Los roles cruciales de TRPM6 en la regulación circadiana de la presión arterial

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Importancia del canal iónico renal TRPM6 en la secreción circadiana de renina para elevar la presión arterial

Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto y Hiroaki Miki

Presión arterialtiene un patrón diario, con valores más altos en el período activo. Su elevación al inicio del período activo aumenta sustancialmente el riesgo de eventos cardiovasculares fatales. La secreción de renina estimulada por las neuronas simpáticas renales se considera esencial para este proceso; sin embargo, su mecanismo regulador sigue siendo en gran parte desconocido. Aquí mostramos la importancia depotencial receptor transitorio relacionado con melastatina 6 (TRPM6), un canal catiónico permeable al Mg2 plus, para aumentar la secreción de renina en el período activo.TRPM6la expresión se reduce significativamente en el túbulo contorneado distal de ratones hipotensos deficientes en Cnnm2-. Generamos riñón específicoTRPM6-ratones deficientes y observar una disminución enpresión arterialy una desaparición de su variación circadiana. Consistentemente, la secreción de renina no aumenta en el período activo. Además, se anula la secreción de renina después de la activación farmacológica del receptor adrenérgico β, el objetivo de la estimulación neuronal, y la expresión del receptor disminuye en las células secretoras de renina. Estos resultados indican los roles cruciales deTRPM6 en la regulación circadiana depresión arterial.

Se estima que aproximadamente mil millones de personas en todo el mundo tienen hipertensión, lo que aumenta significativamente el riesgo de diversas enfermedades, incluidas enfermedades potencialmente mortales, como la cardiopatía isquémica y el accidente cerebrovascular. Se sabe que estos incidentes fatales relacionados con la hipertensión ocurren con frecuencia temprano en la mañana, el comienzo del período activo cuandosangrepresiónsube bruscamente. Se considera que la secreción de renina desencadenada por las neuronas simpáticas renales juega un papel crucial en estepresión arterialelevación, pero su mecanismo de regulación no se conoce bien².

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Es ampliamente aceptado que algunos minerales de la dieta, en particular el sodio y el potasio, juegan un papel importante en el control desangrepresión. El magnesio es un elemento esencial importante involucrado en una variedad de actividades biológicas. Los estudios epidemiológicos han demostrado una relación inversa significativa entre los niveles de magnesio en la dieta y el riesgo de hipertensión3-6. Además, la excreción urinaria de magnesio, que se supone que está aproximadamente en equilibrio con la absorción intestinal de magnesio, se correlaciona inversamente con el riesgo de hipertensión. Estos hallazgos sugieren una estrecha asociación entre la homeostasis del magnesio en el organismo ypresión arterialregulación, destacando la importancia de los canales y/o transportadores de Mg2 plus en la regulación depresión arterial.

Una gran cantidad de magnesio se reabsorbe constantemente en el riñón. La mayor parte del magnesio en el filtrado glomerular se reabsorbe en la rama ascendente gruesa del asa de Henle, pero el paso final de reabsorción ocurre en el túbulo contorneado distal (DCT)8. Este último proceso está estrictamente regulado para ajustar la cantidad de reabsorción a un nivel apropiado para mantener la homeostasis del magnesio. Los análisis genómicos de enfermedades congénitas con síntomas de hipomagnesemia han revelado varias moléculas clave implicadas en este procesoTRPM6, codificaciónpotencial receptor transitorio relacionado con melastatina 6(TRPM6), que está mutado en pacientes con hipomagnesemia recesiva con hipocalcemia secundaria2,10.TRPM6forma un canal de iones permeable a Mg2 plus localizado en la membrana apical de las células DCT y media la entrada de Mg2 plus desde la luz tubular1. Otra molécula clave es la ciclina M2 (CNNM2) y el transportador Mg2 plus localizado en la membrana basolateral de las células DCT12,13. Las mutaciones de cnnm2 causan hipomagnesemia dominante familiar, que se caracteriza por defectos en la reabsorción de magnesio en el riñónl2. Los ratones deficientes en Cnmm2-muestran síntomas similares de hipomagnesemia con pérdida de magnesio en el riñónl4. La función molecular precisa de CNNM2 sigue siendo controvertida, pero varias líneas de evidencia sugieren que media Mg2 más el flujo de salida de las células DCT a través de la membrana basolateral15, lo que contribuye a la reabsorción de magnesio. Análisis adicionales de ratones deficientes en Cnnm2-han revelado que estos ratones también tienen niveles significativamente más bajossangrepresiónque los ratones de control4. Sin embargo, los detalles mecánicos y la participación de otros canales/transportadores de Mg2 plus en estesangrepresiónla regulación sigue siendo desconocida.

También se sabe que el DCT renal desempeña un papel crítico ensangrepresiónregulación porque reabsorbe significativamente el sodio y regula el volumen de líquidos corporales. Varios canales/transportadores de cationes, como el cotransportador de Na-Cl (NCC), el canal de sodio epitelial (ENaC) y el intercambiador 2 de Na más/H más (NHE2), se expresan en la membrana apical del DCT y algunos de estas proteínas median la ingesta de Na+ en las células DCT desde la luz tubular. Luego, el Na+ intracelular es expulsado de las células a través de la membrana basolateral por Na+/K+-ATPasa para lograr su reabsorción. Aparte de la participación directa en la regulación del volumen de fluidos corporales, el DCT se encuentra adyacente a la mácula densa, que controla la secreción de renina, una hormona con el papel principal en la orquestaciónpresión arterialreglamento17,18. Al detectar los niveles de Cl- en la orina, las células de la mácula densa estimulan las células yuxtaglomerulares (JG) cercanas para que secreten renina.

En este trabajo, realizamos análisis de transcriptoma con riñones de ratones hipotensos Cnnm2-deficientes. Encontramos una disminución significativa enTrpm6, lo que nos impulsó a generar riñón específicoTrpm6-ratones deficientes. Inesperadamente, los análisis de esta cepa de ratón revelan un fenotipo cualitativamente diferente al de Cnnm2-deficiente: la pérdida de la variación circadiana desangrepresión. También encontramos que este fenotipo es causado por una secreción alterada de renina, unpresión arterial- hormona elevadora cuyo nivel en sangre normalmente está elevado durante la fase activa.

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Resultados

Regulación a la baja deTRPM6 (potencial receptor transitorio relacionado con melastatina 6)expresión en ratones deficientes en Cnnm2-. Explorar el mecanismo molecular depresión arterialreducción en ratones deficientes en Cnnm2-, realizamos análisis de micromatrices de ADN para investigar los cambios en la expresión génica en el riñón de Cnnm2f/il; Seis2-ratones Cre, que carecen de ambos alelos Cnnm2 en el riñónl4. Entre los genes expresados ​​diferencialmente (Tabla 1), optamos por analizar Pvalb yTrpm6, ambos expresados ​​en DCT919. Los análisis de PCR cuantitativa (qPCR) revelaron queTrpm6la expresión se redujo de manera similar en los riñones de ambos Cnnm2fi; Seis2-Cre y Cnnm2 plus / ratones. Dado que tanto Cnnm2 plus /A como Cnnm2fi/; Seis2-ratones Cre estaban hipotensos4, analizamosTRPM6 expresión con más detalle. Los análisis de inmunotransferencia de los lisados ​​​​de riñón confirmaron una disminución significativa deTRPM6a nivel de proteína por deficiencia de Cnnm2-, mientras que los niveles de NCC y NCC fosforilada (forma activa) no se vieron afectados de forma marcada, la expresión de CNNM2 se confirmó mediante análisis sucesivos de inmunoprecipitación e inmunotransferencia). La disminución deTRPM6en los riñones de Cnnm2f/i; Los ratones Six2-Cre también se confirmaron mediante análisis de inmunofluorescencia.

También examinamosTRPM6expresión en ratones que carecen de CNNM4, que también muestran síntomas de hipomagnesemia20 pero tienen niveles elevadospresión arterial4. Los análisis de inmunotransferencia e inmunofluorescencia indicaron queTRPM6la expresión aumenta en células DCT de ratones deficientes en Cnnm4-, lo que sugiere queTRPM6La expresión está estrechamente relacionada conpresión arterialvalores, pero no está directamente relacionado con los niveles de magnesio en sangre.

Regulación deTRPM6expresión por Mg2 plus intracelular en células DCT. Caracterizar el mecanismo molecular deTRPM6 regulación negativa en ratones deficientes en Cnnm2-, utilizamos una línea celular MDCT21 derivada de DCT, que expresa predominantemente Cnnm2 y moderadamente Cnnm3 y Cnnm4 entre los genes de la familia Cnnm. Como CNNM2 y CNNM4 tienen una fuerte actividad de salida de Mg2 más mientras que CNNM3 no tiene actividad de salida de Mg2 más l5, realizamos una eliminación mediada por ARN de interferencia pequeña (ARNip) de Cnnm2, Cnnm4 o ambos. La eliminación de Cnnm2 aumentó los niveles intracelulares de Mg plus ([Mg plus]), y la eliminación simultánea de Cnnm4 condujo a la ligera elevación del [Mg2] promedio; valor que no fue estadísticamente significativo. A continuación examinamosTrpm6expresión por qPCR y encontró una disminución significativa después de la caída de Cnnm2 y una disminución mucho mayor después de la doble caída de Cnnm2 y Cnnm4. Por lo tanto,Trpm6la expresión parece estar regulada negativamente por los niveles intracelulares de Mg2 plus, lo que es coherente con los informes anteriores23. Para examinar directamente la importancia de Mg2 plus, cultivamos células MDCT en medios con varias concentraciones de Mg2 plus .1h, la disminución de la concentración extracelular de Mg2 plus condujo a la reducción del nivel intracelular de Mg2 plus y al aumento deTrpm6expresión, lo que sugiere un papel supresor de Mg2 plus. En el caso de las células MDCT de doble eliminación (Cnnm2/Cnnm4),Trpm6expresión se suprimió con la disminución de Mg2 más

más concentraciones hasta 0.2 mm, pero reducciones adicionales cancelaron el efecto supresor; tanto Mg2 plus intracelular comoTrpm6los niveles no fueron significativamente diferentes de las células transfectadas con siRNA de control en ambas condiciones 0.1 y 0.02 mM. Estos resultados indican un mecanismo regulador dependiente de Mg2 plus deTrpm6expresión que explica laTrpm6regulación a la baja en los riñones de ratones deficientes en Cnnm2-.

Interrupción condicional deTrpm6 (potencial receptor transitorio relacionado con melastatina 6)en el riñón. A continuación, nos propusimos generarTrpm6-ratones deficientes para investigar más a fondo la importancia deTRPM6en la regulación depresión arterial. Utilizamos un clon de células madre embrionarias (ES) que lleva un recombinanteTrpm6alelo (Trpm6-) que contiene una secuencia aceptora de empalme, forzando el empalme prematuro del ARNm y dando como resultado un ARNm truncado después del exón 6. Se obtuvieron ratones heterocigotos quiméricos mediante inyección de blastocistos de las células ES y se confirmó la recombinación por PCR. Los cruzamosTrpm6más /- ratones, pero noTrpm6-/--off_fueron obtenidos. Este resultado es consistente con informes previos que muestran letalidad embrionaria enTrpm6-ratones deficientes24,25

Por lo tanto, realizamos una interrupción condicional específica del riñón deTrpm6usando Six2-Cre, que permite la expresión eficiente y específica de la recombinasa Cre fusionada con GFP en el riñón embrionario.Trpm6fl/, Six2-Cre ratones (específicos de riñónTrpm6-ratones deficientes) nacieron en la relación mendeliana esperada. Para determinar la expresión deTRPM6, realizamos análisis de inmunotransferencia utilizando un anti-TRPM6anticuerpo.TRPM6los niveles de proteína se redujeron considerablemente en los riñones deTrpm6fl/fl, ratones Six2-Cre, pero no se observaron cambios significativos en otros órganos. Los análisis de tinción de inmunofluorescencia tampoco mostraron expresión deTRPM6en células DCT positivas para NCC. No observamosTRPM6-señal positiva en más de 100 grupos de células positivas para NCC, lo que sugiere queTRPM6la expresión se suprime casi por completo en las células DCT de Trpmfi/; Seis2-ratones Cre. Estos resultados confirman la exitosa generación de riñón específicoTrpm6-ratones deficientes.

En primer lugar, examinamos el efecto de la función renal específicaTrpm6-deficiencia en la homeostasis del magnesio. Mantuvimos ratones en jaulas metabólicas y recolectamos muestras de orina y suero, que luego se sometieron a cuantificación colorimétrica de los niveles de magnesio utilizando Xylidyl Blue-I. Los niveles de magnesio sérico fueron significativamente más bajos enTrpm6l/l; Seis2-ratones Cre en comparación con los del controlTrpm6más / más ; Six2-Cre ratones, mientras que los niveles de magnesio en orina eran más altos. También realizamos análisis de espectroscopia de emisión de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-ES) para medir varios elementos metálicos principales en el suero y descubrimos que solo los niveles de magnesio se vieron afectados significativamente en Trpmd/; Seis2-ratones Cre. Estos resultados indican claramente que los ratones con deficiencia de Trpm6-específica de riñón tienen hipomagnesemia con pérdida renal de magnesio, como se observa en ratones con deficiencia de Cnnm2-específica de riñón4.

Falta de variación circadiana desangrepresióny actividad de renina. A continuación, sometimosTrpm6Illinois; Seis2-ratones Cre parasangrepresiónMediciones mediante radiotelemetría. sistólica y diastólicapresión arteriallos valores fueron significativamente más bajos enTrpm6l/; Six2-Cre ratones que en los ratones de control. Cabe señalar que la variación circadiana habitual depresión arterial, con valores altos durante el período de oscuridad y valores bajos durante el período de luz en ratones, no se observó enTrpm6Florida; Seis2-ratones Cre. Para examinar si el ritmo circadiano avanza normalmente, utilizamos radiotelemetría para medir la actividad locomotora de los ratones y confirmamos una variación circadiana muy clara enTrpm6l/; Seis{{0}}ratones Cre. También examinamos los niveles sanguíneos de vasopresina (AVP) y los niveles de ARNm de dos genes de reloj Bmall y Per2 en el cerebro y el riñón; se sabe que todos muestran una variación circadiana típica27,28. Analizamos en seis puntos de tiempo diferentes (a las 0,4,8 veces zeitgeber (ZT) para el período de luz y a las 12,16,20 ZT para el período de oscuridad). Los ratones de control muestran patrones circadianos claros de su expresión como se informó previamente28 y, nuevamente, no encontramos anomalías significativas enTrpm6/Illinois; Seis2-ratones Cre. También verificamos el nivel de expresión de Trpm7, que codifica un canal permeable a Mg2 plus estrechamente relacionado conTRPM6, en el riñón. Los patrones de expresión fueron muy similares en ambosTrpm6más / más ; Seis2-Cre y Trpm6f/; Seis ratones2-Cre y no mostraron patrones circadianos claros. Colectivamente, concluimos que el ritmo circadiano procede normalmente enTrpm6i; Seis2-ratones Cre. Se ha considerado quesangrepresiónla elevación durante el período activo (el período de oscuridad para los ratones y el período de luz para los humanos) tanto en humanos como en ratones se produce en respuesta a un aumento en la secreción de renina en la sangre2. Medimos la actividad de la renina en muestras de sangre recolectadas en los seis puntos de tiempo diferentes descritos anteriormente. Se observó un claro aumento en la actividad de la renina en sangre durante los períodos de oscuridad en las muestras de los ratones de control, pero no se observó un aumento significativo en las muestras de los ratones de control.Trpm6/lSeis2-ratones Cre. También medimos el nivel sanguíneo de noradrenalina, cuya liberación se sabe que está estimulada por la activación del sistema renina-angiotensina29,30. Como era de esperar, su variación circadiana también desapareció enTrpm6, Seis2-ratones Cre. Mientras tanto, el nivel de proteína del angiotensinógeno en sangre (AGT), otra molécula limitante de la velocidad para activar el sistema renina-angiotensina en ratones31, no se vio afectado porTrpm6 deficiencia. Los resultados sugieren que la alteración de la variación circadiana de la renina es importante para la pérdida de la variación circadiana desangrepresiónporTrpm6-deficiencia.

la proximidad deTRPM6células que expresan a células secretoras de renina. La renina se expresa y es secretada por las células JG en el riñón17,18. Las células JG están en contacto directo con la mácula densa, que se encuentra adyacente al DCT y estimula la secreción de renina de las células JG en respuesta a la reducción de los niveles urinarios de Cl18. La tinción de inmunofluorescencia para renina y óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS), un marcador de la mácula densa, no mostró anomalías ni en el patrón ni en la intensidad de las señales positivas observadas cerca de los glomérulos enTrpm6F/; Seis2-ratones Cre. Por lo tanto, las células directamente involucradas en la secreción de renina y su regulación no parecen verse marcadamente afectadas porTrpm6deficiencia. ComoTRPM6se coexpresa con NCC en el DCT, a continuación examinamos la relación espacial entreTRPM6/Células que expresan NCC (DCT) y la mácula densa o células JG. Las imágenes confocales de secciones sagitales de DCT mostraron casi una superposición completa deTRPM6y señales NCC a lo largo de la DCT. Luego teñimos para nNOS y NCC, y encontramos que las áreas positivas para nNOS y NCC están conectadas, sin superposición de señal. Además, la doble tinción para renina yTRPM6/NCC reveló que algunosTRPM6Las células que expresan NCC están cerca de las células JG que expresan renina, lo que sugiere queTRPM6Las células que expresan /NCC, así como la mácula densa, pueden tener un impacto significativo en la secreción de renina.

Alteración de la secreción de renina porTrpm6 (potencial receptor transitorio relacionado con melastatina 6)deficiencia. En general, el sistema nervioso autónomo juega un papel crucial en la orquestación de la progresión del ritmo circadiano. Se cree que la secreción de renina de las células JG durante el período activo es estimulada por la noradrenalina secretada por las neuronas simpáticas renales32. Para investigar directamente el efecto de dicha estimulación sobre la secreción de renina, preparamos rodajas de riñón y las estimulamos con isoproterenol, un agonista de los receptores adrenérgicos (AR). Los resultados mostraron una disminución muy clara en la señal positiva de renina que quedaba en el corte después de la estimulación con isoproterenol durante 30 min. Los análisis cuantitativos mostraron que el porcentaje de glomérulos rodeados por una señal positiva de renina disminuyó de aproximadamente un 80 por ciento a un 30 por ciento después de la estimulación con isoproterenol, lo que indica la aparición de una secreción masiva de renina. Sin embargo, no observamos un efecto significativo de la estimulación con isoproterenol sobre la señal de renina en cortes de riñón deTrpm6/1; Seis2-ratones Cre. Para confirmar el resultado, también medimos la actividad de renina en sangre después de la administración de isoproterenol. Los resultados muestran que solo se observó una elevación significativa de la actividad de la renina en sangre en los ratones de control, mientras que el aumento de la frecuencia cardíaca se observó comúnmente en ambas cepas. Estos resultados implican que las células JG secretoras de renina no pueden responder a la estimulación de las neuronas simpáticas renales, en consonancia con la desaparición del aumento circadiano desangrepresióny la actividad de la renina enTrpm6l/Florida; Seis2-ratones Cre.

Las células JG también pueden estimularse para que secreten renina en respuesta a las prostaglandinas, entre las cuales se considera que la prostaglandina E2 (PGE2) es la más importante, ya que es secretada fisiológicamente por las células de la mácula densa cuando los niveles urinarios de Cl- disminuyen17,18. Además, también se sabe que el tratamiento con PGE de cortes de riñón puede estimular la secreción de renina de manera eficiente33. La estimulación de las células JG con PGE2 e isoproterenol comúnmente activa la producción de AMPc, lo que finalmente provoca la secreción de renina. Por lo tanto, también probamos el efecto de PGE, y el análogo de cAMP permeable a la membrana, dibutilil-cAMP (db-cAMP). PGE2 y db-cAMP estimularon con éxito la secreción de renina en rodajas de riñón de Trpmdi/A, Six2- Cre ratones y ratones de control. Esto indica queTrpm6 la deficiencia no anula la maquinaria general involucrada en la detección de señales externas, la transmisión de señales intracelulares y la ejecución de la secreción de renina, pero afecta específicamente la respuesta a -AR.

Disminución de la expresión -AR en células JG porTrpm6 (potencial receptor transitorio relacionado con melastatina 6)deficiencia. Deterioro de la respuesta del receptor -ARTrpm6l/l; Seis ratones2-Cre nos llevaron a investigar el estado de la expresión del receptor -AR y, por lo tanto, realizamos inmunofluorescencia de 1-AR, el principal subtipo -AR expresado en células JG34. Como se informó anteriormente34, encontramos el patrón de tinción en forma de banda en las secciones renales de los ratones control y Trpmdi/l, Six2-Cre. Se sabe que 1-AR se expresa fuertemente tanto en los vasos sanguíneos como en las células JG34, y consistentemente, las 1-células positivas para AR al final de la tinción en forma de banda en el riñón de ratón de control también fueron positivas para la tinción con renina (se muestra con una punta de flecha). Por el contrario, la tinción de Trpm6l/fl; El riñón de ratón Six2-Cre mostró un número más pequeño de células doblemente positivas de 1-AR/renina, lo que sugiere que la expresión de 1-AR se redujo en las células JG. Para corroborar este hallazgo, aislamos células JG utilizando el método de centrifugación en gradiente de densidad de Percoll de acuerdo con el informe anterior35. Los análisis de inmunotransferencia revelaron que las células JG positivas para renina están enriquecidas en la fracción de la banda 3, lo cual es consistente con su informe35, y 1-la expresión de AR en esta fracción de la banda 3 fue específicamente mucho más baja en Trpmdi/1; Seis2-ratones Cre. En conjunto, encontramos queTrpm6la deficiencia disminuye el nivel de expresión de 1-AR en las células JG, lo que es consistente con la alteración de la secreción de renina.

El efecto de la intervención artificial en el ritmo circadianosangrepresiónvariación. En el conjunto final de experimentos, probamos el efecto de varias intervenciones en el ciclo circadiano.sangrepresiónvariación. Para confirmar la importancia de la renina, administramos un inhibidor de renina clínicamente disponible aliskiren36 a ratones de tipo salvaje. Me gustaTrpm6ablación, la administración de aliskiren mediante la implantación quirúrgica de una minibomba osmótica suprimió significativamente el ritmo circadianosangrepresiónvariación. A continuación, realizamos operaciones de denervación renal, ya que la activación de -AR en las células JG a través del sistema nervioso simpático es la principal vía para estimular la secreción de renina de manera circadiana2. Una vez más, encontramos que la intervención suprimió lasangrepresiónvariación. Estos resultados están de acuerdo con nuestro modelo de que los defectos en la respuesta -AR y la secreción de renina son responsables de la pérdida depresión arterialvariación en Trpmdl/l; Seis2-ratones Cre.

También probamos el efecto de elevar el contenido de magnesio en la dieta. Para este propósito, los ratones de tipo salvaje fueron alimentados con una dieta alta en Mg que contenía 0.6 por ciento (dieta normal:0.3 por ciento de magnesio) durante 1 mes. Como era de esperar, esos ratones mostraron niveles elevados de Mg en sangre. A continuación, comprobamos el nivel de expresión deTRPM6en DCT; disminuyó drásticamente al alimentar una dieta alta en Mg, y el grado de disminuciónTRPM6la expresión fue mayor que la ablación renal de Cnnm2. Cuando medimos lapresión arterialen estos ratones, encontramos que los ratones alimentados con una dieta alta en Mg mostraron significativamente menorsangrepresiónvariación queTrpm6-ratones deficientes, lo cual es consistente con nuestra noción de que los riñonesTRPM6es importante para el ritmo circadianopresión arterialvariación.

Tabla 1 Genes que estaban regulados al alza o a la baja en los riñones de Cnnm2flfl/flfl; Seis2-ratones Cre.

Discusión

En este estudio demostramos la importancia deTRPM6 (potencial receptor transitorio relacionado con melastatina 6)en la regulación depresión arterial. En particular, mostramos la desaparición casi completa de la variación circadiana depresión arterialen riñón específicoTrpm6-ratones deficientes. También encontramos que la secreción de renina, una hormona clave que orquesta la presión arterial, se anuló severamente enTrpm6-ratones deficientes, lo cual es consistente con lo observadopresión arterialfenotipo. Varios informes han demostrado que TRPM7, otro canal permeable al Mg2 plus muy similar alTRPM6, también afecta la presión arterial37,38. TRPM7 evita el aumento depresión arterialtras la administración de Angiotensina II mediante la supresión de la respuesta de las células endoteliales vasculares a la Angiotensina II37. Por el contrario, recientemente se informó que TRPM7 también facilita la elevación depresión arterialtras la administración de leptina mediante la mediación de la entrada de Mg2 plus en las células del cuerpo carotídeo38. Así, el papel de TRPM7 enpresión arterialla regulación es ambigua. Sin embargo, dado que el nivel de expresión de TRPM7 en el riñón no se vio afectado por laTrpm6ablación (Fig. 5 complementaria), parece que TRPM7 no está directamente involucrado en los fenotipos observados en este estudio.

Como se observó en ratones deficientes en Cnnm2-,presión arteriallos valores se redujeron enTrpm6-ratones deficientes (Fig.2)14. Sin embargo, cabe señalar que hubo una clara diferencia entre estos ratones. Disrupción de cnnm2 generalmente reducidapresión arterial, pero la variación circadiana todavía era claramente observable. En cambio, esta variación desapareció enTrpm6-ratones deficientes. Tal diferencia cualitativa también es consistente con nuestra observación de que la variación circadiana de la renina se conservó en ratones deficientes en Cnnm2- (Figura 9 complementaria). Cabe señalar que tanto CNNM2 comoTRPM6se cree que son importantes para la reabsorción renal de Mg2 plus al mediar el transporte vectorial de Mg2 plus a través del DCT y, de hecho, los ratones deficientes en cualquiera de los genes exhibieron un fenotipo idéntico de Mg2 plus renal (Fig. 1 y ref. 39). La diferencia cualitativa depresión arterialfenotipo entre Cnnm2-yTrpm6-ratones deficientes sugiere que el transporte de Mg2 plus en el DCT, la función común de las dos moléculas, no está directamente involucrada en la variación circadiana depresión arterialy la secreción de renina, lo que sugiere que el papel independiente de CNNM2-deTRPM6subyace a estos intrigantes fenotipos.

Varios mecanismos trabajan para estimular la secreción de renina de las células JG para mantenerpresión arterial. Entre ellos, se considera que la entrada de las neuronas simpáticas renales juega el papel principal en el aumentopresión arterialdurante el período activo de variación circadiana32. Estas neuronas secretan noradrenalina, que se une y activa -AR en las células JG para estimular la producción de AMPc, lo que en última instancia conduce a la secreción de renina1732. En nuestros experimentos utilizando rodajas de riñón obtenidas deTrpm6-ratones deficientes, la estimulación con isoproterenol, un agonista de -AR, no mostró ningún efecto sobre la secreción de renina, mientras que la estimulación con PGE2 o db-cAMP aumentó eficazmente la secreción de renina (Fig. 4). La PGE2 es secretada por la mácula densa en respuesta a niveles bajos de Cl- urinario y activa los receptores EP2 y EP4 en las células JG, que, al igual que la activación de -AR, finalmente estimula la producción de cAMP40. Por lo tanto, estos resultados implican que la señalización -AR se anula selectivamente en las células JG deTrpm6-ratones deficientes, sin afectar la vía de señalización mediada por AMPc corriente abajo. De manera consistente, la inmunofluorescencia de secciones de riñón de ratón y la inmunotransferencia de células JG aisladas revelaron que la expresión de -AR disminuyó significativamente en las células JG deTrpm6-ratones deficientes (Fig. 5). Tal expresión reducida de -AR debería hacer que las células JG sean incapaces de secretar renina en respuesta a la estimulación del nervio simpático durante el período activo, eliminando así la variación circadiana del nivel de renina en sangre ypresión arterial. Cabe señalar que hay un estudio que utilizó 1/ 2-ratones knockout AR, que mostró una disminución del ritmo circadianopresión arterialvariación comoTrpm6-ratones deficientes41. Lo atribuyeron a la disminución de la actividad locomotora, pero sigue siendo posible que la reducción de la variación circadiana de la actividad de la renina contribuya a la disminución de la variación circadiana de la actividad de la renina.presión arteriale. Alternativamente, el fondo inusual de sus ratones (fondo mixto de C57BL6/J, 129 y VFB; usamos fondo C57BL6/ puro) podría enmascarar el efecto de -AR enpresión arterialvariación; antecedentes genéticos son críticos para el ritmo circadianopresión arterialvariación42.

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como la perdida deTRPM6 (potencial receptor transitorio relacionado con melastatina 6)en las células DCT conduce a la disminución de la expresión de -AR en las células JG sigue siendo difícil de alcanzar. Los experimentos que utilizan otros tipos de células han demostrado que la expresión de -AR está regulada por varias moléculas conocidas por mediar en la señalización intercelular: La adición de glucocorticoides al medio de cultivo de la línea celular derivada del conducto deferente DDT1 MF-2 aumenta la expresión de -AR43. Además, se informó que el óxido nítrico (NO) suprimió la degradación de -AR en células cardíacas a través de la S-nitrosilación de GRK24. Entre estas moléculas, cabe destacar que el NO es secretado por las células de la mácula densa renal, estimulando las células JG de forma paracrina para aumentar la secreción de renina45. Mientras que la expresión de nNOS, la enzima productora de NO en el riñón, está restringida a las células de la mácula densa, están en contacto directo con las células DCT, el siguiente segmento del túbulo renal6. Así, es posible queTrpm6-la deficiencia en las células DCT conduce a la disminución de la expresión de -AR en las células JG al afectar la producción o liberación de NO de las células adyacentes de la mácula densa.

Se sabe que las células JG también se comunican con otras células formando uniones comunicantes con las células circundantes, como las células mesangiales, y reciben Ca2 plus para suprimir la secreción de renina7. Aunque las células JG y las células DCT no se contactan directamente entre sí, todavía están ubicadas muy cerca (ref. 46 y Fig. 3) y es posible que estas células usen comunicaciones de uniones comunicantes a través de células intermedias, como las células mesangiales; se informa que los tres tipos de células expresan Cx3747,48, una isoforma de conexina que se oligomeriza y constituye uniones comunicantes. Un análisis adicional puede identificar la molécula y la ruta responsable de la señalización intercelular entre las células DCT y JG, lo cual es importante para revelar el mecanismo general de la alteración del ritmo circadiano.presión arterialvariación porTrpm6-deficiencia.

EnTrpm6-ratones deficientes, la variación circadiana de los niveles sanguíneos no solo de renina sino también de noradrenalina desapareció. La activación del sistema renina-angiotensina estimula la liberación de noradrenalina al torrente sanguíneo29,30, por lo que parece razonable que el efecto deTrpm6 (potencial receptor transitorio relacionado con melastatina 6)la ablación de los niveles de renina y noradrenalina en sangre fue similar. Dado que la noradrenalina también actúa sobre el -AR de las células JG para promover la secreción de renina, se supone que las dos moléculas constituyen un circuito de retroalimentación positiva, estimulando la secreción de la otra. Sin embargo, cabe señalar que los resultados de los experimentos de administración de isoproterenol muestran explícitamente el defecto en la secreción de renina (Fig. 4) y, por lo tanto, parece ser la causa principal de la pérdida de la variación circadiana tanto de la renina como de la noradrenalina.

Hasta el momento, se han desarrollado y utilizado una variedad de fármacos eficaces para tratar a pacientes hipertensos. Sin embargo, un número significativo de pacientes muestran resistencia a los tratamientos convencionales que utilizan una combinación de fármacos antihipertensivos mayoritarios de diferentes mecanismos funcionales4. La denervación quirúrgica de las neuronas simpáticas renales mediante catéteres endovasculares se ha realizado a modo de prueba para tratar dicha hipertensión resistente50. Su eficacia práctica para mejorarpresión arterialha sido controvertido51,52, pero estudios publicados recientemente han demostrado una reducción significativa enpresión arterialen comparación con controles simulados53,54. También hay resultados mixtos sobre el efecto de la denervación renal en la variación circadiana depresión arterial. Algunos informes mostraron que el grado depresión arterialLa disminución por denervación renal fue mayor durante los períodos activos53, pero otros no informaron cambios en la variación circadiana depresión arterial55,56. En el análisis con animales de laboratorio, nuestras operaciones de denervación renal en ratones suprimieron la variación circadiana depresión arterial(Fig. 6). También se realizaron operaciones similares contra ratas, pero incluso las ratas de tipo salvaje de control casi no muestran cambios circadianos.presión arterialvariación en primer lugar57,58, lo que dificulta la evaluación del efecto de la operación. Se requieren más estudios para aclarar el impacto de la denervación renal en el ciclo circadiano.presión arterialvariación, que también nos ayudaría a comprender el mecanismo más detallado depresión arterialdesregulación porTrpm6-deficiencia.

Medidas telemétricas depresión arterial, frecuencia cardiaca y actividad locomotora. Medidas telemétricas depresión arterialse realizaron de la siguiente manera4.Presión arterialSe insertaron quirúrgicamente transductores (TAl1PA-C10, Data Sciences International) en la arteria carótida común izquierda de ratones de 2- a 3-meses de edad bajo anestesia (mediante administración intraperitoneal de 0,3 mg/l). kg de medetomidina, 4 mg/kg de midazolam y 5 mg/kg de butorfanol). Después de 3 semanas de recuperación, sistólica y diastólicapresión arteriallos valores se registraron con un muestreo programado de 2-min cada 60 min utilizando el software Dataquest ART (Data Sciences International). Se obtuvieron registros durante al menos cinco días consecutivos, y se determinaron los promedios de las mediciones tomadas a la misma hora cada día para cada ratón y se usaron para análisis estadísticos adicionales, excepto para la Fig. 4 complementaria. Basado en Nakamori et al.68, renal la denervación se realizó 2 semanas antes de la inserciónpresión arterialtransductores de la siguiente manera. Se expusieron los riñones mediante una incisión abdominal y se diseccionó el tejido conjuntivo alrededor de los vasos renales. Luego, los vasos renales se sumergieron en etanol al 95 por ciento durante 2 min y, posteriormente, en PBS durante 2 min. La operación simulada se realizó utilizando el procedimiento equivalente sin inmersión en etanol. Se administró aliskiren 25 mg/kg/día mediante la inclusión subcutánea de una bomba osmótica (1004, ALZET), y el registro se inició desde el día siguiente a la introducción de la bomba. Para la suplementación con magnesio, los ratones recibieron una dieta enriquecida con magnesio que contenía 0,6 por ciento de magnesio (CLEA Japón) durante 1 mes antespresión arterialmedición.

La frecuencia cardíaca se midió con el mismo sistema de radiotelemetría, excepto que el registro se realizó con un muestreo programado de 30-s cada minuto, y se utilizó una sola medición para análisis posteriores.

Las actividades locomotoras se evaluaron usando el mismo sistema de radiotelemetría, monitoreando los cambios en la intensidad de la señal del transductor debido a la locomoción del animal. En este caso, los transductores se insertaron quirúrgicamente en el espacio subcutáneo en el flanco derecho. Las grabaciones se realizaron con los mismos intervalos de tiempo descritos anteriormente.

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Referencias

1. Giles, TDCritmo circadiano depresión arterialy la relación con los eventos cardiovasculares.J. hipertensos. 24, S11-S16 (2006).

2. Smolensky, MH, Portaluppi, F. y Hermida, RC enPresión arterialMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3.er EDT.(eds White, WB)Part II, Ch.6, 105-128(Springer,2016).

3. Witteman, JC et al. Un estudio prospectivo de factores nutricionales e hipertensión entre mujeres estadounidenses. Circulación 80,1320-1327(1989).

4. Ascherio, A. et al. Un estudio prospectivo de factores nutricionales e hipertensión entre hombres estadounidenses. Circulación 86,1475-1484(1992).

5. Ascherio, A. et al. Estudio prospectivo de factores nutricionales,presión arteriale hipertensión entre las mujeres estadounidenses. Hipertensión 27,1065-1072(1996).

Nota:lo anterior no es una lista completa de referencias