El reloj circadiano regula la expresión rítmica de eritropoyetina en el riñón murino

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Lina K. Sciesielsk et al.

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La generación de ritmos circadianos es celular autónoma y se basa en un bucle de retroalimentación de transcripción/traducción controlado por una familia de activadores del factor de transcripción del reloj circadiano, incluidos CLOCK, BMAL1 y represores como CRY1 y CRY2. El objetivo del presente estudio fue examinar tanto el mecanismo molecular como la implicación hematopoyética de la expresión de eritropoyetina circadiana. Se utilizaron ratones mutantes con deleción homocigota de los genes del reloj circadiano central criptocromos 1 y 2 (Cry-null) para dilucidar la regulación de la eritropoyetina circadiana. Los ratones de control de tipo salvaje exhibieron una diferencia significativa enriñónexpresión de ARNm de eritropoyetina entre los tiempos circadianos 06 y 18. Paralelamente, un número significativamente mayor de células productoras de eritropoyetina en elriñón(byRNAscope) y niveles significativamente más altos de proteína eritropoyetina circulante (mediante ELISA) se detectaron en el tiempo circadiano 18. Dichos cambios se abolieron en ratones Cry-null y fueron independientes de la tensión de oxígeno, la saturación de oxígeno o la expresión del factor 2 alfa inducible por hipoxia, lo que indica que la expresión de eritropoyetina circadiana está regulada transcripcionalmente por CRY1 y CRY2. Los ensayos del gen reportero mostraron que el heterodímero CLOCK/BMAL1 activa un elemento E-box en el promotor de eritropoyetina 5'. La hibridación in situ de RNAscope confirmó la presencia de Bmal1 en células productoras de eritropoyetina delriñón. En los ratones Cry-null, se encontró un número significativamente reducido de reticulocitos mientras que el número de eritrocitos y el hematocrito permanecieron sin cambios. Por lo tanto, la regulación circadiana de la eritropoyetina en el murino adulto normóxicoriñónestá controlado transcripcionalmente por los activadores circadianos maestros CLOCK/BMAL1 y los represores CRY1/CRY2. Este hallazgo puede tener implicaciones parafisiología renaly enfermedades, diagnósticos de laboratorio y terapia de la anemia.

PALABRAS CLAVE:cronobiología; ritmo circadiano; reloj; criptocromo; eritropoyetina; hematopoyesis; factor inducible por hipoxia

Declaración de traducción Los relojes moleculares en casi todos los tipos de células impulsan la transcripción de genes en colaboración con factores específicos de tejido. Hasta ahora, los mecanismos oscilatorios circadianos en elriñónno se han relacionado con la biología de la eritropoyetina (Epo). En este documento, se ha aclarado que la expresión de Epo circadiana está regulada por proteínas de reloj maestro (criptocromos 1 y 2, Clock y Bmal1). Dado que la EPO actúa de forma distintiva dentro de la compleja red reguladora de la eritropoyesis, el uso óptimo de la Epo humana recombinante en pacientes conriñónla insuficiencia puede incluir su aplicación justo antes de su máximo circadiano fisiológico alrededor de la medianoche.

Los ritmos circadianos en nefrología están en gran parte inexplorados pero son muy relevantes porque su interrupción por el trabajo por turnos, las elecciones de estilo de vida y la senescencia se asocia con un mayor riesgo de diversas enfermedades, incluidos los trastornos cardiovasculares.^1–4Los modelos animales de relojes circadianos perturbados proporcionan la primera evidencia del impacto negativo de la desregulación circadiana en el sistema hematopoyético (p. ej., por un mayor número de eritrocitos envejecidos).^5,6

Con respecto a la eritropoyesis, no solo los efectos celulares sino también la ritmicidad de su principal regulador, la eritropoyetina (Epo), es de particular interés porque los atletas han sido acusados ​​repetidamente de dopaje sanguíneo con Epo humana recombinante (who) debido a las diferencias dependientes de la hora del día en concentraciones de Epo circulantes y parámetros hematológicos.7,8 Las variaciones diurnas en los niveles de Epo en suero humano (S-Epo) se describieron por primera vez en 1981 en pacientes con enfermedad respiratoria crónica de los trabajadores del carbón y de los pulmones,⁹y posteriormente en sujetos sanos.^10,11Hasta la fecha, varios informes indican niveles altos de S-Epo durante la noche (8 p. m. a 4 a. m.) y niveles bajos de S-Epo temprano en la mañana (4 a. m. a 8 a. m.). La fase y la amplitud de las oscilaciones de S-Epo, si las hay, son variables entre individuos humanos.^9,10,12,13En promedio, los niveles de S-Epo cambiaron aproximadamente 1.5-veces con respecto a su mínimo.^14–22Se demostró que este ritmo diurno no se ve afectado por el envejecimiento,20 el entrenamiento,16 o la exposición a la altitud.17 Por el contrario, la oscilación diurna de S-Epo está abolida en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica complicada con hipoxemia diurna, en mieloma con insuficiencia renal. y en mielodisplasia.^15,21,23

En 2009, describimos la expresión circadiana de ARNm de Epo en el riñón murino en un análisis a gran escala de los promotores de genes controlados por reloj, pero no pudimos identificar un elemento genético distinto en el gen de EPO o un factor de transactivación responsable de la oscilación circadiana. 24 Más recientemente, un modelo de shock hemorrágico en ratas sugirió, según patrones de expresión paralelos, que los genes reloj (Bmal1 y Per2) estaban involucrados en la regulación de la secreción de EPO durante la hipoxia/isquemia.²⁵

La generación de ritmos circadianos es autónoma de las células y se basa en un circuito de retroalimentación de transcripción-traducción controlado por una familia de factores de transcripción del reloj circadiano, incluidos CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1 y CRY2.26 El heterodímero CLOCK/BMAL1 activa la transcripción. de los genes del reloj circadiano PER1/2 y CRY1/2 mediante la unión a elementos de la caja E en sus promotores. Sin embargo, las proteínas PER y CRY proporcionan retroalimentación negativa al inhibir la actividad de CLOCK/BMAL1, lo que reduce su propia expresión. Los resultados netos conducen a patrones de oscilación de la expresión génica circadiana y cambios rítmicos en la fisiología celular y de órganos.²⁷

Para comprender las implicaciones del reloj biológico, hasta ahora se han estudiado varios tipos de ratones mutantes con factores de transcripción del reloj de un solo núcleo interrumpidos o eliminados.28,29 Aquí, aprovechamos el doble mutante Cry1–/–/Cry2–/–. ratones (Cry-null), que carecen de la capacidad de expresar ritmos circadianos endógenos.^26,30Los datos combinados in vivo e in vitro demuestran que Cry1/2 regula la expresión circadiana de Epo a través de la transcripción inducida por CLOCK/BMAL1-en el riñón normóxico.

MÉTODOS

experimentos con animales

Se cruzaron animales homocigotos Cry1–/– /Cry2–/– (Cry-null; macho y hembra; basados ​​en C57BL/6J)31 y controles de tipo salvaje (WT) (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) y se criaron durante 5 a 7 meses. Los ratones WT procedían de la cría de la colonia Cry-null.

El genotipo Cry-null se confirmó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Tabla complementaria S1). Para el arrastre, los ratones se alojaron en grupo y tuvieron comida y agua ad libitum en un ciclo de luz/oscuridad de 12-hora:12-hora durante 14 días. El día 2 después de la liberación a la oscuridad constante, los animales se sacrificaron en el tiempo circadiano (CT) 06 o 18 (n=13–15 para cada grupo y punto de tiempo). Los tejidos (hígado y riñón) se obtuvieron rápidamente y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Un subgrupo de animales WT y Cry-null machos y hembras se analizó en detalle para determinar el peso corporal y el hemograma diferencial.

Para el análisis de gases en sangre, los animales fueron anestesiados (fentanilo, {{0}}0,075 mg/kg, midazolam, 1,5 mg/kg y medetomidina, 0,75 mg/kg), traqueotomizados, intubados y ventilados (corriente corriente). volumen, 9 ml/kg, frecuencia respiratoria, 160 min- 1, presión positiva al final de la espiración, 2 cm H2O), como se describe.32 Se introdujo quirúrgicamente un catéter de polietileno en la arteria carótida izquierda. Después de 5 minutos de estabilización, se terminó el experimento mediante exanguinación rápida a través del catéter carotídeo, se analizaron los gases sanguíneos (ABL-800; Radiometer; temperatura controlada) y se extirparon los riñones para análisis post hoc.

Todos los procedimientos fueron autorizados por el Comité Local de Cuidado de Animales (T0307/08; G0100/17 con un apéndice de enero de 2021) y se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones de la ley de protección animal alemana.

Preparación de ARN y análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa

El ARN total se extrajo como se describe.33 Se transcribió inversamente un total de 1000 ng de ARN total con transcriptasa inversa SuperScript III (Thermo Fisher; No. 18080085) y hexámeros aleatorios (Thermo Fisher; No. SO142), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones cuantitativas en cadena de la polimerasa se realizaron en un ciclador StepOnePlus (Life Technologies) con cebadores que abarcan intrones o ensayos TaqMan (Tabla complementaria S2). La cuantificación absoluta del ARNm se logró por comparación con una curva estándar de diluciones en serie de la plantilla de reacción en cadena de la polimerasa.

Detección de la expresión de ARNm de Epo en el riñón mediante la técnica RNAscope

El ensayo RNAscope se realizó de acuerdo con los protocolos del fabricante (ACD; nota técnica 320536). Las criosecciones transversales de riñón medio de 10- mm se tiñeron con una sonda C1 contra DapB (control negativo; ACD; No. 310043) o Epo (ACD; No. 315501). Se omitieron los pasos de hibridación usando Amp 4-6 y la detección de las señales rojas. Dos investigadores ciegos e independientes contaron las células Epo positivas con un aumento original de 200, en 3 a 8 criosecciones por animal en un sistema de imágenes Axioplan 2 (Zeiss).

Se realizaron imágenes representativas de cuantificación de Epo y tinción fluorescente doble utilizando el kit V2 de reactivo de detección fluorescente multiplex RNAscope (ACD; n.º 323110), de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las secciones transversales para de riñón medio de 1,5- mm se tiñeron con una sonda C1 contra Bmal1 (ACD; No. 438741) y una sonda C2 contra Epo (ACD; No. 315501-C2). Se usó Opaleye 520 (Akoya BioSciences; No. FP1487001KT) con la sonda C1, y se usó Opaleye 650 (Akoya BioSciences; No. FP1496001KT) con la sonda C2. Con un aumento original de - 400, se tomaron imágenes de células positivas para Epo para la colocalización de Bmal1 en un sistema de imágenes Eclipse Ti2 (Nikon). El 40,6-diamidino-2-fenilindol se usó como contratinción.

Concentraciones séricas de EPO

Las muestras de sangre se dejaron coagular durante 1 hora a temperatura ambiente antes de centrifugarlas durante 20 minutos a 2000 - g. Se eliminó el suero y se congeló inmediatamente a –80 C hasta realizar el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para Epo (Quantikine; R&D Systems; No. MEP006) con muestras sin diluir. La absorbancia se leyó con un lector de absorbancia de microplacas iMARK (Bio-Rad) a 450 nm, con corrección de longitud de onda a 570 nm y una curva estándar de ajuste de parámetro 4-, como se describió anteriormente.³³

Recuentos de glóbulos

Synlab midió los recuentos de células totales y diferenciadas de sangre anticoagulada con EDTA. vet Berlin con un contador de células automatizado ADVIA2120i (Siemens) para sangre murina.

Ensayos de genes informadores

Células de riñón embrionario humano 293 (DSMZ; No. ACC305; pases números 3–10; micoplasma negativo) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco/Ham F12 (Biochrom; No. FG4815) suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (Merck; No. F7524). La transfección celular se realizó en 12-placas de pocillos que contenían 167 - 105 células/pocillo. Cada pocillo se transfectó con 333 ng de ADN de plásmido (1 de 10 de los cuales era una construcción de vainilla) y 1 ml de reactivo de transfección Fugene 6 (Promega; n.º E2691) como se describe.34 Todas las construcciones utilizadas se enumeran en la Tabla complementaria S3. Las células se lisaron 48 horas después de la transfección con tampón de Lisis Pasiva (Promega; No. E1941). La actividad de luciferasa se determinó con los kits Beetle-Juice y Renilla-Juice (ambos pjk GmbH; Nos. 102511/102531, respectivamente), en un luminómetro Lumat LB9501. Cada experimento se realizó por duplicado técnico y se usaron los valores medios para los cálculos.

análisis estadístico

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.5-veces el rango intercuartílico) en 4 de 6 genes expresados ​​circadianos. Los datos se analizaron con IBM SPSS Statistics 27 y se presentan como puntos individuales con la mediana o como barras con la media y la desviación estándar. Se realizó la prueba U de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis con Bonferroni como prueba post hoc.

RESULTADOS

Ablación de la expresión circadiana de Epo en ratones Cry-null

Para dilucidar el mecanismo molecular de la regulación circadiana de Epo, analizamos la expresión de ARNm y proteínas de Epo en ratones mutantes WT y Cry-null. En el riñón WT, los genes del reloj canónico mostraron una expresión dependiente de la hora del día, mientras que esto se eliminó en los ratones Cry-null, como se esperaba (Figura complementaria S1). Previamente informamos sobre la oscilación circadiana de la expresión del ARNm de Epo durante 24 horas para riñones murinos adultos WT. ) y CT18 (fase de actividad; máximo esperado; Figura 1a). En los riñones de ratones Cry-null, sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en la expresión de ARNm de Epo renal. En particular, en ratones Cry-null, las cantidades absolutas de niveles de transcripción de Epo renal en ambos momentos estaban entre los niveles medios de ARNm de Epo WT en CT06 y CT18 (Figura 1a). El ARNm de EPO en los hígados correspondientes estuvo por debajo del límite de detección (datos no mostrados).

Cambios diurnos en las concentraciones séricas de Epo

Para estimar la traducción de la expresión del ARNm de Epo circadiano en la proteína Epo circulante, analizamos muestras de suero mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Se tomaron muestras de sangre antes que las muestras de órganos. Serum Epo aumentó w2.3- veces entre CT06 y CT18 en ratones WT, pero esta diferencia se eliminó en ratones Cry-null (Figura 1b). En particular, las concentraciones medianas de S-Epo promediadas a lo largo del tiempo (CT06 y CT18) fueron similares en ratones WT y Cry-null (22 mU/ml [rango, 3–59 mU/ml] frente a 21 mU/ml [rango, 7 –50 mU/ml]).

Expresión de Epo circadiana en relación con los parámetros de gases en sangre arterial y la oximetría de pulso

Para investigar si los posibles cambios diurnos en los niveles de oxígeno en la sangre y los tejidos podrían causar una oscilación circadiana de la expresión de Epo, se obtuvieron muestras de sangre arterial y se realizaron análisis de gases en sangre en ratones Cry-null y WT anestesiados, traqueotomizados y ventilados mecánicamente en CT06 o CT18, que corresponden a los niveles circadianos de ARNm de Epo más bajos y más altos, respectivamente (Figura 1a). No detectamos diferencias significativas en el pH arterial, la presión parcial de CO2 o la presión parcial de O2 ni en el exceso de base estándar o las concentraciones de lactato (Figura 2a-e) entre los ratones CT06 y CT18 o WT y Cry-null. Los niveles de saturación de oxígeno, medidos por oximetría de pulso, tampoco mostraron diferencias (Figura 2f). La expresión génica del factor inducible por hipoxia (HIF) 2a del regulador maestro de EPO no difirió entre CT06 y CT18, ya sea en ratones WT o Cry-null (Figura 3). Por tanto, en condiciones normóxicas, la regulación circadiana de la Epo no está provocada por cambios en la tensión de oxígeno.

Interruptor de encendido y apagado circadiano de la expresión de Epo en células renales productoras de Epo

Para estudiar si la expresión circadiana de ARNm de Epo está mediada por el encendido de células renales productoras de Epo adicionales (REPC) o simplemente por el aumento de la expresión de Epo por célula, se usó la hibridación in situ de RNAscope en secciones transversales del riñón medio (ejemplo en la Figura complementaria S2). En ratones WT, la cantidad de REPC aumentó significativamente entre CT06 (mediana, 5; rango, 0–25) y CT18 (mediana, 22; rango, 5–82; 4.{{ 11}} veces; P=0,010). Por el contrario, los riñones Cry-null mostraron números similares de REPC en CT06 (mediana, 18; rango, 2–33) y CT18 (mediana, 15; rango, 4–87; no significativo; Figura 1c). Consideramos que los ratones Cry-null exhiben una restricción del crecimiento debido a la alteración de la señalización del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), lo que resulta en una diferencia cada vez mayor en el peso corporal y el tamaño de los órganos entre los ratones Cry-null y WT.30 Como usamos animales relativamente jóvenes, el peso absoluto del riñón de los ratones Cry-null fue solo ligeramente más bajo que el de los ratones WT (-12 por ciento en los ratones Cry-null), pero la proporción relativa del peso del riñón con respecto al peso corporal no difirió (Figura complementaria S3) . Por lo tanto, el aumento circadiano en la expresión de ARNm de Epo parece estar regulado por un cambio de REPC adicionales.

Activación del promotor mínimo de EPO por CLOCK/BMAL1

Para identificar las secuencias reguladoras responsables de la expresión circadiana de Epo (Figura 4a), se realizaron ensayos de genes indicadores de luciferasa en células 293 de riñón embrionario humano. La línea celular de riñón embrionario humano 293 no se eligió por su origen renal sino por su falta de un reloj circadiano endógeno. Por lo tanto, el efecto estimulante de CLOCK/BMAL1 podría probarse en un fondo CLOCK/BMAL1 bajo y no oscilante. La sobreexpresión de CLOCK/BMAL1 estimuló significativamente la actividad del promotor mínimo de EPO humana (Figura 4b, I frente a II). Si el motivo E-box (–36 a –31 pb en relación con el sitio de inicio de la transcripción) está mutado,35 este efecto se atenúa (Figura 4b, III).

Para estudiar si la regulación circadiana observada dependía del tipo de célula, examinamos varias líneas celulares que expresan EPO para detectar la actividad del reloj endógeno mediante el control de las oscilaciones mediadas por el promotor Bmal1 de un reportero de luciferasa. Aquellos con un ritmo endógeno incluyeron células HEP3B derivadas de hepatoma humano, células KELLY derivadas de neuroblastoma humano y células de riñón de ratón PDGFRbþ (anteriormente expresando EPO línea celular de ratón FAIK1-10).36,37 Entre las 3 líneas celulares, solo Las células KELLY exhibieron oscilaciones de luciferasa impulsadas por el promotor de EPO (Figura complementaria S4A). Aunque las células PDGFRbþ exhibieron un fuerte ritmo circadiano de la actividad del promotor Bmal1, no detectamos oscilaciones mediadas por el promotor de EPO, lo que sugiere una amplitud más baja de la construcción informadora impulsada por el promotor de EPO (Figura complementaria S4B).

Colocalización de Bmal1 y Epo en los riñones de ratones Cry-null versus WT

Para dilucidar aún más (i) la regulación circadiana de la producción de Epo renal mediante el reclutamiento de células renales productoras de Epo y (ii) la colocalización de la expresión de Bmal1 y Epo, realizamos la hibridación in situ con RNAscope. Epo y Bmal1 colocalizados, y la microscopía de bajo aumento representa diferencias en el reclutamiento de REPC (Figura 5), ​​como se cuantifica en la Figura 1c.

Hallazgos hematológicos en la deficiencia de Cry1/Cry2 Para evaluar (i) los efectos hematopoyéticos de la falta de expresión circadiana de Epo y (ii) posibles otras anomalías hematológicas en ratones sin un reloj funcional, se analizaron los recuentos de células sanguíneas. Las diferencias en la hora del día de la expresión del ARNm de Epo y la concentración de S-Epo no se reflejaron en diferencias significativas en los recuentos de reticulocitos periféricos en CT06 frente a CT18 en ratones WT. Sin embargo, los recuentos de reticulocitos fueron significativamente más bajos tanto en CT06 como en CT18 en animales Cry-null en comparación con ratones WT (Figura 6a). No hubo diferencia significativa en el número de eritrocitos o valores de hematocrito en ratones WT versus Cry-null. Ambos parámetros, sin embargo, no variaron entre CT06 y CT18 en ambas cepas (Figura 6b y c) y no se correspondieron con el menor número de reticulocitos periféricos en ratones Cry-null (Figura 6a). Para probar si las deficiencias nutricionales (p. ej., hierro y folato) debidas a la alteración de la señalización de IGF1 están involucradas en la discrepancia de reticulocitos reducidos pero números de eritrocitos normales en ratones Cry-null, se analizaron el tamaño y la forma de los glóbulos rojos, pero no mostraron diferencias significativas. entre ratones Cry-null y WT (Figura complementaria S5).

En particular, la mediana de los recuentos de plaquetas en los ratones Cry-null tendió a ser más alta que en los ratones WT, pero los números de plaquetas no fueron significativamente diferentes entre CT06 y CT18 en ambas cepas (Figura 6d). Por el contrario, los recuentos de glóbulos blancos (WBC) diferían significativamente entre CT06 y CT18 en WT pero no en ratones Cry-null. La mediana del número de WBC en ratones Cry-null fue similarmente alta, como en ratones WT en CT06 (Figura 6e).

DISCUSIÓN

Aquí, demostramos que la expresión de Epo circadiana está regulada a nivel transcripcional. El análisis de las concentraciones de ARNm de Epo y S-Epo en ratones arrítmicos deficientes en Cry1 y Cry2 redirigió nuestra búsqueda de "reloj de Epo" a sus factores de transcripción objetivo aguas abajo CLOCK y BMAL1, que son reprimidos por CRY1 y CRY2.26 Ablación de derivaciones Cry1/Cry2 a la pérdida de la represión rítmica de CLOCK/BMAL1, lo que resultó en niveles constantes de transcripción de Epo que se encontraban entre los niveles medios en CT06 y CT18 en ratones WT (Figura 1a). La hibridación in situ por RNAscope indica que la oscilación circadiana se logra activando la expresión de ARNm de Epo en células intersticiales (Figura 1c), y la hibridación in situ por RNAscope también reveló la expresión de Bmal1 en REPC (Figura 5).

Más importante aún, los niveles significativamente más altos de S-Epo en CT18 confirman que la regulación transcripcional circadiana de Epo se traduce en oscilaciones circadianas de la proteína Epo circulante en condiciones normóxicas (Figura 1b). El máximo real de los niveles de S-Epo se espera un poco más tarde que CT18 porque la síntesis de novo de la proteína EPO requiere w80 a 120 minutos,38 y los tiempos circadianos se eligieron sobre la base de los niveles máximos de ARNm de Epo. 24 Descubrimos que la regulación circadiana de la Epo probablemente esté mediada por la activación transcripcional de un motivo E-box en el promotor de EPO 5' por CLOCK/BMAL1 (Figura 4 y Figura complementaria S4), lo que es consistente con la correlación positiva descrita entre la proteína BMAL1 y Niveles de S-Epo en un modelo de rata de hemorragia aguda.²⁵

Existe evidencia de una regulación bidireccional entre las vías CLOCK/BMAL1 y HIF a través de la interacción directa proteína-proteína.^39,40La regulación al alza de HIF2a, el principal activador del promotor de la EPO,41,42 resultó en niveles de expresión alterados de genes reloj en células de hepatoma humano.43 Además, BMAL1 se dimeriza con las proteínas HIF1a y HIF2a,^44,45,y el control del reloj circadiano de la actividad de HIF se regulan de una manera específica de tejido.39 En ratones, expuestos a hipoxia aguda (4 horas al 6 por ciento frente al 21 por ciento de O2), el ARNm de EPO aumentó excesivamente pero ya no mostró diferencias circadianas .46 Por lo tanto, las condiciones normóxicas son probablemente las más apropiadas para diseccionar el mecanismo molecular de la regulación de la Epo circadiana. En roedores, sin embargo, se han informado cambios diurnos en los niveles de oxígeno en sangre y tejidos.39,47 En ratas, hay un rango bajo de cambios rítmicos diarios en la oxigenación renal de zD3 por ciento, con un pico en la oscuridad (¼ de actividad de roedor) .47 Tales diferencias no pudieron detectarse en nuestros experimentos, en los que solo se pudieron estudiar ratones anestesiados, traqueotomizados y ventilados mecánicamente por razones de regulación animal. Sin embargo, el análisis del pH arterial, la presión parcial de CO2 y la presión parcial de O2, el exceso de base estándar o el lactato, así como la saturación de oxígeno, no indicaron diferencias importantes entre los ratones WT y Cry-null en ambos CT (Figura 2). Además, los niveles de transcripción de Hif2a en el riñón también fueron similares en todas las condiciones (Figura 3). Por lo tanto, en condiciones normóxicas, la regulación circadiana de la Epo parece ser independiente de los cambios diurnos en la tensión de oxígeno. Sin embargo, la cuestión de en qué medida la gran altitud o la hipoxia (pO2 baja) influye en la oscilación circadiana de la producción de Epo merece mayor atención. Los niveles humanos de S-Epo son generalmente más altos a gran altura, mientras que la fase y la amplitud no cambian,17,22 y en voluntarios sanos expuestos a hipoxia normobárica, las concentraciones de S-Epo muestran una oscilación pronunciada.⁴⁸

La regulación de la Epo circadiana es probablemente más relevante para la nefrología clínica y la hematología, pero también para el diagnóstico de laboratorio, como los análisis de sangre para el dopaje con agentes estimulantes de la eritropoyesis. Para la evaluación de las concentraciones de Epo circulante en los análisis de dopaje, es necesario considerar la hora del día (hora externa) en la extracción de sangre y el cronotipo de la persona (hora interna).49,50

En la eritropoyesis, las unidades formadoras de ráfagas, las eritroides son las primeras células específicas de linaje, seguidas de las unidades formadoras de colonias, las eritroides, que muestran una expresión abundante del receptor Epo. Después de 2 días en cultivo con Epo, las unidades formadoras de colonias murinas-eritroides producen colonias de eritroblastos. Una vez que se alcanza la etapa de eritroblastos ortocromáticos después de 7 días, las células extruyen sus núcleos para convertirse en reticulocitos que carecen de expresión del receptor Epo. Probablemente no sea sorprendente que no se observaron diferencias entre CT06 y CT18 en ratones WT (Figura 6a-c). En particular, el número total de reticulocitos fue significativamente mayor en los ratones WT que en los ratones Cry-null (Figura 6a), lo que sugiere que la diferenciación en reticulocitos se ve afectada en los ratones Cry-null. Los datos anteriores indican que las células progenitoras eritroides tempranas también exhiben un patrón circadiano de síntesis de ADN. La administración in vivo de rhEpo mejora los ritmos circadianos del número de colonias eritroides.52 Un número más bajo de reticulocitos, a pesar de las concentraciones generales relativamente altas de S-Epo en los ratones Cry-null, podría resultar de la abolición de la síntesis de ADN circadiano en el nivel de los progenitores eritroides. Tal constelación de S-Epo alta y eritropoyesis reducida se ha observado en ratones con ablación genética de la producción de melatonina pineal (ratones C3H/HeN que carecen de una N-acetil transferasa limitante de la velocidad),53 lo que argumenta las actividades circadianas intrínsecas en la célula progenitora eritroide nivel.

En particular, los ratones Cry-null muestran una reducción de aproximadamente el 80 por ciento en los niveles de IGF1, lo que conduce a una reducción de la señalización de IGF1 y una reducción del 30 por ciento del peso corporal y el tamaño de los órganos en comparación con los WT, un efecto que se exacerba a lo largo de la vida.30 Aunque los animales utilizados en nuestro experimentos eran relativamente jóvenes (edad media,^21–29 semanas), mostraron un efecto moderado en el peso corporal total y absoluto de los riñones en ratones Cry-null, pero la relación entre el peso de los riñones y el cuerpo fue normal (Figura complementaria S3). Este último hecho puede ser relevante para la capacidad de síntesis de la proteína Epo (Figura 1b).

Sin embargo, el análisis del tamaño o la forma de los glóbulos rojos (MCV, MCH y MCHC; figura complementaria S5) no sugirió deficiencias nutricionales (p. ej., hierro y folato) como explicación de la discrepancia entre el recuento reducido de reticulocitos y el recuento normal de eritrocitos en Cry- ratones nulos (Figura 6a yb). En particular, la señalización de Epo e IGF1 sincroniza la proliferación y diferenciación celular durante la eritropoyesis a través de la interacción con el complejo transcripcional GATA-1/amigo de GATA-1.54 En este proceso, Epo activa la vía celular AKT y, por lo tanto, aumenta la afinidad de GATA-1, el principal regulador transcripcional de la eritropoyesis, con su amigo cofactor GATA-1. Sin embargo, este mecanismo se inhibe si se elimina la señalización de IGF1.54 Por lo tanto, un efecto positivo de una Epo relativamente más alta en ratones Cry-null sobre la diferenciación de glóbulos rojos puede compensar la actividad reducida de IGF1 en los ratones Cry-null relativamente jóvenes estudiados aquí.

La implicación general de la arritmicidad circadiana completa en la hematopoyesis se dilucida aún más mediante nuestro análisis de los números de plaquetas y glóbulos blancos. Los resultados anteriores de ratones que expresaban una forma negativa dominante de Clock (ClockD19/D19) indicaron que la interrupción de la expresión de trombopoyetina (el principal regulador de la megacariopoyesis) y su receptor Mpl da como resultado un mayor número de megacariocitos de médula ósea maduros y de plaquetas circulantes. 55 La oscilación circadiana significativa descrita del número de plaquetas con un pico en el tiempo zeitgeber (ZT) 20 en ratones WT, así como números de plaquetas más altos en ZT08 en ratones ClockD19/D19,55 lo que resulta en una falta de oscilación circadiana del número de plaquetas, no pudo confirmarse en nuestro modelo de ratón (Figura 6d). Otro hallazgo importante es la pérdida de las diferencias en la hora del día de los glóbulos blancos circulantes en ratones Cry-null en contraste con los ratones WT (Figura 6e), lo que es consistente con la actividad informada de CLOCK/BMAL1 en la producción de glóbulos blancos maduros.^56,57

Para la interpretación de nuestros datos, se deben considerar las diferencias en las actividades día-noche en ratones y humanos: el tiempo CT06 en humanos corresponde aproximadamente a la medianoche (fase de sueño), mientras que CT18 corresponde aproximadamente al mediodía (fase de actividad). Lo contrario es cierto para los ratones nocturnos, pero ambos organismos muestran el mismo patrón de expresión de Epo circadiano (bajo en CT/ZT06, alto en CT/ZT18). Esto indica que mecanismos adicionales (p. ej., factores metabólicos) podrían modificar los ritmos de expresión de Epo en ambos organismos. La sincronización entre los niveles máximos de Epo y la expresión del receptor de Epo en progenitores eritroides tempranos (unidades formadoras de ráfaga, eritroides e incluso unidades formadoras de colonias, células eritroides)⁵² sugiere que los pacientes que reciben tratamiento con rhEpo (p. ej., en etapa terminal de anemia renal o trastornos hematológicos) se beneficiarían de imitar la fisiología circadiana normal aplicando hipo durante la noche. Todavía no se han informado trastornos hematopoyéticos en humanos con mutaciones de pérdida de funciones CRY1 (Herencia mendeliana en línea en el hombre *601933) o CRY2 (Herencia mendeliana en línea en el hombre *603732). Los informes clínicos asocian las variantes de CRY1 principalmente con trastornos por déficit de atención/hiperactividad, frecuentemente acompañados de insomnio, ansiedad, depresión o trastorno de la fase de sueño retrasada.^58,59Esto merece una mayor investigación porque tales enfermedades pueden empeorar por anemia o trastornos hematopoyéticos.

En conclusión, este estudio proporciona la primera evidencia de que la expresión circadiana de Epo en el riñón murino adulto normóxico está regulada a nivel transcripcional por la activación mediada por CLOCK/BMAL1-de un elemento E-box en el promotor 5'EPO. Como la EPO actúa de manera distintiva dentro de la compleja red reguladora de la eritropoyesis, el uso óptimo de la repo en pacientes con insuficiencia renal puede incluir su aplicación justo antes de su máximo circadiano fisiológico en la noche.