El efecto del factor de crecimiento nervioso en el apoyo a la memoria espacial depende de la inervación colinérgica del hipocampo
Mar 17, 2022
Para más información:ali.ma@wecistanche.com
Resumen
La terapia génica del factor de crecimiento nervioso (NGF) se ha utilizado en ensayos clínicos de la enfermedad de Alzheimer. Comprender el mecanismo subyacente de cómo influye el NGFmemoriapuede ayudar a desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. Tanto el NGF como el sistema colinérgico juegan papeles importantes en el aprendizaje ymemoria. El NGF es esencial para mantener la inervación colinérgica del hipocampo, pero depende de si el efecto de apoyo del NGF en el aprendizaje y lamemoriadepende específicamente de la inervación colinérgica hipocampal intacta. Aquí caracterizamos el comportamiento y las mediciones del hipocampo de volumen, neurogénesis, potenciación a largo plazo e inervación colinérgica, en ratones con deficiencia de Ngf específicos del cerebro. Nuestros resultados muestran que los ratones knockout exhiben una mayor ansiedad, deterioro del aprendizaje espacial y la memoria, disminución del volumen del hipocampo adulto, neurogénesis, potenciación a corto plazo e inervación colinérgica. La sobreexpresión de Ngf en el hipocampo de ratones knockout para el gen Ngf fue rescatada espacialmentememoriay las inervaciones colinérgicas parcialmente restauradas, pero no la ansiedad. El agotamiento selectivo de la inervación colinérgica del hipocampo resultó en deterioro espacialmemoria. Sin embargo, la sobreexpresión de Ngf en el hipocampo no pudo rescatar espacialmemoriaen ratones con agotamiento de fibras colinérgicas selectivas del hipocampo. En conclusión, demostramos el impacto de la deficiencia de Ngf en el cerebro y proporcionamos evidencia de que el efecto de NGF en espacialmemoriadepende de inervaciones colinérgicas intactas en el hipocampo. Los resultados sugieren que un direccionamiento colinérgico adecuado puede ser un requisito crítico para el uso exitoso de la terapia génica de NGF para la enfermedad de Alzheimer.
Wei Zheng Eu1, Yu-Ju Chen1, Wei-Ting Chen1, Kuan-Yu Wu1, Cheng-Yu Tsai1, Sin-Jhong Cheng2,
Roderick N. Carter3 y Guo-Jen Huang 1,4,5
Introducción
El factor de crecimiento nervioso (NGF), un factor de crecimiento neurotrófico identificado por primera vez en la década de 1950, promueve el crecimiento de neuritas y estimula la diferenciación de células nerviosas en experimentos de cultivo1–3. En el cerebro, la expresión más alta de ARNm de Ngf se encuentra en el hipocampo4. El NGF activa dos receptores: el receptor de NGF de baja afinidad (receptor neurotrófico común, p75) y el receptor de NGF de alta afinidad (TrkA), que se expresan en las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal5,6 y se sabe que inervan la estructura del hipocampo7. La evidencia sugiere que el NGF se libera de las células diana y desencadena vías de señalización de forma retrógrada a lo largo del axón8. Existe un fuerte vínculo entre el NGF y el sistema colinérgico en el hipocampo. La inyección de NGF en los ventrículos laterales aumenta la actividad de la colina acetiltransferasa (ChAT) en el hipocampo9. Además, se ha demostrado que el NGF protege las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal después del daño axonal de las fibras de proyección del hipocampo10.
Click to Cistanche tubulosa beneficios y efectos secundarios para la memoria
Se han propuesto varias hipótesis sobre la causa de la enfermedad de Alzheimer. Una de ellas es la hipótesis del NGF11. Desde principios de la década de 1980, varios informes han demostrado que se produce una disfunción colinérgica significativa en personas mayores con demencia y que la degeneración neuronal colinérgica está asociada con déficits cognitivos en la enfermedad de Alzheimer1.
El nuevo radiotrazador 18F-fluoro etoxibenceno punto y coma de la tomografía por emisión de positrones (PET) ha proporcionado evidencia más reciente de que existe una pérdida terminal colinérgica más cortical en pacientes con enfermedad de Alzheimer13. Los estudios en animales también proporcionan evidencia de que la densidad de las inervaciones colinérgicas disminuye en ratas envejecidas y ratones transgénicos similares a la enfermedad de Alzheimer14,15. Además, los ratones anti-NGF envejecidos presentan fenotipos similares a los de la enfermedad de Alzheimer, como pérdida neuronal, déficit colinérgico y deterioro de la memoria espacial16. Un estudio reciente sugiere que la vía metabólica del NGF está alterada en pacientes con la enfermedad de Alzheimer, al encontrar que la maquinaria molecular para la maduración del proNGF está reducida mientras que la degradación del NGF maduro está mejorada17.
El sistema colinérgico central está implicado en el aprendizaje18,19 y el NGF parece desempeñar un papel importante en este apoyo. La infusión de NGF por vía intraventricular puede rescatar tanto el agotamiento colinérgico leve en el hipocampo como los déficits de memoria en ratones heterocigotos Ngf plus /− mutantes20. La evidencia también muestra que el NGF modula la fuerza de las proyecciones colinérgicas al hipocampo y afecta la plasticidad neuronal y la retención del comportamiento de aprendizaje espacial21. Sin embargo, se desconoce si los efectos del NGF sobre el aprendizaje dependen de estas proyecciones colinérgicas al hipocampo. La aclaración de esto puede proporcionar una mejor comprensión para desarrollar un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer. En este estudio, abordamos esta pregunta mediante el uso de ratones knockout condicionales (cKO) Ngf específicos del cerebro para revelar la importancia del NGF en la ansiedad y la memoria espacial. Además, encontramos que el efecto de NGF sobre la memoria espacial, pero no la ansiedad, requiere la proyección colinérgica al hipocampo.
Materiales y métodos
animales
Los experimentos se realizaron en cohortes de sexo equilibrado de 12-semanas de edad Ngf cKO y ratones compañeros de camada de tipo salvaje (WT). Se usaron ratones Ngf floxed del Centro Nacional de Animales de Laboratorio, Taiwán, (RMRC 13175) y ratones Sox1::Cre (Acc. No. CDB0525K)22 para generar Ngf flox/flox; Ratones Sox1::Cre en este estudio. hilo de flox/flox de NGF; Los ratones Sox1::Cre (cKO) y Ngf flox/flox (WT) usados en este estudio eran compañeros de camada generados cruzando Ngf flox/flox; Ratones Sox1::Cre con ratones homocigóticos Ngf flox/flox. Se usaron ratones C57BL/6Narl machos de doce semanas de edad para la denervación colinérgica del hipocampo. Los ratones se han criado en las condiciones libres de patógenos específicas certificadas por AAALAC. Se alojaron en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h a una temperatura de 22 grados y un nivel de humedad de 60 a 70 por ciento. Los animales tuvieron acceso ad libitum a alimento y agua. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las reglamentaciones locales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Chang Gung (Número de permiso: CGU105-033).
Pruebas de comportamiento
Para las pruebas de comportamiento, se registró y siguió el movimiento de los animales mediante un sistema de grabación de video. Los ratones para realizar el análisis de comportamiento se asignaron al azar a una jaula separada para la prueba, con ropa de cama, comida y agua, antes de ser transferidos de vuelta a la jaula de origen. Todos los laberintos están hechos de acrílico; no hay ropa de cama en el laberinto durante la prueba. Todos los datos de comportamiento fueron registrados y adquiridos automáticamente por el software Ethovision.
Campo abierto
Los ratones se colocaron en un campo abierto redondo con un radio de =45 cm y un círculo interior con un radio de =30 cm. Se les permitió moverse libremente durante 5 min y fueron rastreados por el software Ethovision.
Laberinto en cruz elevado
El aparato utilizado para la prueba del laberinto en cruz elevado (EPM) constaba de dos brazos abiertos (30 × 5 cm) y dos brazos cerrados del mismo tamaño, con paredes de 15 cm de altura. El laberinto se elevó 38 cm sobre el suelo. Los ratones se colocaron en el EPM durante 5 min con luz tenue y se midió el tiempo de permanencia en el brazo abierto.
Laberinto de agua de Morris
Esto se llevó a cabo en un tanque laberinto de agua redondo (110 cm de diámetro, 50 cm de profundidad) ubicado en una habitación iluminada. La piscina se llenó hasta una profundidad de 15 cm con agua opaca mediante la adición de pintura blanca no tóxica. Una plataforma de escape cuadrada (9 × 9 cm) se sumergió 0,5 am por debajo de la superficie del agua, en una posición fija en uno de los cuadrantes. Los ratones fueron entrenados durante 4 días. En cada día de entrenamiento, los ratones recibieron cuatro ensayos de entrenamiento. El intervalo entre ensayos fue de 15 min. En cada prueba, los ratones se colocaron en la piscina en una de las cuatro ubicaciones iniciales. A los ratones se les permitió nadar/buscar durante un máximo de 90 s o hasta que encontraron la plataforma, y se les permitió permanecer en la plataforma durante 30 s. Si el ratón no lograba encontrar la plataforma en una prueba determinada, se guiaba al ratón hasta la plataforma. Ocho días después de la última prueba, para la prueba de memoria, se retiró la plataforma del grupo y se permitió que el ratón la buscara durante los años 90. La adquisición y el análisis de datos se realizaron automáticamente, incluida la longitud de la ruta de natación de las pruebas de entrenamiento y el porcentaje de tiempo pasado en el cuadrante objetivo para la prueba de memoria.
Nuevo reconocimiento de objetos
Se permitió que los ratones se familiarizaran con dos cilindros acrílicos blancos idénticos (altura=9cm, diámetro= 5 cm) durante 15 minutos al día, durante 2 días. Los objetos estaban en un lugar fijo en una cámara blanca. Durante la fase de prueba del tercer día, uno de los objetos expuestos se reemplazó con un vaso de chupito gris (altura=8.7 cm, diámetro=5cm) fijado boca abajo en la cámara y el otro objeto fue reemplazado por un cilindro acrílico blanco nuevo pero idéntico. El software Ethovision recopiló y analizó el tiempo dedicado a explorar cada uno de los objetos.
Análisis volumétrico del hipocampo
Todas las imágenes por resonancia magnética (IRM) se realizaron con ClinScan 70/30 USR (Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania) con una bobina de matriz en fase adaptada a la cabeza del ratón. Se eligió una secuencia de eco de gradiente tridimensional (3D) para adquirir imágenes de múltiples cortes del cerebro con los siguientes parámetros: tiempo de repetición=30 ms; tiempo de eco=15 ms; ángulo de volteo=20";número de promedios=5; espesor de corte =0.2 mm; resolución en el plano=256×256; tamaño de vóxel=59×59 × 200 μm². El tiempo total de adquisición fue de alrededor de 15 minutos con 1-2 por ciento de isoflurano como anestésico. El volumen del hipocampo se midió con PMOD 3.2 (PMOD Technologies. Suiza). Los hipocampos se delinearon manualmente en 13 o 14 cortes coronales por animal; el volumen de cada corte se obtuvo multiplicando el área delineada por el grosor del corte (0,2 mm). El volumen total del cerebro se midió usando áreas delineadas manualmente en 19 cortes sagitales por animal, multiplicando el área delineada por el grosor del corte (0,2 mm). mm) Las imágenes se analizaron en las mismas condiciones de manera ciega.
cuantificación de ARNm
El tejido del hipocampo se recolectó de ratones WT y cKO, luego se homogeneizó en Trizol, seguido de extracción con fenol-cloroformo del ARN total. Luego se hizo cDNA usando transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen). Los experimentos se realizaron por duplicado. A continuación, se calcularon los niveles de expresión génica con el método △ACt y se normalizaron frente a un control Gapdh. Ng-Adelante: 5'-TTCTA TACTG GCCGC AGTGA-3; Ngf-Reverse 5-TTAGT CCAGT GGGCT TCAGG-3'
Ensayo de corticosterona
Las muestras de sangre se recolectaron entre las 7:30 y las 8:00 pm mediante punción en la vena facial y se recogieron en tubos Microvette" CB300 LH. El plasma se separó de la sangre total mediante centrifugación y se almacenó en tubos de centrífuga a{{5} }"C hasta que se analice. Para analizar, las muestras se diluyeron en tampón (1/40), luego se analizaron con un kit EIA de corticosterona (Enzo Life Sciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se describió anteriormente.
Preparación de vectores virales e inyecciones intrahipocampales
Para el experimento de sobreexpresión de Ngf, fragmentos de ADN que codificaban Ngf (RefSeq NM 013609) o mejorados. Las proteínas fluorescentes verdes (eGFP) se crearon mediante PCR y se subclonaron en el sitio Note de una construcción de virus AAV9. Los vectores AAV9 recombinantes se produjeron mediante un método estándar de transfección de triple plásmido y se purificaron mediante dos rondas de centrifugación Csd. Los títulos de vectores físicos de AAV se cuantificaron midiendo el número de genomas de vectores empaquetados utilizando un método de PCR en tiempo real.
Para las inyecciones de vectores virales, la cirugía se realizó bajo anestesia (una mezcla de Zoletil-Rompun). Los ratones recibieron inyecciones bilaterales de vectores virales en el hipocampo en un volumen de 1,5 ul bajo guía estereotáxica. Hubo cuatro sitios de inyección en total (para el hipocampo dorsal, Anterior-Posterior (AP)-22 mm. Medial-Lateral (ML)±2.0 mm desde el bregma, y Dorsal-Ventral ( DV)-1.8mm desde la dura; para hipocampo ventral, AP-3.0mm, ML ±3.0, y DV-3 0,3 mm). La concentración final del vector AAV inyectado fue de 3,1 ×10 12vg/ml.
Inmunohistoquímica/hibridación in situ y cuantificación
Todas las secciones para el etiquetado de Ki67, Doublecortin (DCX, 5-Bromo-2'-desoxiuridina (BrdU)/NeuN y ChAT se cortaron a un grosor de 40μm en un micrótomo deslizante Las secciones se montaron en portaobjetos SuperFrost y se secaron durante la noche. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron en tampón cítrico 0,01 mol/l durante 20 min a 90 °C, 3 % HaO, durante 10 min, se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubó durante la noche a temperatura ambiente con anticuerpo anti-Ki67 de conejo (1:3000, Abcam), anticuerpo anti-DCX de conejo (1:4000, Abcam) y anticuerpo anti-ChAT (1:200, Abcam). Se usó el procedimiento estándar del kit ABC de IgG de conejo (Vector Lab) y los portaobjetos reaccionaron durante 5-10min con una tableta Sigma DAB. Luego, las secciones se cubrieron con cubreobjetos con DPX.
Para el doble marcaje de BrdU/NeuN, las secciones se incubaron en HCl 2N durante 15 minutos a 37 °C, se neutralizaron en borato de sodio (Sigma) durante 10min (pH 8,5) y se lavaron tres veces en PBS antes de la incubación con ratas. anti-BrdU (1:1500, Abcam) y anti-NeuN de ratón (1:1000, Millipore).Después de tres lavados en PBS (5 min cada uno), las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario fluorescente (1:250, Alex Fluor 488 y Texas Red, Invitrogen) durante 2 horas en Triton/PBS al 0,3 por ciento con suero de cabra al 2 por ciento.
Para la hibridación in situ de Ngf, se utilizó la sonda Ngf (número de catálogo 565131) y el kit de reactivos RNAscope 2.5 HD Brown (Advanced Cell Diagnostics, EE. UU.), y la tinción se realizó de acuerdo con el manual del producto. Brevemente, los portaobjetos se incubaron en tampón de recuperación 1X durante 5 min a 100 grados C, 3 por ciento H, O, durante 10 min y se enjuagaron en tampón de lavado 1X. A continuación, los portaobjetos se incubaron en proteasa durante 20 minutos y, posteriormente, la sonda objetivo durante 2 horas a 40 °C. Después de una serie de amplificaciones, se utilizó DAB para visualizar el ARN.
Se contaron las células marcadas con DCX, Ki67- y doblemente marcadas con BrdU/NeuN en cada octava sección a través de toda la extensión rostrocaudal de la capa de células granulares (seis secciones por animal). A continuación, el número de células contadas se multiplicó por 16, para obtener una estimación del número total de células positivas para DCX, Ki67 y BrdU en la circunvolución dentada. Todos los portaobjetos se aleatorizaron y codificaron antes del análisis cuantitativo. Los somas celulares marcados con ChAT se contaron cada dos secciones a través de la extensión rostrocaudal del núcleo del brazo vertical de la banda diagonal (VDB) y el tabique medial (MS) (cuatro secciones por animal). Para obtener una imagen representativa del doble etiquetado BrdU/NeuN, primero se adquirió una imagen de pila z (siete cortes en la pila) con un objetivo x40, seguida de desconvolución 3D con modo iterativo rápido utilizando el software Axiovision Microimaging (Carl Zeiss).
Las fibras colinérgicas se visualizaron en la tinción de ChAT y se examinaron en el campo oscuro, con un objetivo de ×10 (Axio Imager 2, capturado por Nikon D5100). La densidad de la fibra se cuantificó como la intensidad media (valor gris medio) de la señal con umbral bajo el área del hipocampo con la imagen 142g (NIH). La densidad de la fibra colinérgica del hipocampo se cuantificó unilateralmente en cada octava sección a lo largo de toda la extensión rostrocaudal de todo el hipocampo.
Electrofisiología en cortes de hipocampo
Los cortes de hipocampo (450 um de espesor) se cortaron transversalmente con un cortador de tejido vibratorio (DSK Microslicer DTK-1000; Dosaka EM, Kioto, Japón). Se permitió que los cortes se recuperaran durante al menos 120 min y se transfirieron a una cámara de grabación de tipo inmersión montada en un microscopio vertical (BX51Wl; Olympus Optical, Kyoto, Japón) equipado con un video microscópico de contraste de interferencia diferencial infrarrojo. Se perfundió líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (5 por ciento de CO,/95 por ciento de O) que contenía picrotoxina 0,1 mM en la cámara de registro a una velocidad de 1-2 ml/min. Se colocaron un electrodo estimulante bipolar de acero inoxidable (Frederick Haer Company, Bowdoinham, ME) (impedancia de 10 megaohmios) y una pipeta de vidrio llena de NaCl 3 M en el estrato radiatum de CA1 para evocar y registrar los potenciales postsinápticos excitadores de campo (fEPSP). )actividad, respectivamente. Se investigó la facilitación de pulsos emparejados (PPF) en varios intervalos entre estímulos y cada intervalo entre estímulos aplicó dos pulsos de corriente de corta duración (40 μs) cada 20 s durante al menos cuatro veces. Las proporciones de las pendientes iniciales de la segunda respuesta fEPSP/primera respuesta fPSP se midieron para el análisis de datos. Para los experimentos de potenciación a largo plazo (LTP), se evocó la actividad de fPSP de referencia estable cada 20 s durante al menos 20 minutos, luego se indujo LTP de estimulación de alta frecuencia (HFS) usando 5 trenes de 100 pulsos a 100 Hz con un intervalo entre tensiones. de 20s Las trazas electrofisiológicas se amplificaron con un amplificador (Multiclamp 700 B; Axon Instruments, Union City, CA). Todas las señales se filtraron en paso bajo a 1 kHz y se digitalizaron a 10 kHz utilizando una interfaz CED Micro 1401 MKII (Cambridge Electronic Design). Los datos se recopilaron utilizando el software Signal (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido). Las respuestas sinápticas se normalizaron al promedio de la línea de base. Los valores de potenciación a corto plazo (STP) y LTP se determinaron promediando 5 min de valores de pendiente normalizados en 10-15 min y 55-60 min post-HFS, respectivamente. Los experimentadores que realizaron la electrofisiología estaban cegados al grupo de ratones.
Denervación colinérgica del hipocampo
El anticuerpo murino p{{0}}con saporina conjugada (mu p75-SAP)(ATS Bio, San Diego) se usó en la denervación colinérgica. Luego, se administraron 0,2 ug de mu p75-SAP por sitio y los sitios de inyección fueron similares a los sitios de inyección del vector viral (cuatro sitios de inyección por animal).
análisis estadístico
Se determinó la media ± SEM para cada grupo. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Graphpad Prism. Los datos se analizaron a través de un análisis de varianza o prueba t según corresponda. Se realizó el método de Bonferroni cuando correspondía. Las diferencias se consideraron significativas cuando p era<>
Resultados
Disminución de la neurogénesis del hipocampo, la densidad de la fibra colinérgica y el volumen en ratones Ngf KO específicos del sistema nervioso
Un desafío importante para el estudio de las funciones de NGF en ratones adultos es que los modelos KO convencionales mueren prematuramente. Hasta ahora, la mayoría de los informes han utilizado bloqueadores de NGF, como pequeños ARN de interferencia o anticuerpos, para evaluar el efecto de NGF52. Para estudiar el papel de NGF en el cerebro, cruzamos ratones Ngf floxed con ratones Sox: Cre, que expresan Cre en todo el tubo neural desde E1127. Estos ratones cKO específicos de tejido nos permiten investigar las funciones de Ngf en el cerebro (Fig. 1A). En primer lugar, se midió la expresión del ARNm de Mgf del hipocampo mediante PCR cuantitativa. Los resultados muestran una fuerte disminución de la expresión de Ngf en ratones cKO (p<0.0001, tuo="8.24)(Fig.1B)." to="" further="" confirm="" the="" specificity="" of="" this="" brain="" cko,="" we="" measured="" ngf="" mrna="" levels="" in="" the="" whole="" brain,="" liver,="" and="" musde="" from="" wt="" and="" cko="" mice,="" and="" our="" results="" confirm="" the="" specificity="" of="" ko="" (supplementary="" fig.="">
La infusión de NGF en los ventrículos laterales aumenta tanto la supervivencia de las neuronas recién nacidas como la actividad colinérgica en el hipocampo8. Por lo tanto, preguntamos si los ratones deficientes en Ngf tienen niveles más bajos de neurogénesis del hipocampo adulto e inervación colinérgica. Para detectar la neurogénesis adulta, inyectamos BrdU (200 mg/kg, una inyección, por vía intraperitoneal) en ratones adultos WT y Ngf cKO (alrededor de 13 semanas). Los ratones se sacrificaron 34 días después de esta inyección de BrdU para evaluar la supervivencia neuronal. Teñimos tejido cerebral para Ki67 (un marcador de proliferación celular), DCX (un marcador para neuronas inmaduras) y tinción doble para BrdU y NeuN (marcador neuronal). Para evaluar la densidad de fibras colinérgicas, teñimos para ChAT, la enzima responsable de la síntesis de acetilcolina. Detectamos significativamente menos Ki67 (p=0.0016, t(16)=3.8) y DCX (p < 0.0001,="" t(16)="8.14)" número="" de="" células="" positivas="" en="" la="" circunvolución="" dentada="" del="" hipocampo="" en="" ratones="" ngf="" cko="" en="" comparación="" con="" ratones="" wt.="" para="" el="" doble="" marcaje="" de="" brdu="" y="" neun,="" los="" ratones="" ngf="" cko="" también="" mostraron="" una="" tendencia="" a="" un="" nivel="" más="" bajo="" de="" brdu="" más="" eun="" más="" el="" número="" de="" células="" (p="0.054," t(14)="2.09)" (fig.="" 1c).="" juntos,="" estos="" datos="" demuestran="" que="" un="" déficit="" de="" ngf="" en="" el="" cerebro="" da="" como="" resultado="" una="" neurogénesis="" hipocampal="" adulta="" disminuida.="" la="" corticosterona="" plasmática="" es="" un="" factor="" importante="" en="" el="" control="" de="" la="" neurogénesis="" adulta29,="" por="" lo="" que="" para="" determinar="" si="" la="" disminución="" de="" la="" neurogénesis="" en="" ratones="" ngf="" cko="" se="" debe="" a="" corticosterona="" plasmática="" elevada,="" medimos="" el="" nivel="" basal="" de="" corticosterona="" plasmática="" de="" ratones="" wt="" y="" cko.="" no="" hubo="" una="" diferencia="" significativa="" en="" la="" corticosterona="" plasmática="" basal="" (p="0.24," t(9)="1.25)," lo="" que="" sugiere="" que="" el="" efecto="" de="" ngf="" en="" la="" neurogénesis="" no="" es="" causado="" por="" el="" diferencial="" en="" la="" corticosterona="" plasmática="" (="" figura="" complementaria="">
Trabajos anteriores han demostrado que las proyecciones colinérgicas al hipocampo provienen del prosencéfalo basal30. Por lo tanto, evaluamos si hay algún cambio en las proyecciones colinérgicas del septohipocampo en ratones Ngf cKO. Nuestros resultados de la tinción de ChAT muestran que la densidad de las fibras colinérgicas se reduce drásticamente en el hipocampo de los ratones Ngf cKO (alrededor del 76 % de disminución, p < 0,0001,="" t(8)="90,56)" (fig.="" 1d),="" pero="" no="" otras="" regiones="" corticales,="" como="" la="" corteza="" prefrontal="" medial="" (p="0.12," t(8)="1.73)" y="" la="" corteza="" de="" asociación="" temporal="" (p="0.2," t(16="" )="1.31)" (figura="" complementaria="" s2a,="" b).="" juntos,="" estos="" datos="" indican="" que="" se="" requiere="" ngf="" para="" apoyar="" las="" proyecciones="" colinérgicas="" al="" hipocampo,="" pero="" no="" a="" la="" corteza.="" a="" continuación,="" analizamos="" el="" recuento="" de="" células="" neuronales="" colinérgicas="" en="" el="" vdb="" de="" broca="" y="" ms,="" desde="" donde="" proyecta="" fibras="" colinérgicas="" al="" hipocampo31,32.="" los="" ratones="" ngf="" cko="" muestran="" una="" pequeña="" disminución="" (alrededor="" del="" 20="" por="" ciento="" de="" disminución)="" en="" los="" recuentos="" de="" células="" chat="" en="" ms="" y="" vdb="" (p="0.022," t(16)="2.52)" (fig.="" s2c="" complementaria)="">
Durante el corte del tejido cerebral, encontramos que el hipocampo de los ratones cKO parecía ser pequeño. Para confirmar esto, realizamos una resonancia magnética y nuestros resultados confirman que Ngf cKO tiene hipocampos más pequeños que WT (p < 0.0001,="" t(12)="12)." para="" verificar="" esto="" aún="" más,="" diseccionamos="" el="" hipocampo="" y="" medimos="" el="" peso,="" y="" encontramos="" que="" el="" hipocampo="" de="" los="" ratones="" cko="" era="" más="" liviano="" en="" comparación="" con="" los="" ratones="" wt="" (p="0.01," t(23)="2." 79)="" (fig.="">
Disminución de la respuesta de ansiedad y el aprendizaje espacial en ratones Ngf cKO
El bloqueo del NGF endógeno perjudica la retención de la memoria espacial21 e interrumpe la señalización colinérgica, mientras que la eliminación del sistema colinérgico del prosencéfalo influye en la ansiedad y el aprendizaje espacial18,33. Para comprender mejor los efectos de Ngf cKO en la ansiedad y el aprendizaje, sometimos a los ratones a campo abierto, EPM, pruebas de laberinto de agua y reconocimiento de objetos novedosos.
La eliminación de Ngf aumentó el comportamiento similar a la ansiedad y disminuyó el aprendizaje espacial y la memoria, sin afectar el reconocimiento de objetos novedosos. En la prueba de campo abierto, los ratones cKO gastaron menos en la zona central (p=0.04, t(40)=2.09), sin diferencia en la distancia total recorrida (p {{7 }}.31, t(40)=1.01) (Fig. 2A). En el EPM, los ratones cKO pasaron más tiempo en el brazo abierto (p=0.001, t(40)=3.43) pero no exhibieron una diferencia significativa en la distancia total (p {{ 18}}.25, t(40)=1.15) (Fig. 2B). En la prueba del laberinto de agua, los ratones Ngf cKO se comportaron peor en la sección de entrenamiento (p=0.001, F(1,16)=15.65). Una semana después, realizamos una prueba de memoria. Los ratones se colocaron en el laberinto de agua pero sin la plataforma. Los ratones Ngf cKO pasaron menos tiempo en el cuadrante objetivo (p=0.01, t(16)=2.79) (Fig. 2C). Para el reconocimiento de objetos nuevos, no hay diferencia en el DI (p=0.41, t(20)=0.82). Juntos, estos datos indican que NGF juega un papel en la mediación de la ansiedad y el aprendizaje/memoria espacial.
La LTP del hipocampo ha sido ampliamente considerada como un modelo sináptico de la memoria34 y las infusiones intraseptales directas de NGF facilitan la inducción de la LTP21. Para examinar el efecto del NGF en la plasticidad sináptica, medimos la LTP a través de un registro electrofisiológico ex vivo en la vía colateral CA1 Schaffer del hipocampo de cortes de cerebro en ratones WT y Ngf cKO. Nuestros resultados revelaron que HFS produjo un aumento persistente en la pendiente de fEPSP en las neuronas CA1 de ratones WT y Ngf cKO, pero no hubo diferencias en LTP (Fig. 2D). Sin embargo, después de cinco series de estímulo tetanizante HFS, el STP disminuyó significativamente en el grupo Ngf cKO (10-15 min después de HFS, p=0.006, t(10)=3.39) ( figura 2E). Para confirmar aún más el efecto sobre la transmisión presináptica, examinamos la plasticidad sináptica a corto plazo por PPF. Las relaciones de pulso emparejado (PPR) fueron similares entre los ratones Ngf cKO y WT. Sin embargo, observamos una tendencia de PPR mejorada a partir de muestras de Ngf cKO usando un intervalo entre estímulos de 50 ms (p=0.094, t(18)=1.76) (Fig. 2F), lo que sugiere que el la transmisión presináptica puede haber cambiado en los ratones Ngf cKO.
La sobreexpresión de Ngf en el hipocampo de ratones cKO rescata la memoria espacial, pero no la ansiedad
Para determinar si los fenotipos de comportamiento que observamos en los ratones Ngf cKO pueden revertirse mediante la sobreexpresión de Ngf en el hipocampo, inyectamos el vector viral AAV-CB (actina de pollo)-Ngf (sobreexpresión) o el vector viral AAV-CB-eGFP ( control) en el hipocampo de ratones Ngf cKO. Catorce días después de la cirugía, sometimos a todos los ratones a pruebas de comportamiento. Los resultados no muestran diferencias significativas en la prueba de campo abierto (tiempo en zona central, p=0.59, t(37)=0.54) y EPM (tiempo en brazo abierto, p {{12} }.76, t(37)=0.29) (Fig. 3A, B). Para el laberinto de agua, no se encontraron diferencias en la sección de entrenamiento (p=0.54, F(1,15)=0.39). Sin embargo, los ratones cKO con sobreexpresión de Ngf pasaron más tiempo en la zona objetivo en comparación con el grupo de control (p=0.008, t(15)=3.01) (Fig. 3C, D). Después de recolectar el tejido cerebral, confirmamos la sobreexpresión de Ngf mediante hibridación in situ y PCR en tiempo real (Fig. 3E, F). También detectamos un nivel significativamente más alto de fibras colinérgicas en el hipocampo de ratones que sobreexpresan Ngf (p=0.001, t(10)=4.19) (Fig. 3G, H). Estos resultados sugieren que los ratones Ngf cKO con sobreexpresión de Ngf en el hipocampo pueden restaurar las inervaciones colinérgicas y la memoria espacial, pero no la ansiedad.
Deterioro de la memoria espacial en ratones con denervación colinérgica en el hipocampo
Los ratones Ngf cKO mostraron una inervación de fibra colinérgica del hipocampo severamente disminuida, que fue restaurada por la sobreexpresión de Ngf en el hipocampo. Esto se correlacionó con la restauración del rendimiento de la memoria espacial (sin una mejora de la ansiedad). Por lo tanto, abordamos si el agotamiento de las fibras colinérgicas selectivamente en el hipocampo influye en la ansiedad o la memoria espacial en el laberinto de agua.
Un informe anterior ha demostrado que la anti-p75NTRSaporina es una inmunotoxina colinérgica específica en ratones35. Con este fin, inyectamos anti-p75NTRSaporin (o vehículo PBS como control) en el hipocampo de ratones C57. Catorce días después de la cirugía, sometimos a estos dos grupos de ratones a pruebas de comportamiento. No encontramos diferencias significativas tanto en la prueba de campo abierto (tiempo en zona central, p=0.5, t(15) {{10}}.68) como en EPM (tiempo en brazos abiertos , p=0.51, t(14)=0.66) (Fig. 4A, B). Para el laberinto de agua, no se encontró diferencia en la sección de entrenamiento (p=0.49, F(1,14)=0.49); sin embargo, los ratones inyectados con anti-p75NTRSaporin en el hipocampo pasaron menos tiempo en la zona objetivo en comparación con el control PBS (p=0.035, t(14)=2.33) (Fig. 4C, D). Después de recolectar el tejido cerebral, confirmamos que se había producido una denervación colinérgica en el hipocampo mediante la tinción de ChAT (p < 0,0001,="" t(10)="11,85)," lo="" que="" también="" mostró="" que="" las="" fibras="" colinérgicas="" de="" la="" corteza="" estaban="" intactas="" (p="" {="" {37}}.184,="" t(14)="1.39)" (fig.="" 4e).="" estos="" resultados="" demuestran="" que="" el="" sistema="" colinérgico="" del="" hipocampo="" es="" necesario="" para="" mantener="" la="" función="" de="" la="" memoria="" espacial,="" sin="" tener="" un="" impacto="" sobre="" la="">
El efecto del NGF sobre la memoria espacial depende del sistema colinérgico del hipocampo
A continuación, abordamos si el beneficio de la memoria espacial obtenido al sobreexpresar Ngf en el hipocampo de ratones Ngf cKO depende de la inervación colinérgica del hipocampo intacta. Inyectamos vectores virales anti-p75NTRSaporin y AAV-Ngf en el hipocampo de ratones Ngf cKO. Para el grupo de control, inyectamos vectores virales anti-p75NTRSaporin y AAV-eGFP. Catorce días después de la cirugía, evaluamos tanto la ansiedad como la memoria espacial. Los resultados no mostraron diferencias entre AAV-Ngf y AAV-eGFP en la prueba de campo abierto (tiempo en zona central, p=0.6, t(33)=0.51) y EPM (tiempo en brazos abiertos, p=0.92, t(33)=0.09) (Fig. 5A, B). Para el aprendizaje espacial y la memoria, tampoco hubo diferencias entre grupos, tanto en la sección de entrenamiento (p=0.94, F(1,36)=0.004) como en la prueba de memoria (p {{ 26}}.44, t(36)=0.77) (Fig. 5C, D). Después de recolectar el tejido cerebral, evaluamos la densidad de la fibra colinérgica del hipocampo mediante la tinción de ChAT y ambos grupos mostraron un agotamiento severo de las fibras colinérgicas del hipocampo, aunque se encontró un nivel ligeramente más alto de densidad de fibra en los ratones AAV-Ngf en comparación con los ratones AAV-eGFP (p=0.01, t(12)=2.83) (Fig. 5E, F). La PCR en tiempo real confirmó que el grupo AAV-Ngf había aumentado drásticamente la expresión de Ngf en comparación con el grupo de control (p=0.0004, t(12)=4.89) (Fig. 5G). Estos datos sugieren que el efecto beneficioso del NGF sobre la memoria espacial requiere una inervación colinérgica del hipocampo intacta.
Discusión
En este estudio, nos propusimos investigar los roles del NGF del hipocampo y el sistema colinérgico en la ansiedad, el aprendizaje y la memoria. Mostramos que los ratones con deleción de Ngf específica del cerebro (Mgf ckO) presentan un aumento de la ansiedad y un déficit en el aprendizaje espacial. Los ratones Ngf cKO también presentaron niveles más bajos de neurogénesis adulta, menor volumen del hipocampo, STP deteriorado y un agotamiento dramático de las inervaciones colinérgicas en el hipocampo. La sobreexpresión de Ngf en el hipocampo de ratones KO del gen Ngf rescató la memoria espacial pero no aumentó la ansiedad. Curiosamente, también observamos una restauración parcial de la inervación colinérgica en el hipocampo después de la sobreexpresión de Ngf en esta estructura. Para determinar si el efecto del NGF en la memoria espacial depende de estas inervaciones colinérgicas, primero agotamos las fibras colinérgicas del hipocampo en ratones WT C57 mediante la inyección de una inmunotoxina colinérgica en el hipocampo y confirmamos que las fibras colinérgicas del hipocampo respaldan la memoria espacial. A continuación, en ratones de fondo Ngf cKO, agotamos las fibras colinérgicas del hipocampo pero aumentamos la expresión de Ngf simultáneamente mediante el uso de AAV-Ngf, que se compararon con ratones similares con agotamiento colinérgico pero inyectados con el control AAV-eGFP. El resultado mostró que la reexpresión de altos niveles de Ngf en el hipocampo no mejoró la memoria espacial. Por lo tanto, mostramos que el efecto restaurador de NGF en Ngf cKO depende de la inervación colinérgica del hipocampo intacta y no de otro mecanismo.
Se ha demostrado que el NGF proporcionado exógenamente aumenta la supervivencia de las neuronas28 recién nacidas y el aprendizaje espacial36 en roedores, mientras que el bloqueo del NGF por parte de anticuerpos deteriora la memoria espacial21. De acuerdo con un papel de apoyo para NGF en estos parámetros, mostramos que la eliminación específica del sistema nervioso central de Ngf muestra una reducción de la proliferación celular y la neurogénesis. En las pruebas de comportamiento, también observamos deterioro de la ansiedad y el aprendizaje/memoria espacial.
Un estudio anterior de Ngf KO proporcionó evidencia que demuestra que el NGF es prescindible para el aprendizaje y la memoria37. Sin embargo, los autores no realizaron una prueba de sondeo (sección de memoria), y en su lugar se realizó un aprendizaje inverso. Además, el 60 por ciento de las fibras colinérgicas del hipocampo aún permanecían en los ratones Ngff/f-Nes::Cre en ese estudio. En nuestro modelo de ratones, detectamos solo el 20 por ciento de las fibras colinérgicas que quedan en los ratones Ngff/f-Sox1::Cre. Esta discrepancia puede explicar la diferencia en el comportamiento que observamos, ya que nuestro experimento proporciona evidencia de que se requieren inervaciones colinérgicas del hipocampo para el efecto de NGF en la memoria espacial. El fenotipo de ansiedad que observamos en ratones Ngf cKO no se puede revertir mediante la sobreexpresión de Ngf hipocampal. Una posibilidad para esto es que el fenotipo de ansiedad que observamos en ratones Ngf cKO fue una consecuencia de la inactivación de Ngf en una etapa temprana. Alternativamente, el NGF puede estar actuando fuera del hipocampo para modular la ansiedad. Sin embargo, observamos la regeneración de las fibras colinérgicas y una mejora de la retención de la memoria espacial en ratones con sobreexpresión de Ngf en el hipocampo, y este resultado es consistente con un estudio anterior en ratas de edad avanzada38.
Encontramos que la lesión colinérgica del hipocampo no afectó la ansiedad pero perjudicó la memoria espacial. Nuestros resultados son inconsistentes con informes previos que mostraron que la microinfusión de un inhibidor de la acetilcolinesterasa o antagonistas de los receptores muscarínicos M1 y M2 en el hipocampo modulan la ansiedad39,40. Sin embargo, nuestros resultados son consistentes con un informe que no encontró ningún efecto sobre la ansiedad luego de una reducción en la inervación colinérgica del hipocampo que se logró mediante la inyección de inmunotoxina en el MS y el VDB de Broca41. Para el aprendizaje espacial y la memoria, varios estudios sugieren que la actividad de ChAT está asociada con el aprendizaje espacial18,35,42,43, pero otros trabajos no mostraron ningún efecto en el aprendizaje espacial y la memoria después de la lesión por inmunotoxina44,45. En nuestro experimento, encontramos que el agotamiento de la inervación colinérgica del hipocampo perjudicó la memoria espacial, sin afectar la adquisición. Estas discrepancias entre estudios podrían deberse a los diferentes protocolos de comportamiento, edad, tensión y métodos para inhibir el sistema colinérgico en el hipocampo.
Durante mucho tiempo se ha estudiado una interacción entre el NGF y el sistema colinérgico. La pérdida de TrkA, así como la deleción de Ngf, reduce las neuronas colinérgicas en la EM y la inervación colinérgica en las regiones corticales e hipocampo37,46. Se observaron resultados similares en nuestro modelo deficiente de Ngf con alrededor del 76 por ciento de las fibras colinérgicas del hipocampo denervadas. Para saber si estas fibras colinérgicas contribuyeron al efecto de NGF en el aprendizaje espacial, aumentamos la expresión de Ngf y, al mismo tiempo, agotamos las inervaciones colinérgicas en ratones Ngf cKO mediante inyección intrahipocampal con AAV-Ngf mixto (o AAV-eGFP para el grupo de control) y anti-p75NTRSaporina. Los resultados muestran que aumentamos drásticamente la expresión de Ngf y también eliminamos con éxito estas inervaciones colinérgicas. Aunque la densidad de fibra colinérgica en el grupo de AAV-Ngf más anti-p75NTRSaporina fue un poco más alta que en el grupo de AAV-eGFP más anti-p75NTRSaporina, ambos grupos alcanzaron el 90 por ciento de agotamiento de la fibra colinérgica en el hipocampo en comparación con los ratones WT no tratados. No se observaron diferencias en la memoria espacial entre estos grupos, lo que sugiere que simplemente aumentar la expresión de Ngf sin la inervación colinérgica del hipocampo no es suficiente para restaurar la memoria espacial.
Aquí utilizamos ratones KO condicionales Ngf específicos del cerebro para revelar la importancia del NGF en la regulación del volumen del hipocampo, el comportamiento, la plasticidad sináptica, la neurogénesis y la inervación colinérgica. Además, demostramos que el efecto del NGF del hipocampo en la memoria espacial depende de un sistema colinérgico intacto. La terapia génica Ngf se ha probado en pacientes con enfermedad de Alzheimer, pero no se encontraron efectos en el último ensayo clínico de fase 247. Sin embargo, los datos recientes del ensayo clínico de fase 1 anterior con un procedimiento quirúrgico idéntico, analizando el tejido post mortem, encontraron que el AAV-Ngf inyectado no atacó directamente a las neuronas colinérgicas diana48. Nuestros datos proporcionan evidencia de que AAV-Ngf puede ser ineficaz sin reinervación colinérgica. Nuestro estudio, en combinación con esta reciente observación post-mortem, sugiere que aún es demasiado pronto para concluir que la terapia con NGF es ineficaz para la enfermedad de Alzheimer.
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