG53 puede tener un papel terapéutico en el tratamiento de la inflamación renal crónica y, por lo tanto, brindar protección contrafibrosisque conduce al fenotipo de enfermedad renal crónica.

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Declaración traslacional La inflamación crónica conduce a la remodelación fibrótica que también puede ser la base de la transición de la lesión renal aguda a la enfermedad renal crónica. La activación de la proteína factor de transcripción inflamatorio factor nuclear-kB (NF-kB) está involucrada en la patogénesis de la inflamación renal. Aquí, proporcionamos evidencia de que MG53, una proteína de reparación de membrana celular previamente identificada, interactúa directamente con NF-kB y reduce su actividad transcripcional. Al mismo tiempo, la administración exógena de MG53 puede disminuir la remodelación fibrótica del riñón inflamado. Estos hallazgos apuntan a una interacción protectora entre MG53 y NF-kB para atenuar el desarrollo de fibrosis renal mediada por inflamación. La administración farmacológica de MG53 podría ser un enfoque prometedor para el tratamiento de la fibrosis renal progresiva.

La disfunción renal, que se puede clasificar como lesión renal aguda (AKI) o enfermedad renal crónica (CKD), se ha convertido en una epidemia en las poblaciones de mayor edad. En 2017, la prevalencia de la ERC alcanzó el 14,5 % de las personas de 65 años o más, lo que resultó en gastos de Medicare de más de $84 mil millones para el tratamiento.^1,2AKI y CKD son más comunes en personas mayores, principalmente debido a una mayor susceptibilidad a las lesiones además de una capacidad disminuida para reparar el riñón envejecido. Los estudios clínicos han demostrado que la ERC es un factor de riesgo importante para la AKI y, por el contrario, los episodios de AKI pueden acelerar la progresión de la ERC hacia la enfermedad renal en etapa terminal. Actualmente, el tratamiento de la LRA es principalmente de apoyo, y el tratamiento de la ERC establecida se centra en ralentizar la progresión a través de la inhibición del sistema renina-angiotensina-aldosterona y ahora posiblemente a través de la inhibición del cotransportador de sodio-glucosa-2.^3,4

Dependiendo de la gravedad de la lesión, las células tubulares proximales, el objetivo principal de la lesión aguda, pueden sufrir cambios en la progresión del ciclo celular,5,6 metabolismo,7 secreción de citoquinas profibróticas e inflamatorias de proteínas, o transición epitelial-mesenquimatosa parcial,8 lo que determinará si la remodelación/reparación será exitosa o desadaptativa y resultará en fibrosis renal, un sello distintivo de la ERC.9,10 Esta remodelación generalmente ocurre en un contexto de inflamación renal,

suministro vascular disminuido y la producción de proteínas de matriz extracelular (ECM) e incluye pérdida de células epiteliales y acumulación de colágenos, actina de músculo liso α y fibronectina; también tiene una alta correlación con el deterioro de la función renal.

La inflamación crónica conduce a una remodelación fibrótica que también puede ser la base de la transición de AKI a CKD.11–13 La investigación acumulativa sugiere la participación del factor de transcripción del factor nuclear-kB (NF-kB) en la patogenia de la inflamación renal causada por infección, lesión, o trasplante.11,12,14 La activación de la vía canónica de NF-kB comienza con la activación del inhibidor de la cinasa de NF-kB (IkB), que conduce a la fosforilación y degradación de IkBa y la translocación nuclear de los heterodímeros de NF-kB.15 La activación de la señalización de NF-kB en las células epiteliales renales y las células inmunes infiltrantes puede ser provocada por desencadenantes fisiopatológicos como la exposición a lipopolisacáridos (LPS) o lesión por isquemia-reperfusión.16 Los estudios de perfiles moleculares revelan que nfkb1 es un factor importante de la fibrosis renal.¹⁷Además de las células tubulares renales, las células inmunitarias innatas, como los macrófagos y las células dendríticas, también contribuyen a la lesión renal, la inflamación y la remodelación fibrótica.^13,18–20

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La creciente evidencia sugiere que los factores secretores derivados del músculo (es decir, las miocinas) modulan la fisiología sistémica a través de la diafonía tisular para influir en la progresión de las enfermedades renales.²¹MG53 (también llamado TRIM72) es una proteína con motivo tripartito enriquecido en músculo (TRIM) con una función crítica en la reparación de la membrana celular.22,23 Las proteínas de la familia TRIM tienen diversas funciones que van desde la regulación de la señalización inmunitaria hasta la reparación de tejidos.²⁴La reparación de la membrana mediada por MG53-participa en la mitigación de la lesión aguda del músculo esquelético,²⁵riñones,²⁶corazón,²⁷ pulmones, 28 cerebros,^29,30y piel³¹Nuestros estudios anteriores identificaron un nivel bajo de expresión de MG53 en el riñón, que es un componente clave en la protección contra la LRA, y los ratones deficientes en MG53 (mg53 / ) eran más susceptibles a la LRA inducida por estrés.²⁶También demostramos recientemente que la elevación sostenida de MG53 en la circulación mejora la reparación y regeneración de la lesión tisular. 32 Todavía se desconocen los roles relativos de MG53 circulante extrínseco y específico del riñón en la modulación de la fibrosis renal durante la ERC progresiva.

Recientemente, ha evolucionado un papel emergente de MG53 en la modulación de la protección tisular a través de la inhibición de la inflamación, especialmente a través de la modulación de la señalización de NF-kB. Por ejemplo, MG53 atenúa la neurotoxicidad y la neuroinflamación inducidas por LPS al inhibir la vía TLR4/NF-kB,33 y el MG53 cardíaco regula la expresión de KChIP2 para controlar la remodelación electrofisiológica durante la hipertrofia cardiovascular.34 Además, demostramos una función dual de MG53 en prevenir una respuesta hiperinflamatoria desadaptativa durante una infección subletal por el virus de la influenza A, caracterizada por una producción excesiva de interferón-b, a través de la supresión de la activación de IRF3/NF-kB y la inhibición de la señalización aberrante de Ca2+ intracelular en los macrófagos.35 Además, con una dosis letal de influenza A infección por el virus, se demostró que MG53 previene la mortalidad y el daño pulmonar, no al afectar directamente los títulos virales en sí, sino al mitigar la tormenta de citocinas (interferón-b, interleucina-6 e interleucina-1b) a través de la regulación negativa del inflamasoma NLRP3 y la prevención de la piroptosis del pulmón.36 Además, el tratamiento crónico en dosis altas de MG53 exógeno se relacionó con la supresión – inflamación mediada en el corazón envejecido.37 Estos estudios sugieren que MG53 puede modular la señalización aberrante de NF-kB durante la inflamación, pero no se ha estudiado si esto ocurre en el contexto de la inflamación renal.

Postulamos que MG53 regula la inflamación renal al modular la actividad transcripcional de NF-kB y, al hacerlo, puede atenuar la fibrosis renal que se produce como consecuencia de la inflamación crónica. Este estudio se llevó a cabo para abordar esta hipótesis.

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MÉTODOS

estudios con animales

Todos los experimentos con animales se adhirieron a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y siguieron los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio. Tipo salvaje emparejado por edad (WT) o mg53^-/-Se usaron22 no hermanos de camada de la cepa 129S1/SvImJ para establecer el papel de MG53 en la modulación de la fibrosis renal inducida por obstrucción ureteral unilateral (UUO) y dependiente de la edad. Se compraron ratones C57B6/J (9–10 semanas) de Jackson Labs.

Para los estudios de lesión renal, los ratones (9 a 12 semanas) se sometieron a UUO para inducir fibrosis renal. Los ratones se anestesiaron con isoflurano (1,5 por ciento -2, 0 por ciento) para garantizar un plano profundo de anestesia. El procedimiento UUO se realizó ligando el uréter izquierdo con seda quirúrgica 5-0 dos veces de acuerdo con los protocolos publicados.38 A los ratones simulados solo se les hizo una incisión en la piel abdominal. Para evaluar el efecto de rhMG53 en la lesión renal obstructiva, 1 grupo de ratones UUO recibió rhMG53 (2 mg/kg) a través de una inyección en la vena de la cola inmediatamente después de la cirugía UUO (día 0) y luego diariamente durante 7 días, con 2 dosis adicionales los días 9 y 11. Un grupo de control de ratones UUO recibió inyecciones de solución salina de acuerdo con el mismo programa. Los ratones se sacrificaron el día 12 después de la cirugía UUO, los riñones se perfundieron in situ con solución salina tamponada con fosfato y se recolectaron muestras de tejido del riñón UUO y el riñón contralateral para histología y análisis de transferencia Western.

En estudios separados, WT y mg53^-/-los ratones se sometieron a UUO o cirugía simulada y se sacrificaron el día 7 después de la operación. Se administró MG53 a ratones utilizando un enfoque de terapia basada en células.39 Los macrófagos RAW 264.7 se infectaron con partículas virales de cereza Ad tPA-MG53-dependientes de doxiciclina (DOX) durante 24 horas. Las células infectadas (a una concentración de {{10}}/100 ml de solución salina por ratón) se inyectaron en la vena de la cola de los ratones inmediatamente después de la cirugía (inyección del día 0). Los ratones recibieron 4 inyecciones de células RAW transducidas con Ad-tPA-MG53 los días 0, 1, 3 y 6. Inmediatamente después de la inyección de células del día 0, los ratones se aleatorizaron en un grupo que recibió y otro que no recibió DOX (2 mg/ml en una solución de sacarosa al 5 por ciento) en su agua potable durante 7 días y luego los sacrificaron. Se recogieron muestras de tejido del riñón UUO y del riñón contralateral para análisis histológicos, de ARN y de proteínas.

Análisis estadísticos Los datos se expresan como medias -DE. Se realizó una comparación dentro de los grupos utilizando la prueba t de Student al comparar 2 investigación básica experimental H Li et al.: MG53 modula NF-kB en fibrosis renal 2 Kidney International (2021) -, -–-groups y análisis 1-way de varianza para más de 2 grupos (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) seguido de la prueba ad hoc de comparación múltiple de Bonferroni o Holm-Sidak. Un valor de P < 0,05="" se="" consideró="" estadísticamente="">

Métodos complementarios Métodos completos que incluyen evaluación histológica, mediciones de creatinina sérica, construcciones de plásmidos, cultivo celular y aislamiento de células epiteliales tubulares primarias, preparación de adenovirus e infección celular, ensayo de translocación nuclear NF kB p65, inmunohistoquímica e imágenes confocales, ensayo indicador de luciferasa NF-kB, citocina El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, el fraccionamiento de tejidos, la inmunotransferencia, la coinmunoprecipitación, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (Tabla complementaria S1) y la producción de rhMG53 se encuentran en los Métodos complementarios.

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RESULTADOS

Los ratones con ablación de MG53 desarrollan fibrosis renal dependiente de la edad

Comparamos el efecto del envejecimiento sobre la función renal y la fibrosis en mg53^-/-y ratones WT. Confirmamos nuestra observación anterior de que, aunque los niveles de creatinina sérica de ratones jóvenes (2 meses) con y sin MG53 no fueron significativamente diferentes, los mayores (16–20 meses) mg53-/-los ratones exhibieron una creatinina sérica significativamente más alta que los controles WT de la misma edad (Figura 1a). Con base en la tinción tricrómica, encontramos que mg53-/-los ratones tenían más fibrosis renal en comparación con los ratones WT, comenzando a la edad de 5 meses y continuando hasta los 20 meses (Figura 1b y c). La tinción inmunohistoquímica se utilizó para evaluar el impacto de la ablación de MG53 en la infiltración de leucocitos, monocitos y macrófagos en riñones de ratón de 2-meses y 5-meses de edad (Figura 1d y e). Los riñones de ratones jóvenes WT y mg53-/- tenían niveles similares de leucocitos intrarrenales, pero se encontraron significativamente más células inflamatorias en mg53/riñones que en riñones WT en ratones de 5-meses de edad.

Además, la inmunohistoquímica para la actina del músculo liso y la fibronectina, 2 proteínas de la matriz extracelular que se encuentran comúnmente en áreas de fibrosis renal, mostró una tinción mejorada (3- a 8-veces) en los glomérulos y tubulointersticio de los riñones de { Ratones mg53-/- de {4}}mes de edad en comparación con ratones WT de 10-meses de edad (Figura complementaria S1).

UUO induce inflamación renal agravada y fibrosis en mg53-/- ratones Los niveles de MG53 en riñón detectados por inmunotransferencia aumentaron significativamente 7 días después de UUO (Figura 2a). Los riñones mg53- /- UUO mostraron una fibrosis exagerada, con un 30 por ciento más de área teñida con tricrómico, que los riñones WT UUO (Figura 2b).

MG53 modula la activación de NF-kB y la localización nuclear de p65

La actividad de NF-kB (p65) se evaluó en el modelo UUO. El número total de p65 (t-p65) aumentó significativamente en riñones UUO de ratones WT y mg53/, pero la activación de NF-kB, evaluada como fosforilación de p65, fue mayor (16-veces) en mg53/UUO riñón que el riñón WT UUO (2-veces) en comparación con animales operados de forma simulada (Figura 3a). Analizamos los niveles relativos de ARN del factor de crecimiento transformante b1 (TGF-b1), el inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) y el colágeno tipo I alfa 1 (Col1a1) en el riñón obstruido.40 detectó niveles bajos de expresión génica en animales simulados e inducción similar (TGF-b1, w10 veces; PAI-1, w40 veces; Col1a1, w40 veces) en el riñón UUO de WT y mg53 / (Figura 3b). Para examinar la distribución espacial de MG53 en la corteza renal en condiciones normales, se analizaron fracciones de tejido renal. Regularmente obtuvimos 10-veces más proteína total del citosol que la proteína nuclear total extraída. Los niveles de t-p65 fueron comparables en la fracción citosólica entre ratones WT y mg53-/- pero fueron mayores en la fracción nuclear de mg53-/- ratones (Figura 3c). Se detectó MG53 en la fracción de citosol (con tubulina como marcador de citosol). Inesperadamente, se detectó una cantidad significativa de MG53 en la fracción nuclear (con la histona H3 como marcador de fracción nuclear).

Para confirmar este hallazgo, también examinamos la localización de MG53 en fracciones de músculo esquelético (Figura complementaria S2). Reproducimos nuestros estudios previos en los que MG53 se localizó en el citosol y la membrana del sarcolema (trifosfatasa de adenosina de sodio y potasio como marcador de la fracción de membrana)22,23,25 pero también detectamos MG53 nuclear enriquecido del músculo esquelético.

MG53 interactúa con p65 para controlar la actividad transcripcional inducida por el factor de necrosis tumoral-a– Para confirmar nuestros resultados de fraccionamiento de tejido, llevamos a cabo los siguientes estudios inmunohistoquímicos. En células epiteliales tubulares proximales WT cultivadas, p65 se encontró principalmente en el citosol pero se localizó en los núcleos en ausencia de MG53 (Figura 4a). Cuando estas células se trataron con LPS (5 mg) durante 8 horas, la secreción de citoquinas proinflamatorias fue significativamente mayor en mg53/células que en las células WT (Figura 4b).

Debido a que estos datos sugirieron que MG53 puede interactuar con p65 para regular la expresión de citocinas inflamatorias, se evaluó una interacción directa entre p65 y MG53 mediante ensayos de coinmunoprecipitación usando células HEK293 cotransfectadas con Flag-p65 y HA-MG53. Demostramos una interacción débil (Figura 4c). La cotransfección de plásmidos GFP-p65 y RFP-MG53 y el análisis confocal confirmaron la colocalización de p65 y MG53 (Figura 4d). Luego cuantificamos si MG53 afecta la actividad transcripcional de NF-kB (p65) después de la estimulación con TNF midiendo la actividad de luciferasa de una línea celular informadora transcripcional NF-kB/293-GFP-Luc estable que se transfectó transitoriamente con cualquiera de los vectores pHM6 o HA-MG53. Las células indicadoras contienen un indicador de luciferasa de luciérnaga de expresión de lentivirus transducido impulsado por un promotor mínimo de citomegalovirus junto con 4 copias de elementos de respuesta transcripcional de consenso NF-kB (sitio kB) corriente arriba. En ausencia de TNF-a, se detectó una actividad de luciferasa intrínseca muy baja en las células indicadoras que expresaban proteínas MG53. MG53 suprimió la actividad transcripcional de NF-kB (p65) provocada por TNF-a en aproximadamente un 40 por ciento (Figura 4e).

La sobreexpresión de MG53 impidió la translocación nuclear de NF-kB p65 con el tratamiento con TNF-a. NF-kB p65 se translocó al núcleo con el tratamiento con TNF-a en el epitelio del túbulo proximal del riñón.41 Explorar si el tratamiento con MG53 podría atenuar la translocación nuclear de NF-kB p65 tras la estimulación con TNF-a, sobreexpresamos MG53 en células HKC-8 mediante transducción viral Ad-tPA-MG53 dependiente de DOX o mediante tratamiento con MG53 humana recombinante (rhMG53). Usando un anticuerpo monoclonal específico de MG53-, después de la inducción dependiente de DOX, se detectó MG53 mediante inmunotransferencia. MG53 estaba presente en un nivel muy alto en células HKC-8 transducidas con Ad-tPA-MG53,

equivalente a 1 ng de rhMG53/mg de lisado celular. Por el contrario, HKC-8 tomó y expresó una cantidad mucho menor de rhMG53 (Figura 5a). La absorción de rhMG53 marcada con fluorescencia FL por HKC -8 se confirmó mediante microscopía confocal (Figura complementaria S3). Después del tratamiento con TNF-a, el tiempo hasta la activación máxima de p65 fue de 15 a 30 minutos (Figura 5b). En condiciones basales, NF-kB p65 residía principalmente en el citosol y la sobreexpresión de MG53 no cambió esto (Figura 5c yd). Sin embargo, después de la estimulación con TNF-a, p65 se translocó a los núcleos en células HKC-8 que no sobreexpresan MG53. En comparación, la translocación nuclear de p65 se redujo en un 33 por ciento (células que recibieron rhMG53) a un 50 por ciento (células transducidas que recibieron DOX) en células que sobreexpresan MG53 (Figura 5c y d).

La transferencia adoptiva de células RAW diseñadas al modelo UUOmouse se realizó con 1 - 106 células administradas a través de una inyección en la vena de la cola inmediatamente después de la cirugía UUO. Los ratones se dividieron aleatoriamente en un grupo que recibió agua potable normal (-DOX) y un grupo que recibió DOX (2 mg/ml) en agua potable. Los ratones UUO recibieron RAWe cada otro día para un total de 4 inyecciones. Los riñones se recogieron 7 días después de la cirugía.

Los ratones a los que se les infundió RAW diseñado seguido de inducción de DOX mostraron una fifibrosis renal significativamente reducida (en un 30 por ciento) en comparación con los que no recibieron células o los que recibieron infusión de células RAW diseñadas pero sin inducción de Dox (área fibrótica del 66 por ciento; Figura 6a yb).

Solo una pequeña población RAW/Ad-tPA-MG53 sobrevivió a la vigilancia del sistema reticuloendotelial al final de los experimentos. La tinción inmunohistoquímica confirmó que el tratamiento con DOX indujo la expresión de MG53 mediada por RAW en el riñón (Figura 6c). Curiosamente, los riñones UUO de ratones infundidos con RAW y MG53 inducido por DOX exhibieron una relación p-65/t-p65 más baja (en aproximadamente un 40 %) que los que no recibieron RAW o los que recibieron RAW sin DOX (Figura 6d y e). El nivel reducido de p-p65 se confirmó con tinción inmunohistoquímica de p-p65 (S536) de riñones UUO (Figura 6f). Creemos que la MG53 circulante administrada por Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX y la captación por las células del túbulo proximal del riñón podría participar en la reducción de p-p65 (S536) y disminuir la inflamación renal UUO. En comparación con los riñones solo UUO, la expresión de TGF-b1, PAI- 1 y Col1a1 aumentó significativamente en los riñones UUO de ratones infundidos con RAW sin DOX (sin inducción de MG53). La elevación de estos genes profibróticos podría atribuirse a la inducción de una fuerte reacción de aloinjerto de células infundidas en ratones inmunocompetentes. Sin embargo, los riñones UUO de ratones infundidos con RAW y a los que se les administró DOX (inducción de MG53) expresaron un PAI significativamente más bajo (reducción del 60 % al 72 %)-1 y niveles relativamente más bajos de TGF-b1 y Col1a1 que los ratones sin tratamiento con DOX (Figura 6g).

La administración sistémica de rhMG53 mitiga la activación de NF-kB y el desarrollo de fibrosis en ratones sometidos a UUO

Probamos si rhMG53 mostraba un efecto antifibrótico similar al de la terapia celular RAW modificada descrita anteriormente. Nuestros datos farmacocinéticos previos indicaron la corta vida media circulante (alrededor de 90 minutos en roedores) de rhMG53.42 Los ratones toleraron la administración crónica de 2 a 6 mg/kg

rhMG5326,37 bien, por lo que se utilizó la estrategia de administración que se muestra en la Figura 7a. A los ratones UUO se les administró al azar vehículo (solución salina) o rhMG53 (2 mg/kg) diariamente durante los primeros 7 días posteriores a la cirugía y luego cada dos días hasta que se sacrificaron el día 12. Los riñones simulados y contralaterales exhibieron una t-p65 aproximadamente equivalente y los niveles de expresión de fibronectina, con los niveles de p-p65 ligeramente aumentados en los riñones contralaterales en comparación con los riñones simulados. Después de UUO, el riñón t-p65 aumentó. En comparación con los animales tratados con solución salina, la relación p-65/t-p65 en los riñones OUU de los animales tratados con rhMG53-se redujo en aproximadamente un 37 %, mientras que IkBa aumentó en aproximadamente un 27 % (Figura 7b y C). Además, la fibronectina disminuyó en aproximadamente un 33 por ciento (Figura 7b yc). La inmunohistoquímica confirmó que rhMG53 estaba presente en los riñones UUO después del tratamiento (Figura 7d). La fibrosis total se redujo en riñones UUO tratados con rhMG53-(Figura 7e). Sin embargo, la expresión de ARN de TGF-b1, PAI-1 y Col1a1 fue similar en ratones tratados con solución salina o rhMG53 (Figura 7f).

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DISCUSIÓN

MG53 es una proteína TRIM enriquecida en el músculo inicialmente identificada como un componente destacado de la maquinaria de reparación de la membrana plasmática. myokine.32 Anteriormente hemos demostrado que MG53 puede controlar la inflamación durante el daño tisular en órganos remotos.27,29,33,35–37 La presente investigación amplía el alcance de la protección de órganos mediada por MG53-al riñón. Concluimos que MG53 puede atenuar la inflamación intrarrenal y la fibrosis renal al bloquear la activación inducida por citoquinas del factor de transcripción proinflamatorio y profibrótico NF-kB. Esta conclusión se basa en las siguientes observaciones: (i) eliminación genética de MG53 en ratones normales.

dio lugar a una disminución de la función renal a medida que los ratones envejecían, que estuvo acompañada de un aumento de la fibrosis renal y la infiltración del riñón por leucocitos y macrófagos; (ii) en un modelo murino de lesión renal UUO, los riñones obstruidos de ratones deficientes en MG53- exhibieron más fibrosis e inflamación que los ratones repletos de MG53-; (iii) la producción de TNF-a e interleucina-6por células epiteliales tubulares proximales tratadas con LPS se atenuó en presencia de MG53; (iv) el tratamiento con o sobreexpresión de MG53 en una línea de células epiteliales tubulares proximales disminuyó la activación de NF-kB inducida por TNFa al bloquear la translocación nuclear del componente p65 de-kB (se encontró que MG53 se unía directamente a p65, aunque débilmente); y (v) la fosforilación de p65, un paso necesario en la activación de NF-kB, disminuyó en los riñones obstruidos de ratones UUO tratados con MG53 recombinante inducidos para sobreexpresar MG53 en macrófagos. Además, el inhibidor de la activación de NF-kB, IkBa, aumentó en los riñones obstruidos de ratones UUO inyectados con MG53 recombinante.

La eliminación genética de MG53 en ratones normales permitió los efectos adversos del envejecimiento en los riñones. Esto sugiere que la presencia de MG53 endógeno proporciona un nivel básico de protección durante el envejecimiento. Del mismo modo, la pérdida de MG53 endógeno empeoró el FRA por obstrucción. El riñón UUO acumuló MG53, lo que posiblemente refleja la actividad remota de mioquinas del músculo esquelético. No está claro cómo se puede reclutar el músculo MG53 para el riñón durante una lesión; sin embargo, un riñón dañado a menudo desarrolla hipoxia y sufre estrés oxidativo,^44,45señales que podrían servir para reclutar MG53. Si es así, este eje "músculo-riñón-célula inmune" podría aprovecharse para atenuar el daño renal.46 Alternativamente, las células renales expresan niveles bajos de MG53 al inicio del estudio,²⁶y, durante una lesión aguda o crónica, la producción de MG53 podría aumentar.

NF-kB es un importante impulsor transcripcional de la inflamación y la fifibrosis en la lesión renal y el envejecimiento.^14,17,47,48Se nos pidió que investigáramos si los efectos de MG53 podrían estar mediados por NF-kB porque la presencia de MG53 en el compartimento nuclear de los homogeneizados de riñón sugería la posibilidad de interferencia transcripcional. La localización nuclear de MG53 no carece de precedentes. En un modelo transgénico que sobreexpresa la MG53 miocárdica, la MG53 nuclear reguló la expresión del receptor alfa activado por el proliferador de peroxisomas a nivel transcripcional y afectó el metabolismo de los lípidos cardíacos.49 Además, recientemente demostramos que la rhMG53 suprimió la activación de NF-kB para mitigar la insuficiencia cardíaca relacionada con la edad. a través de la reducción de las citocinas proinflamatorias, la apoptosis y el estrés oxidativo en los cardiomiocitos envejecidos.³⁷

El mecanismo molecular de cómo MG53 modula la movilización nuclear/citoplasmática de p65 sigue sin estar claro. MG53 no contiene ninguna señal de localización nuclear, pero contiene 3 supuestas señales de exportación nuclear ricas en leucina N-terminal, un motivo reconocido por la exportación de proteína de exportación nuclear.⁵⁰La interacción directa entre MG53 y p65 fue bastante débil como el único o principal efecto perturbador de MG53 sobre la activación de NF-kB. Aunque MG53 parece afectar el transporte nucleocitoplasmático dinámico de los componentes críticos de NF-kB, los mecanismos exactos aún no se han determinado.

El resultado crítico de la renoprotección mediada por MG53-parece ser la disminución de la remodelación fibrótica a través de la atenuación de la inflamación mediada por NF-kB. La fifibrosis renal es un proceso complejo que implica el depósito patológico de varias proteínas de la MEC.51 MG53 parecía tener efectos claros sobre la proteína fibronectina de la MEC. La fibronectina aumentó en riñones UUO deficientes en MG53 y disminuyó en ratones UUO tratados con MG53. La expresión de otras proteínas ECM en presencia y ausencia de MG53 es más difícil de entender. Previamente demostramos que rhMG53 regula negativamente la señalización de TGF-b1/Smad y suprime la síntesis de proteínas ECM en un estudio in vitro.31 In vivo, las transcripciones de TGF b1, PAI-1 y Col1a1 no aumentaron en los riñones OUU mg53 / animales deficientes. Estas transcripciones disminuyeron en animales UUO inducidos a sobreexpresar MG53 a través de la administración de ratones inducidos viralmente.

macrófagos, pero cuando se administró MG53 recombinante, no se observó ningún efecto. Esto puede ser simplemente un caso de dosificación suficiente porque los niveles intrarrenales de MG53 alcanzados fueron mucho mayores en animales que recibieron el vector de macrófagos en comparación con MG53 recombinante. Además, los niveles de proteína no se midieron y los eventos postranscripcionales podrían modificar la ECM en UUO. Se necesita más investigación para dilucidar el papel emergente de MG53 en la modulación de proteínas ECM específicas. En conclusión, este estudio ha demostrado que una mioquina puede ayudar a regular la inflamación inicial en un órgano remoto como el riñón y, en caso de lesión renal, puede ayudar a atenuar y controlar la inflamación. La figura 8 presenta un modelo de trabajo del papel de MG53 en la renoprotección. Durante la estimulación de patrones moleculares asociados a daños (DAMP, como TNF-a) y patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, como LPS) y el estrés isquémico, el señalosoma NF-kB se activa en el riñón. MG53 protege el riñón al inhibir la fosforilación y activación de la señalización de NF-kB, estabilizar IkBa y reducir la movilización nuclear de p65, bloqueando la activación de programas proinflamatorios. Aunque el MG53 endógeno puede mediar estos efectos, sugerimos que se puede lograr una protección más sólida usando MG53 terapéuticamente, lo cual es factible en función de la capacidad del MG53 exógeno para reducir las lesiones en UUO. Se justifica una mayor investigación para comprender cómo se puede explotar clínicamente esta mioquina.

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DIVULGACIÓN

JM tiene una participación accionaria en TRIM-edicine, Inc., que desarrolla rhMG53 para el tratamiento de enfermedades humanas. Las patentes sobre el uso de MG53 están en manos de la Universidad de Rutgers y la Universidad Estatal de Ohio. Todos los demás autores no declararon intereses en competencia.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR y P-HL) y NIH R01-AG062896 (P-HL y BHR). Este proyecto también recibió el apoyo parcial de un fondo intramuros Lockwood de la Universidad Estatal de Ohio (P-HL) y un premio del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS; P-HL, número de premio UL1TR002733). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de NCATS o NIH.

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORESHL,

PD, P-HL, JM y BHR concibieron y/o diseñaron los estudios; HL, PD, P-HL, ZL y XZ realizaron los experimentos, adquirieron datos y realizaron análisis de datos; PD, P-HL y BHR interpretaron los resultados; y P-HL y BHR redactaron, revisaron y aprobaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final.

MATERIAL SUPLEMENTARIO

Archivo complementario (PDF) Métodos complementarios.

Tabla S1.Secuencias de cebadores. Figura S1. mg53-/- los ratones muestran una mayor deposición de proteína ECM. Los tejidos renales de la misma edad (10 meses) de tipo salvaje (WT) y mg53- /- se tiñeron con 40 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; azul, paneles de la izquierda), a- actina de músculo liso (SMA; verde, segundos paneles), fibronectina (rojo, terceros paneles) y combinados (paneles de la derecha). Barra ¼ 25 mm. Cuantificación del área de fibrosis renal (n ¼ 3 por grupo). Los datos se presentan como medias -DE. Prueba t de Student. *** P <>

Figura S2.Distribución de músculo esquelético MG53 entre núcleo y citoplasma. El músculo esquelético derivado de ratones ormg53-/- de tipo salvaje (WT) se fraccionó y se sometió a inmunotransferencia con un anticuerpo anti-MG53 personalizado (3 mg de lisado) y marcadores de compartimiento celular (20 mg de lisado). Las adenosina trifosfatasas de sodio y potasio se utilizan como marcador de la membrana celular, la histona H3 como marcador nuclear y la tubulina como marcador del citosol.

Figura S3.Las células del túbulo proximal renal HKC-8 captan específicamente rhMG53 marcado con AlexaFluor 647. Se marcaron rhMG53 (Trimedicine) y albúmina de suero bovino (BSA; ThermoFisher Scientific) con kits de etiquetado de anticuerpos Alexa Fluor (AF) (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se cultivaron células HKC-8 en placa con fondo de vidrio Delta TPG (Bioptechs Inc.) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10 por ciento (FBS) en presencia de proteínas marcadas, BSA-AF647 (izquierda ) y rhMG53-AF647 (derecha), durante 24 horas. Las imágenes de la pila Z se tomaron de un microscopio confocal LSM780 (Zeiss). Las imágenes muestran celdas en el fondo de los platos. Barra ¼ 25 mm.

Figura S4.Ingeniería de células RAW para mediar en la secreción inducible de MG53. (A) Las células RAW se infectaron con Ad-tPA-MG53 durante 24 horas y se trataron sin (doxiciclina [Dox]) o con Dox (þDox, 1 mg/ml) durante 24 horas adicionales para inducir la expresión de tPA-MG53. Las imágenes confocales mostraron la inducción de la expresión de MG53 (anticuerpo anti-MG53 personalizado, rojo, paneles inferiores) a partir de células RAW similares a macrófagos (tinción F4/80, verde, paneles superiores). Barras ¼ 25 mm. (B, C) Análisis de transferencia Western de lisados ​​celulares (en la cantidad de 0.6, 3 y 6 mg) para la expresión inducida de tPA-MG53 y MG53 de células RAW infectadas (B) y el cultivo correspondiente concentrados de medios (en volúmenes de 2, 5 y 10ml) (C). Se cargaron como patrones varias cantidades de rhMG53 (en cantidades de 0,2, 1, 0,05 y 0,025 ng). Mw, marcadores de peso molecular.