Los efectos de la naringenina en los perfiles de miARN-ARNm en células HepaRG

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Resumen: Naringenina, un naturalflavonoideampliamente encontrado en frutas cítricas, se ha informado que posee propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y hepatoprotectoras como suplemento dietético natural. Sin embargo, el mecanismo regulador de la naringenina en el hígado humano sigue sin estar claro. En el presente estudio, se utilizaron secuenciación de ARN mensajero (mRNA-seq), secuenciación de microARN (miRNA-seq) y qPCR en tiempo real para distinguir las diferencias de expresión entre las células HepaRG de control y las tratadas con naringenina. Obtuvimos 1037 mRNA expresados ​​diferencialmente y 234 miRNA.hígadometabolismo. Este estudio es el primero en brindar una perspectiva de las interacciones miARN-ARNm en la regulación de la naringenina a través del análisis integrado de mRNA-seq y miRNA-seq en células HepaRG, lo que caracteriza aún más el valor nutracéutico de la naringenina como aditivo alimentario.

Palabras clave: naringenina; secuencia de ARNm; secuencia de miARN; Células HepaRG

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1. Introducción

Naringenina, un flavonoide natural, se encuentra abundantemente en frutas cítricas y otras frutas comestibles, como toronjas, naranjas, bergamota, tomates e higos [1]. Después de la administración oral, la naringenina se distribuye ampliamente en el tracto gastrointestinal y el hígado [2,3] y exhibe una propiedad antioxidante directa por la actividad de eliminación de radicales libres debido a su estructura molecular, e induce el sistema antioxidante endógeno en el hígado [4]. La creciente evidencia de estudios tanto in vitro como in vivo ha identificado varias capacidades protectoras de la naringenina, comoantiinflamatorio[5], antioxidante [6], antifibrosis [Z] y hepatoprotector 4,8| actividades. Estas capacidades sugieren que la naringenina dietética podría aplicarse para prevenir el síndrome metabólico y las enfermedades malignas, incluida la hepatitis fulminante, la grasaenfermedad del higado, fibrosis, etc. 19,10]. Sin embargo, existen pocos estudios detallados sobre los efectos reguladores de la naringenina en los genes generales del hígado [4].

Los microARN (miARN) son una clase de moléculas de ARN monocatenario no codificantes con una longitud de 18-26 nucleótidos codificados por genes endógenos, que exhiben una amplia gama de funciones reguladoras biológicas en filogenia, diferenciación, proliferación y apoptosis [11]. Los miARN, que se unen a los ARN mensajeros (ARNm) mediante el reconocimiento de secuencias específicas, regulan negativamente la expresión génica a nivel postranscripcional a través de la degradación de los ARNm diana [12]. Bajo estimulación exógena, la expresión de miARN se altera y luego se regula la expresión de ARNm diana. Eventualmente, se modifican extensas funciones fisiológicas para hacer frente a los desafíos causados ​​por la estimulación exógena [13]. Un método más confiable para predecir las relaciones objetivo de miRNA-mRNA es integrar simultáneamente el análisis de mRNA-seq con el análisis de miRNA-seq utilizando un contexto de procesamiento particular in silico [14].

Por lo tanto, nuestro objetivo fue estudiar los efectos de la naringenina en los genes globales y resaltar el posible mecanismo regulador de los pares de miARN-ARNm en el hígado. En el presente estudio, se investigaron los cambios en la expresión de mRNA y los perfiles de expresión de miRNA en células HepaRG mediante la realización de mRNA-seq, miRNA-seq, análisis bioinformáticos y qPCR en tiempo real para proporcionar evidencia del potencial de la naringenina como suplemento dietético natural.

2. Resultados

2.1.Análisis de la secuenciación del transcriptoma en la respuesta a naringenina

Para identificar los cambios en la expresión del ARNm deCélulas HepaRGen respuesta a la naringenina, ocho bibliotecas complementarias de ADN (ADNc) en el grupo de control (CK-1, CK-2, CK-3 y CK-4) y el grupo experimental (T-1, T-2, T-3 y T-4) se construyeron con ARN total y se sometieron a secuenciación Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou , Porcelana). Los resúmenes de los resultados de secuenciación y ensamblaje para el grupo de control y el grupo experimental se muestran en la Tabla 1. Los cambios en la expresión génica se analizaron comparando los grupos tratados y de control. Como se muestra en la figura la, el grupo expuesto a naringenina expresó 1037 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en comparación con el grupo de control. Un mapa de calor de 1037 DEG mostró el análisis de conglomerados del grupo de control y el grupo de naringenina (Figura 1b; 381 genes regulados hacia arriba y 656 hacia abajo; Tabla S1, Materiales complementarios).

Según el sistema de clasificación Gene Ontology (GO), 1037 DEG se clasificaron en tres categorías funcionales principales (proceso biológico, componente celular y función molecular) y 61 subcategorías (Figura 2). Entre los procesos biológicos, el proceso celular (731) fue el más comúnmente representado, seguido del proceso de un solo organismo (672) y la regulación biológica (595). En la categoría de componente celular, una proporción significativa de grupos se asignó a celda (727), parte de celda (721) y orgánulo (580). Los genes implicados en los grupos de unión (666) y actividad catalítica (238) estuvieron notablemente representados en la categoría de función molecular.

La clasificación de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) se encontró para 1037 DEG que se clasificaron además en las veinte principales rutas bioquímicas de acuerdo con el valor q más pequeño y el GeneNumber más grande en la anotación de la ruta (Figura 3). El GeneNumber y la proporción de genes anotados de las cinco vías principales son lupus eritematoso sistémico (33,8,4 por ciento), alcoholismo (38,9,67 por ciento), mala regulación transcripcional en cánceres (22, 5,6 por ciento), vía de señalización PI3K-Akt (34, 8,65 por ciento), y cascadas del complemento y de la coagulación (12, 3,05 por ciento o). Hubo más de 10 genes enriquecidos entre las cinco vías. En general, el tratamiento con naringenina tuvo un impacto significativo en el perfil de expresión génica global de las células HepaRG. Estos resultados implicaron que los genes involucrados en estas vías pueden desempeñar funciones cruciales en la regulación de la naringenina.

2.2. Análisis de los niveles de transcripción de miARN en respuesta a la naringenina

En este estudio, nuestro objetivo fue determinar sinaringeninala exposición altera los niveles de expresión de los miARN en las células HepaRG. Después de la exposición, recolectamos ARN pequeños y medimos su abundancia relativa utilizando Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, China). Como se muestra en la Tabla 2, se generaron lecturas limpias de ocho muestras, respectivamente, después de eliminar las lecturas de contaminantes. En la Tabla 2 se proporciona una descripción general de las lecturas para la secuenciación de ARN pequeño desde datos sin procesar hasta alta calidad y con filtrado de calidad. Las distribuciones de longitud de los ARN pequeños fueron similares entre las bibliotecas en que los ARN de 21-23 nt fueron los más abundantes (Figura 4 ).

Todos los ARN pequeños se alinearon en la base de datos GeneBank (Versión 209.0) y la base de datos Rfam (11.0) para identificar y eliminar el ARN ribosómico (ARNr), el ARN condicional pequeño (ARNc), nucleolar pequeño (snoRNA), nuclear pequeño (snRNA) y ARN de transferencia (tRNA). De acuerdo con el genoma de referencia, también se eliminaron estos pequeños ARN asignados a exones, intrones y secuencias repetidas. Los pequeños ARN filtrados se buscaron en la base de datos miRBase (Versión 21) para identificar los miARN. El mapa de calor de 3373 miRNAs muestra el análisis de conglomerados del grupo de control y el grupo de naringenina en la Figura 5a. El perfil Illumina HiSeq2500 de los 3373 miARN analizados en exposición a naringenina frente a muestras de control mostró que un total de 234 miARN expresados ​​diferencialmente (DEM, 174 regulados hacia arriba y 60 regulados hacia abajo; Tabla S2, Materiales complementarios) fueron detectables en células HepaRG (Figura 5b) .

2.3.Predicción de objetivos y análisis de integración de perfiles de expresión de ARNm y miARN en respuesta a naringenina

Actuando a nivel postranscripcional, los miARN silencian y/o regulan a la baja la expresión del gen del ARNm celular mediante la escisión del ARN diana. .01), Miranda (v3.3a) y TargetScan (Versión: 7.0). El perfilado simultáneo de 234 DEM y 1037 niveles de DEG in silico puede identificar los presuntos ARNm objetivo de los miARN. Seleccionamos la intersección de DEG y los genes objetivo de DEM y luego realizamos un análisis bioinformático en estos genes de intersección. Se obtuvieron un total de 5607 pares de miARN-ARNm negativos para el tratamiento con naringenina, con la participación de 216 DEM y 681 DEG (Tabla S3, Materiales complementarios). De acuerdo con el sistema de clasificación GO, 681 DEG se clasificaron en 58 subcategorías (Figura 6). Las primeras tres subcategorías no habían cambiado en tres categorías funcionales principales en comparación con el análisis de secuenciación del transcriptoma (Figuras 2 y 6).

El análisis de enriquecimiento de vías para 681 DEG de 5607 pares de miARN-ARNm negativos identificó las veinte vías principales de acuerdo con el valor q más pequeño y el Número de gen más grande en la anotación de la vía después de la exposición a la naringenina (Figura 7): con la vía de señalización PI3K-Akt (25,8,96) por ciento) siendo la octava vía y la segunda más abundante.

2.4.Validación qPCR en tiempo real de la regulación de naringenina en el metabolismo hepático y pares de miARN-ARNm reguladores potenciales

De acuerdo con las anotaciones de la función genética global, la revisión de la literatura y su posible relación con los miARN que responden a la naringenina, 19 DEG (ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZIN2, HS6ST3 , B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2 y MAT1A) se seleccionaron manualmente como representantes de sus funciones potenciales en el metabolismo hepático. Además, la vía de señalización de PI3K-Akt se había enriquecido significativamente (cuarto en el análisis KEGG de RNA-seq, Figura 3; octavo en el análisis KEGG de miRNA-RNA-seq, Figura 7); por lo tanto, se seleccionaron 11 DEG (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1 y NFkB1) entre la vía de señalización de PI3K-Akt.

Aquí describimos la interacción entre los 30 DEG y 11 miARN humanos (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9 }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p, hsa-miR-7-5p y hsa-miR-200a-5p), incluidas 20 interacciones negativas de miARN-ARNm (Figura 9). Como se muestra en la Figura 9, un solo miARN puede regular múltiples ARNm diana y viceversa (p. ej., ABAT HS6ST3, B4GALT6 y DCT posiblemente podrían ser regulados simultáneamente por hsa-miR-429; HS6ST3 puede ser regulado simultáneamente por hsa-miR -429, hsa-miR-100-3p,hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5 p y hsa-miR-194-5p; algunos DEG no tenían DEM emparejados). Los perfiles de expresión de 19 DEG relacionados con el metabolismo hepático y 11 DEG entre la vía de señalización de PI3K-Akt se validaron aún más mediante qPCR en tiempo real (Figura 9a,b). El nivel de expresión de 11 miARN humanos (dos regulados hacia arriba y nueve regulados hacia abajo) se evaluó adicionalmente en busca de cambios inducidos por naringenina mediante qPCR en tiempo real de acuerdo con los resultados de la secuenciación (Figura 9c). Aunque hubo algunas diferencias cuantitativas entre las dos plataformas analíticas, las similitudes entre los datos de RNA-seq y la PCR en tiempo real sugirieron que los datos de RNA-seq eran reproducibles y confiables.

3. Discusión y Conclusiones

Los hallazgos discutidos aquí revelan la primera información detallada sobre los cambios paralelos en la expresión de ARNm y miARN en células HepaRG en respuesta anaringenina. Realizamos un análisis integrador de estos datos, incluidos 234 DEM y 1037 DEG inducidos por naringenina, que brindan una visión global de las interacciones miRNA-mRNA de naringenina en el mecanismo regulador. De acuerdo con las anotaciones de la función del gen y la revisión de la literatura, se descartaron 19 DEG relacionados con el metabolismo. En particular, la vía de señalización de PI3K-Akt se enriqueció significativamente tanto en el análisis de la secuenciación del transcriptoma (el tercero más abundante y el cuarto) como en el análisis de integración de los perfiles de expresión de miARN-ARNm (el segundo más abundante y el octavo) en las respuestas a la naringenina. Además, se validaron 11 DEG en la vía de señalización de PI3K-Akt mediante análisis de qPCR en tiempo real. En este trabajo, construimos una red reguladora de miRNA-mRNA de acuerdo con los conjuntos de datos DEM y DEG y la información de orientación de miRNA. Algunos estudios han demostrado que la red reguladora miARN-ARNm responde aDaño hepático, incluido el carcinoma hepatocelular y el estrés oxidativo [15]. Aunque se identificaron varios fenómenos de activación de ARN inducidos por miARN [16], en la mayoría de las circunstancias, la correlación negativa entre los miARN y sus ARNm diana a menudo se considera un apoyo para la orientación de miARN [17]. Finalmente, se identificaron 20 pares de correlación negativa de miARN-ARNm con la participación del metabolismo hepático y la vía de señalización PI3K-Akt.

Con respecto a los genes globales, abordamos nuestra pregunta de investigación particular mediante el análisis de vías para resaltar 19 DEG relacionados con los grupos funcionales: metabolismo, incluido el metabolismo de los lípidos (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C y B4GALT6), metabolismo energético (CA9 y NDUFA4L2) , metabolismo de cofactores y vitaminas (TH, LIPT2 y FTCD), metabolismo de aminoácidos (RRM2, AZIN2, DCT, ALAS2 y MAT1A), biosíntesis y metabolismo de glicanos (HS6ST3 y GUSB) y metabolismo de carbohidratos" (HKDC1, PCK1, UGDH y ABAT). Estos 19 DEG enriquecidos para el metabolismo están principalmente involucrados en la sensibilidad a la insulina, la acumulación de lípidos, el almacenamiento de glucógeno y el gasto de energía. Estudios previos informaron que la regulación negativa de ALOX15 en ratones inducidos por alcohol daña el hígado [18], CA9 en ratones BALB/C [19], enfermedad del hígado graso no alcohólico THin (NAFLD) [20], HKDC1 [21] y la regulación positiva de UGDH [22] pueden aliviar significativamente el estrés oxidativo, la acumulación de lípidos y el daño hepático. Eliminación de la acumulación de ROS suprimida por NDUFA4L2 ción y apoptosis en células de carcinoma hepatocelular (HCC) [23]. El silenciamiento de RRM2 inhibió la proliferación de células NCI-H929 [24], y la sobreexpresión de FTCD suprimió la proliferación celular al promover el daño del ADN e inducir la apoptosis celular en las células de CHC [25]. La ablación de ACSL5 mejoró la sensibilidad a la insulina, aumentó el gasto de energía y retrasó la absorción de triglicéridos en ratones [26]. La suplementación con DCT mejoró la esteatosis hepática y la inflamación asociadas con la edad [27]. La formación de gotitas de lípidos tras la estimulación del ácido graso y el virus de la hepatitis C en las células de eliminación de PLA2G4C se vio afectada [28]. La regulación a la baja de LIPT2 inhibió la síntesis de ácidos grasos [29]. La regulación positiva de ABAT [30], AZIN2 [31], B4GALT6 [32], HS6ST3 [33] y GUSB [34] podría promover la descomposición de ácidos grasos y glucógeno. La sobreexpresión de ALAS2 podría mejorar la capacidad hematopoyética del hígado [35] y MAT1A expresado en los hepatocitos mantuvo el estado diferenciado de estas células [36]. De acuerdo con los hallazgos descritos anteriormente, la regulación de estos genes metabólicos en nuestros resultados puede ser favorable para mejorar el metabolismo en respuesta a la naringenina.

La vía de señalización de PI3K-Akt puede ofrecer pistas sobre el mecanismo molecular involucrado en el metabolismo, la inflamación y el estrés oxidativo [37], que desempeña un papel fundamental en la respuesta a la naringenina. La vía de señalización de PI3K-Akt tiene diversos efectos posteriores sobre el metabolismo celular a través de la regulación directa de los transportadores de nutrientes y las enzimas metabólicas o el control de los factores de transcripción que regulan la expresión de componentes clave de las vías metabólicas [38,39], incluido el metabolismo de la glucosa, la biosíntesis de macromoléculas y mantenimiento del equilibrio redox. Se informó que el silenciamiento de PDGFRB inhibió la activación y proliferación de células estrelladas hepáticas y mejoró la fibrosis hepática [40]. Se espera que la inhibición colaborativa de CSF1R y FGFR2 mejore los efectos antitumorales al atacar la evasión inmune y la angiogénesis en el microambiente tumoral [41]. Derribar ITGB4 suprimió la glucólisis en fibroblastos asociados con el cáncer [42]. La eliminación genética de PCK1 evitó un aumento inducido por ácidos grasos en el flujo oxidativo, el estrés oxidativo y la inflamación [43], que también se correlacionó con las vías de señalización gobernadas por la insulina [44]. Se demostró que la sobreexpresión de CREB3L3 nuclear inducía la lipólisis sistémica, la cetogénesis hepática y la sensibilidad a la insulina con un mayor gasto de energía [45]. Según los informes, la inhibición de CREB3L1 bloqueó la invasión y la metástasis del cáncer [46]. NFkB es un regulador clave del desarrollo inmunitario, las respuestas inmunitarias, la inflamación y el cáncer [47]. Está bien establecido que la supresión de la transducción de NFkB produce señales antiinflamatorias y reduce la inflamación [48]. En la vía de señalización de PI3K-Akt, nuestros resultados mostraron que la naringenina reducía significativamente las expresiones de ARNm de PDGFRB, PCK1, CREB3L1 y NFkB1 con miARN relacionados (has-miR-1306-5p y hsa-miR{{40} }p) está significativamente regulado a la baja. Por lo tanto, nuestros datos sugirieron que la naringenina puede desempeñar un papel saludable en el estrés antiinflamatorio y antioxidante y en el metabolismo de mejora a través de la inhibición de la vía de señalización PI3K-Akt.

Este estudio fue el primero en integrar el análisis de mRNA-seq y miRNA-seq en el hígado en respuesta a la naringenina y brindar una perspectiva del metabolismo en la regulación de la naringenina. En términos de metabolismo y la vía de señalización de PI3K-Akt, los 11 DEM, 30 DEG y 20 pares de miRNA-mRNA necesitan más investigación para las actividades de la naringenina. Hay algunas limitaciones de esta investigación; por ejemplo, los efectos dependientes de la dosis y del tiempo de la naringenina en las interacciones miARN-ARNm aún no estaban claros. Aunque los miARN analizados in silico sugirieron capacidades reguladoras, sus funciones deben certificarse aún más en un contexto específico dentro de un sistema vivo. En resumen, proporcionamos una investigación preliminar que analiza la expresión de ARNm y miARN y el perfil del metabolismo. El mecanismo regulador de los pares de miARN-ARNm podría ser una posible evidencia adicional para anotar el valor nutracéutico de la naringenina.

4. Materiales y Métodos

4.1. Sustancias químicas y reactivos

La línea celular HepaRG se adquirió originalmente de Biopredic International (Rennes, Francia). El medio RPMI-1640 y la solución de penicilina-estreptomicina-glutamina se obtuvieron de Gibco (Gaithersburg, MD, EE. UU.). El suero bovino fetal (FBS) se adquirió de Corning (Auckland, Nueva Zelanda). La naringenina y el dimetilsulfóxido (DMSO) fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El reactivo TRIzolTM fue suministrado por Thermo Fisher (Carlsbad, CA, EE. UU.). El agua ultrapura se purificó mediante un sistema de purificación de agua académico Milli-O (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). Todos los demás reactivos eran productos comercializados del más alto grado analítico disponible.

4.2. Cultivo de células HepaRG

Las células HepaRG se sembraron a 5 × 10* células/cm- en placas de seis pocillos y se cultivaron en medio RPMI-1640, se cultivaron con o sin naringenina 100 uM durante 48 h y se complementaron con FBS al 10 % y antibióticos al 1 %. (100 U/mL de penicilina y 100 ug/mL de estreptomicina) a 37 grados en una incubadora humidificada con 5 por ciento de CO2. CK-1, CK-2, CK-3 y CK-4 se refieren al grupo de verificación de control; T-1, T-2, T-3 y T-4 se refieren al grupo de tratamiento con naringenina 100 μM. Los números 1, 2, 3 y 4 representan muestras de cuatro experimentos repetidos independientes.

4.3.Extracción de ARN total

Las células HepaRG se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y se recolectaron con el reactivo TRIzolTM según lo recomendado por el fabricante. Se utilizaron espectrofotómetros Thermo Scientific NanoDropTM2000 c (Wilmington, DE, EE. UU.) para medir la calidad y la cantidad de ARN de cada muestra de acuerdo con el protocolo del fabricante.

4.4.Secuenciación de ARN

El ARNm se enriqueció con perlas de Oligo(dT), luego el ARNm enriquecido se fragmentó y se transcribió inversamente en ADNc con cebadores aleatorios mediante el kit de extracción de PCR OiaOuick (Qiagen, Venlo, Países Bajos). Las moléculas de ARN en un rango de tamaño de 18-30 nt se enriquecieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Se agregaron los adaptadores 3' y 5', luego los ARN enriquecidos se transcribieron inversamente mediante el kit de extracción QiaQuick PCR, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Venlo, Países Bajos). Los productos de ligación se seleccionaron por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. Había cuatro muestras en el grupo de naringenina y cuatro muestras en el grupo de control. Cada muestra generó dos bibliotecas de ADNc: una para mRNA-seq y otra para miRNA-seg. Los productos amplificados por PCR se enriquecieron para generar respectivamente 16 bibliotecas de ADNc y se secuenciaron utilizando Ⅲlumina HiSeq2500 de Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, China). Los datos de secuenciación de ARN y ARN pequeño se depositaron en el archivo de lectura de secuencias NCBI (números de acceso de SRR13675952 a SRR13675963).

4.5. qPCR en tiempo real

La transcripción de ARNm en ADNc se realizó con el sistema de transcripción inversa GoScriptTM (Promega, Madison, WI, EE. UU.) a partir de 3 ug de ARN total, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis de miARN, la síntesis de ADNc se realizó con la síntesis de ADNc de la primera hebra de miARN (Tailing Reaction, Sangon Biotech, Shanghái, China) a partir de 2 ug de ARN total.

con GoTaq® qPCR Master Mix(Promega, Madison, WI, EE. UU.) en un LightCycler 480 (Roche, Mannheim, Alemania), según lo recomendado por el fabricante. El procedimiento de termociclado comenzó con una desnaturalización inicial a 95°C durante 10 min. A esto le siguieron 45 ciclos de desnaturalización durante 10 s a 95 grados, unión del cebador durante 20 s a 60 grados y elongación durante 20 sa 72 grados. El procedimiento terminó con una amplificación final a 95 grados durante 5 s, 65 grados C durante 1 min, la adición de un paso de curva de disociación y un paso de enfriamiento. Los cebadores se adquirieron de Sangon Biotech (Shanghai, China). Las secuencias de pares de cebadores utilizadas para la validación de la firma se describen en las Tablas 3 y 4. Los valores de Ct se calcularon con referencia a -actina o U6.

4.6.Análisis y Estadísticas Bioinformáticas

Los DEG y DEM se identificaron utilizando un paquete de software basado en R. El valor umbral para la selección de DEG y DEM fue el valor q (valor p ajustado) menor o igual a 0.05 y cambio de pliegue (FC) mayor o igual a 2 o menor mayor o igual a 0,5. La clasificación KEGG y GO, que incluye funciones moleculares, procesos biológicos y componentes celulares, se utilizó para analizar DEG y DEM.

Los resultados del ensayo biológico se presentan en forma de media ± SD basada en cuatro experimentos independientes en GraphPad Prism 8.

Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1: Tabla S1, Identificación de 1037 ARNm expresados ​​diferencialmente en respuesta a naringenina; Tabla S2, Identificación de 234 miARN expresados ​​diferencialmente en respuesta a la naringenina; Tabla S3, Identificación de 5607 pares negativos de miARN-ARNm en respuesta a naringenina, con la participación de 216 DEM y 681 DEG en total

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