El estado actual de la neuroprotección en las cardiopatías congénitas, parte 1

Abstracto:

La presencia de ADN ectópico en el citoplasma induce inflamación y muerte celular. Se ha informado ampliamente que la fuga de ADN nuclear hacia el citoplasma puede detectarse principalmente mediante la GMP-AMP sintasa cíclica (cGAS).

El ADN es la molécula que especifica la información genética de cada persona y se encuentra en cada una de nuestras células. Investigaciones recientes muestran que el ADN puede filtrarse al citoplasma a través de ciertas vías y afectar nuestra memoria.

Este fenómeno es común en adultos mayores y personas con deterioro cognitivo. Cuando el ADN se filtra al citoplasma, interfiere con las funciones normales dentro de la célula y aumenta el riesgo de pérdida de memoria y deterioro cognitivo.

Sin embargo, no tenemos por qué sentirnos deprimidos y desesperanzados por esto. Hay muchas formas de mejorar la memoria y las capacidades cognitivas para ayudarnos a mantener un cerebro sano.

En primer lugar, debes mantener un estilo de vida saludable. Esto incluye llevar una dieta equilibrada, dormir lo suficiente, hacer ejercicio moderado y reducir el estrés. Estas prácticas promueven la salud del cerebro, evitando así la fuga de ADN y mejorando la memoria.

En segundo lugar, se requiere entrenamiento cognitivo. Esto puede incluir jugar juegos de matemáticas, leer, aprender nuevas habilidades, etc. Estas actividades pueden ayudar a estimular el cerebro y promover la neurogénesis para evitar la fuga de ADN.

Finalmente, mantenga una actitud positiva. La inestabilidad emocional y el estrés excesivo pueden provocar cambios en la química cerebral que promuevan la fuga de ADN. Por tanto, debemos aprender a afrontar los retos de la vida de forma positiva y mantener una actitud optimista.

En resumen, aunque la fuga de ADN hacia el citoplasma puede afectar la memoria, podemos mejorar la salud del cerebro, evitar la fuga de ADN y, en última instancia, mejorar nuestra memoria adoptando el estilo de vida adecuado, realizando entrenamiento cognitivo y manteniendo una mentalidad positiva. Memoria y capacidades cognitivas. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche deserticola es un material medicinal tradicional chino que tiene muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de Cistanche deserticola proviene de los múltiples ingredientes activos que contiene, incluidos ácido tánico, polisacáridos, glucósidos flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro a través de una variedad de vías.

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Recientemente informamos que el ADN citoplasmático de doble cadena (ADNds) derivado de mitocondrias que ha escapado a la degradación lisosomal induce una citotoxicidad significativa en células cultivadas e in vivo. Se supone que el ADN mitocondrial citoplasmático está implicado en diversas enfermedades y trastornos, y cada vez se han publicado más artículos que lo confirman. Por otro lado, el método actual para evaluar el ADN mitocondrial en el citoplasma puede no ser cuantitativo.

Aquí, presentamos en detalle un método para evaluar el ADN mitocondrial ectópico en las células. Este método es útil en la investigación básica, así como en el estudio del envejecimiento, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la insuficiencia cardíaca, las enfermedades autoinmunes, el cáncer y otras afecciones.

Palabras clave: ADN ectópico; ADN mitocondrial; factor de transcripción mitocondrial A (TFAM); enfermedad de Parkinson.

1. Introducción

El ADN contiene información importante para la supervivencia y la herencia, y debe protegerse de diversos factores estresantes, incluidos oxidantes y mutágenos. Las células eucariotas contienen mitocondrias, que producen energía, junto con muchas especies activas de oxígeno, a través de la respiración aeróbica.

Así, en la célula eucariota, el ADN existe en el núcleo o en las mitocondrias, empaquetado dentro de la membrana nuclear o la membrana mitocondrial, respectivamente. Sin embargo, el ADN puede estar presente en el citoplasma bajo ciertas condiciones, como durante infecciones virales o no virales [1– 4].

Incluso en algunas afecciones no infecciosas (por ejemplo, envejecimiento o diversos trastornos relacionados con la edad o cáncer), el ADN puede filtrarse al citoplasma desde el núcleo o las mitocondrias [5-7].

El ADN en el citoplasma puede ser inflamatorio y tóxico para las células. Se ha informado ampliamente que la fuga de ADN nuclear al citoplasma induce inflamación, citotoxicidad y fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), principalmente a través de la vía del estimulador de la GMP-AMP sintasa cíclica (cGAS) de los genes del interferón (STING). 5,6].

Recientemente informamos que se demostró que el ADN citosólico de doble cadena (ADNds) de origen mitocondrial que escapa de la degradación lisosomal induce citotoxicidad y neurodegeneración en modelos celulares de la enfermedad de Parkinson [8]. La presencia o aumento de dicho ADN ectópico a menudo estaba indicado por imágenes microscópicas representativas y evidencia circunstancial, no por el aumento de la fuga de ADN en sí.

Se espera que la evaluación de este ADN ectópico sea cada vez más importante, no sólo para la investigación básica sino también para la investigación sobre el envejecimiento y otras enfermedades, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, la insuficiencia cardíaca, las enfermedades autoinmunes, la diabetes, esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y cánceres. Se ha informado que la vía cGAS-STING es crucial no solo en el envejecimiento sino también en la patogénesis de estas enfermedades [8-17].

Probablemente debido a las circunstancias oxidativas alrededor de las mitocondrias y a la falta de un sistema eficiente de reparación del ADN mitocondrial, el ADN mitocondrial es mucho más susceptible a mutaciones o daños que el ADN nuclear [18,19].

A diferencia del ADN nuclear, el ADN mitocondrial existe en múltiples copias en una sola célula y se sintetiza según sea necesario. Por lo tanto, el ADN mitocondrial podría tener muchas más posibilidades de filtrarse al citoplasma durante el envejecimiento o en condiciones malignas como trastornos relacionados con la edad, disfunción mitocondrial o cánceres.

La detección y medición de dicho ADN mitocondrial citoplasmático podría ser importante para comprender la patogénesis de diversas enfermedades y el envejecimiento y podría convertirse en un biomarcador y un objetivo terapéutico.

Desarrollamos un método semicuantitativo para evaluar la fuga de ADN mitocondrial ectópico al citoplasma, y ​​aquí describimos el método en detalle. Este artículo permite una evaluación objetiva de la fuga de ADN mitocondrial y es útil en el estudio de diversas patologías.

2. Materiales y métodos

2.1. Líneas celulares, tratamiento con ARNip y análisis de PCR cuantitativa (qPCR)

Las células HeLa se derivaron de células de cáncer de cuello uterino de una paciente (ATCC,CCL-2). Las células HeLa se cultivaron a 37 ◦C bajo 5% de CO2 en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (Biowest, Nuaillé, Francia) y una solución de penicilina-estreptomicina ( 100 unidades/ml de penicilina G y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina, Wako, Osaka, Japón).

Un día antes de la transfección, se sembraron células HeLa a una densidad de 600 células/μl. La expresión de genes de interés se silenció en células HeLa utilizando ARNip Stealth RNAi (factor de transcripción mitocondrial A, TFAM: HSS144251, glucocerebrosidasa, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, EE. UU.) en reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con instrucciones del fabricante (una concentración final de ARN de 10 nM).

Tres días después de la eliminación del ARNip, se aisló el ARN celular total utilizando el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific). Las plantillas de ADNc se sintetizaron a partir del ARN purificado utilizando el kit de síntesis de ADNc ProtoScript II First Strand (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.) con cebadores oligo (dT) 20. La qPCR se realizó utilizando TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu , Japón) y analizado en un termociclador Dice Real Time System Lite (Takara Bio). Los cebadores de PCR utilizados en el presente estudio fueron GBA directo (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA inverso (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM directo (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM inverso (GCATTCTGGGTTCTGAGCTTTA), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) directo (CAGCCTCAAGATCATCAGCA) y GAPDH. reverso (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Se utilizaron pruebas t de Student bilaterales para comparar medias aritméticas entre dos grupos. Los datos se presentan como medias y ± errores estándar de las medias.

2.2. Detección por inmunofluorescencia de ADN mitocondrial ectópico y análisis de imágenes

Un día antes de la transfección, las células HeLa se sembraron en placas a una densidad de 600 células/μL. La expresión de genes de interés se silenció en células HeLa usando ARNip Stealth RNAi (Thermo Fisher Scientific) en reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con el instrucciones del fabricante (una concentración final de ARN de 10 nM).

Tres días después de la eliminación del ARNip, las células se sometieron a tinción por inmunofluorescencia. Para la detección de ADN mitocondrial, anticuerpo anti-ADNbc (Abcam, Cambridge, Reino Unido, clon 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 o EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU., clon AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) mostró una mejor relación señal-ruido que Hoechst 33258, DAPI o Picogreen. Aquí combinamos tres anticuerpos primarios: anticuerpo anti-dsDNA (ADN 35I9) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), anticuerpo anti-histona-H2B (Abcam, Cat# ab134211) y anti-dsDNA. anticuerpo contra la proteína de choque-60 (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Se pueden elegir otros anticuerpos o marcarlos fluorescentemente con histona, o se puede usar Hsp60 alternativamente, pero es necesario optimizar las condiciones de triple tinción para cada combinación.

Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron con metanol helado durante 10 min a 4 ◦C. Como alternativa, se puede utilizar paraformaldehído (PFA) al 4% para la fijación, pero las señales de fondo parecen mucho mayor en muestras fijadas con PFA. Después de la fijación, las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (PBST) durante 5 minutos cada una. Las células se permeabilizaron con PBS que contenía Triton X-100 al 0,2 % (p/v) durante 10 min.

Después de lavarse tres veces con PBST durante 5 minutos cada vez, las células se incubaron con albúmina sérica bovina (BSA) al 2% (p/v) en PBST durante 30 minutos. Las células se incubaron con un anticuerpo primario único, anticuerpo anti-histona-H2B (1/400, Abcam, Cat# ab134211) diluido en BSA al 2% (p/v) en PBST O/N a 4 ◦C. Después de lavarse tres veces con PBST durante 5 minutos cada vez, las células se incubaron con Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) diluido en BSA al 2% (p/v) en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente (RT).

Después de lavarse tres veces durante 5 minutos cada vez con PBST, las células se incubaron con anticuerpos primarios y anticuerpo anti-ADNds (ADN 35I9) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) y anti -El anticuerpo Hsp60 (1/400, Abcam, Cat# ab46798,RRID: AB_881444) diluido en BSA al 2% (p/v) en PBST se aplicó durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche (O/N) a 4◦C.

Después de lavarse tres veces con PBST durante 5 minutos cada vez, las células se incubaron con IgG anti-Conejo de burro (H+L) conjugada con Alexa Fluor 680- de alta adsorción cruzada (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043). , RRID: AB_2534018) ​​y Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073) diluidos en 2 % (p/v) BSA en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente.

Las células se lavaron tres veces con PBST durante 5 minutos cada vez y la muestra se analizó utilizando un microscopio confocal A1R+ (Nikon, Tokio, Japón).

For more information:1950477648nn@gmail.com