La búsqueda de células T autorreactivas y la infiltración de células inflamatorias

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La uveítis autoinmune experimental (EAU) es un modelo animal de uveítis autoinmune humana que se caracteriza por la infiltración de células T autoinmunes con aumentos simultáneos de citoquinas proinflamatorias y especies reactivas de oxígeno. Este estudio tuvo como objetivo evaluar si la betaína regula la progresión de la EAU en ratas Lewis. La EAU se indujo mediante la inmunización con la proteína de unión a retinoides interfotorreceptora (IRBP) y la administración oral de un vehículo o betaína (100 mg/kg) durante 9 días consecutivos. Se tomaron muestras de bazo, sangre y retinas de las ratas experimentales en el momento del sacrificio y se usaron para el ensayo de proliferación de células T, el análisis serológico, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real y la inmunohistoquímica. El ensayo de proliferación de células T reveló que la betaína tuvo poco efecto sobre la proliferación de células T esplénicas contra el antígeno IRBP en un ensayo in vitro el día 9 después de la inmunización. El análisis serológico mostró que el nivel de superóxido dismutasa sérica aumentó en el grupo tratado con betaína en comparación con el grupo tratado con vehículo.extracto de cistanche tubulosaEl efecto antiinflamatorio de la betaína se confirmó mediante la regulación a la baja de las moléculas relacionadas con la inflamación, incluida la molécula I de adhesión de células vasculares y la interleucina-1 en las retinas de ratas con EAU. Los hallazgos histopatológicos coincidieron con los de la inmunohistoquímica de la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado l, verificando además que la inflamación en la retina y los cuerpos ciliares se suprimieron significativamente en el grupo tratado con betaína en comparación con el grupo tratado con vehículo. Los resultados del presente estudio sugieren que la betaína participa en la mitigación de la EAU a través de actividades antioxidantes y antiinflamatorias.

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Palabras clave:Antiinflamatorio, Antioxidante, Betaína, Uveítis autoinmune experimental, Retina

Introducción

La búsqueda de células T autorreactivas y la infiltración de células inflamatorias, como los monocitos, desencadenan uveítis y retinitis en EAU [6]. La retina se daña por la inflamación con la activación de las células gliales que sufre estrés oxidativo[7].

La betaína, también llamada trimetilglicina (CH: NO:), es una sustancia natural alcaloide y no tóxica de Fructus Lycia, y una sustancia antioxidante representativa [8]. La betaína mejora la inflamación relacionada con la edad en ratas a través de la participación del factor nuclear kB a través de la quinasa inductora del factor nuclear/quinasa I kappa B y las proteínas quinasas activadas por mitógenos [9], la enfermedad cardiovascular humana al suprimir las citoquinas inflamatorias, incluida la interleuquina (IL){{ 6}} y factor de necrosis tumoral-a(TNF-a)[10], y tumorigénesis de colon inducida por sulfato de dextrano sódico [11].Reseñas de cistanche tubulosa,Además, la betaína previno la angiogénesis/neovascularización patológica en ratas con retinitis diabética [12] y protegió las células ganglionares de la retina para aumentar la agudeza visual en un modelo animal de glaucoma [13]. Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos precisos que subyacen a los efectos de la betaína en la uveítis.

En este estudio, se evaluó la eficacia de la betaína para aliviar la EAU. Investigamos el efecto antiinflamatorio de la betaína en EAU según el examen histopatológico y las mediciones de citoquinas. Además, se evaluó el mecanismo específico de la betaína como antioxidante en ratas con EAU.

MATERIALES Y MÉTODOS

animales

Ambos sexos de ratas Lewis (7~9 semanas de edad; Orient Bio Inc, Gyeonggi-do, Corea) se alojaron en nuestras instalaciones en condiciones de laboratorio (12-h ciclo de luz/oscuridad, temperatura 23±2 grados). Todos los procedimientos experimentales se realizaron siguiendo las Pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad Nacional de Jeju (número de permiso: 2020-0012). Todos los protocolos con animales se ajustaron a las leyes internacionales y las políticas de NIH, incluido el Cuidado y uso de animales de laboratorio (publicación de NIH n.º 85-23, 1985, revisada en 1996).

Inducción de EAU

Las ratas se inmunizaron con 200 ul de una emulsión mixta compuesta por un volumen igual de proteína de unión a retinoides interfotorreceptor bovino (IRBP) (1 mg/ml; PTARSVGAADGSS-WEGVGVVPDV, Komabiotech, Seúl, República de Corea) y adyuvante completo de Freund (CFA ) complementado con mg/ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, EE. UU.) en las almohadillas de las patas traseras.

Grupos experimentales

Para evaluar los efectos de la betaína (Fig. 1A) sobre la EAU, se designaron cuatro grupos experimentales de la siguiente manera: control normal (n=8); control CFA (n=8); EAU más vehículo (n=8); y EAU más betaína (n=8). La dosis en el tratamiento para probar el efecto terapéutico de la betaína (1 0 mg/kg de peso corporal/día, B2629, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) se seleccionó en base a un estudio anterior [14]. Las ratas se trataron oralmente con betaína desde el día 0 después de la inmunización hasta el día 9 después de la inmunización.

preparación de tejidos

Las ratas se sacrificaron bajo anestesia profunda mediante inhalación de gas CO2 el día 9 después de la inmunización.cistancheLos tejidos para el examen histopatológico se embebieron en parafina y se seccionaron

con un micrótomo (RM 2135; Leica, Nussloch, Alemania) hasta un espesor de 5 um y teñidas con hematoxilina y eosina. La sangre y las retinas se almacenaron a -80 grados para el análisis del suero y el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.

Ensayo de proliferación de células T

Las células mononucleares de bazo de los animales de cada grupo se disociaron y suspendieron como se describe en nuestro estudio anterior [15]. Luego, se añadieron 10 ug/ml de IRBP (concentración final) a los pocillos. Después de 48 h de estimulación con IRBP, las células se incubaron en 1 μCi de 'H-metil timidina (actividad específica 42 Ci/mmol); Amersham, Arlington Heights, IL, EE. UU.) durante 18 h. Luego, las células se recogieron para medir la incorporación de timidina.

Cistanche puede antienvejecimiento

Análisis serológico

Las ratas se sacrificaron en la fecha de muestreo y se recogió sangre a través del corazón. Las muestras de sangre completa se separaron en suero y células sanguíneas utilizando una centrífuga (VS-5500CFN; Vision Scientific, Daejeon, República de Corea). La actividad de superóxido dismutasa (SOD) en el suero se evaluó utilizando un kit SOD (ab65354; Abcam, Cambridge, Reino Unido).

inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó utilizando el mismo protocolo que el descrito en nuestro estudio anterior [16]. Wako Pure Chemical Industries,Ltd,Osaka, Japón),CD68(ED1;1:800;MCA341,Serotec,Kidlington,UK) y glutamina sintetasa(GS)(1:5,000);MAB302,Chemicon In -ternational, Temecula, CA, EE. UU.) como marcador para microg-lia, macrófagos y células de Müller, respectivamente.

PCR en tiempo real

El ARN total en los globos oculares en todos los grupos (n=5 por grupo) se aisló con el reactivo de aislamiento de ARN TRIzol (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, EE. UU.), y el ADNc se preparó con CellScript M All-in -Una mezcla maestra de síntesis de cDNA 5X First Standard (CellSafe, Gyeonggi-do, República de Corea). La información del cebador se muestra en la Tabla 1. La PCR se realizó con un ciclador MIC (BMS, Queensland, Australia) utilizando 2x SYBR Green (PhileKorea, Seúl, República de Corea) y el siguiente programa: 55 ciclos de desnaturalización (5 s, 95 grado), recocido (20 s, 60 grados) y extensión (10 s, 72 grados).

Análisis de Western Blot

El análisis de transferencia Western se realizó con el mismo protocolo que el descrito en nuestro estudio anterior [16].agua de cistancheLos anticuerpos primarios, incluida la proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch (Keap1)(1:1,000;abl19403,abcam,MA,USA), y el factor 2 relacionado con el factor eritroide-2-nuclear (Nrf2 )(1:1,000;sc-722,Santa cruz,CA,EE.UU.).

análisis estadístico

Todas las mediciones se reportan como el promedio de tres experimentos independientes. Todos los valores se presentan como el error estándar medio de la media (SEM). Los resultados se analizaron utilizando un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba posthoc de Student-Newman-Keuls para comparaciones múltiples. un valor p<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">

RESULTADOS

Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 vs. EAU más Vehículo). Estos datos indican que la betaína no estuvo involucrada con las células T específicas de IRBP o su autorreactividad.

Niveles de SOD en suero regulados al alza de betaína en EAU

Evaluamos el daño oxidativo en el suero, usando SOD como marcador de modificación oxidativa. No se observaron diferencias significativas entre los grupos normal y CFA. La actividad de SOD disminuyó significativamente en el grupo EAU más vehículo, en comparación con los niveles en los grupos de control normal y CFA. El tratamiento con betaína restauró significativamente el nivel de actividad de SOD al de los grupos de control normal y CFA (Fig. 2). Este resultado indica que el tratamiento con betaína suprimió el estrés oxidativo en ratas con EAU.

La betaína redujo la infiltración de células positivas para Ibal en los cuerpos ciliares y retinas de ratas inducidas con EAU

El cuerpo ciliar es el principal sitio de infiltración de células inflamatorias debido a la abundancia de vasos sanguíneos[18]. Solo se detectaron unas pocas células de tipo redondo en los cuerpos ciliares en los grupos normales y CFA (Fig. 3A, 3B), mientras que la infiltración de algunas células de tipo redondo se confirmó en los grupos inducidos por EAU (flechas en la Fig. 3C ,3D). Los grupos normales (Fig. 3E) y CFA (Fig. 3F) mostraron consistentemente resultados similares a los observados para la inmunorreactividad de Ibal. La inmunorreactividad positiva para Ibal aumentó en los grupos EAU más Vehículo y EAU más Betaína (puntas de flecha en la Fig. 3G, 3H). Sin embargo, el número de células positivas para Ibal disminuyó significativamente en el grupo de EAU más Betaína en comparación con el grupo de EAU más Vehículo (Fig. 3I). También analizamos la localización de EDI como un enfoque adicional para evaluar la ubicación precisa de la infiltración de células inflamatorias en el cuerpo ciliar. ED1-células positivas rara vez se detectaron en el normal (Fig. 3G) y CFA (Fig. 3K )grupos. Por el contrario, se detectaron numerosas células positivas para ED1-en los grupos EAU más Vehículo y EAU más Betaína (puntas de flecha dobles en Fig. 3L, 3M).bioflavonoides cítricosUn análisis semicuantitativo del número de células ED1-positivas confirmó que el tratamiento con betaína suprimió la infiltración de células inflamatorias en los cuerpos ciliares de las ratas inducidas con EAU.

A continuación, investigamos los cambios histopatológicos en la retina (Fig. 4). Se detectaron algunas células inflamatorias en retinas con EAU, pero no en retinas de rata normales y CFA (Fig. 4A ~ 4D). Las lesiones se puntuaron histopatológicamente según la gravedad de la EAU [17], lo que reveló un alivio de la inflamación retiniana (Fig. 4E). La activación de células microgliales y de Müller que indica inflamación retiniana se confirmó según la inmunorreactividad global (Fig. 4F~4I) y GS (Fig. 4K~4N), respectivamente. La localización de Ibal en microglia fue muy rara en los grupos normales y CFA (puntas de flecha en la Fig. 4F, 4G, respectivamente). La activación de microglía fue inhibida en ratas EAU (puntas de flecha en la Fig. 4H) por el tratamiento con betaína (Fig. 4I, 4J). El resultado de inmunorreactividad positiva para GS fue similar al de global en la retina (Fig. 4K~4N). Las células de Müller activadas en el grupo EAU más Vehículo tenían niveles de inmunorreactividad de GS más bajos (Fig. 40).

La betaína suprimió la molécula de adhesión y los mediadores proinflamatorios en EAU

A continuación, examinamos la expresión de la molécula de adhesión mediante PCR en tiempo real (Fig. 5A). Se observó una fuerte disminución en el nivel de ARNm de la molécula de adhesión de células vasculares 1 (VCAM1) en el grupo EAU más betaína (p<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">

La betaína reguló al alza las enzimas antioxidantes catalasa (CAT) y SODinEAU

El estudio de los niveles de daño oxidativo en el suero nos llevó a investigar el estado de respuesta antioxidante de las enzimas antioxidantes, incluidas CAT, SOD1, SOD2 y SOD3 (Fig. 5C). Observamos niveles de expresión significativamente aumentados de CAT, SOD1, SOD2 y SOD3 en los globos oculares del grupo EAU más Betaína en comparación con el grupo EAU más Vehículo.

La betaína activó la vía Keapl-Nrf2

Para respaldar el efecto antioxidante de la betaína, se examinó la vía Keapl-Nrf2 (Fig. 6). Los niveles de proteína de Keapl (0.75±0.05 veces cambian,p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">

en comparación con el control normal. Por otro lado, Keapl y Nrf2 mostraron cambios de 1,46±0.00 veces o cambios de 1,13±0,34 veces con respecto a los del grupo EAU más Vehide (p<0.01 and=""><0.001,>

DISCUSIÓN

Este es el primer estudio que informa que la betaína mitiga la progresión de la patogénesis de la EAU a través de efectos antiinflamatorios y antioxidantes, pero no mediante la supresión de la proliferación de células T (Ilustración esquemática en la Fig. 7).

Se cree que el efecto regulador de la betaína en las enfermedades autoinmunes, como se demuestra con EAU, un prototipo de enfermedad autoinmune, se debe a la reducción del estrés oxidativo y los mediadores proinflamatorios, pero no a la proliferación de células T, por la betaína [19]. De manera similar, el presente estudio reveló que la betaína tuvo poco efecto sobre la proliferación de células T y el perfil de citocinas en el sobrenadante del cultivo en un modelo EAU, lo que sugiere que la betaína no influye en la respuesta inmunitaria de proliferación de células T autoinmunes en EAU. La úvea es un órgano diana en la EAU. La úvea y la retina son órganos inmunológicamente aislados sin linfáticos [20]. Las células T autoinmunes en EAU son invadidas a través de una rama de las arterias ciliar y oftálmica [21]. El estrés oxidativo es una señal crítica para la progresión de la respuesta inflamatoria y el aumento de las especies reactivas de oxígeno provoca disfunción endotelial y lesión tisular [22]. Las células endoteliales perturbadas conducen a la promoción del paso de células inflamatorias y moléculas inflamatorias [22]. Los mediadores inflamatorios y las células de la úvea se activan en las células del epitelio pigmentario de la retina, lo que perturba las uniones entre los bastones y los conos y las células epiteliales pigmentadas, lo que lleva a un desprendimiento de retina [23]. El cuerpo ciliar es un sitio de entrada para la inflamación ocular. La inflamación retiniana típica está involucrada en la activación de la microglía residente y la infiltración de células inflamatorias debido a la ruptura de la barrera hematorretiniana [24]. Bajo las condiciones neuropatológicas, incluidos los tumores cerebrales [25], la axotomía [26] y la infección por virus [27], Ibal distinguió los macrófagos activados y la microglía. Además, la microglía residente activada está involucrada en los cambios patológicos que ocurren en las enfermedades degenerativas de la retina y libera mediadores inflamatorios que exacerban el proceso de la enfermedad [28]. Estos resultados sugieren que la betaína ejerce efectos antiinflamatorios en la úvea y el cuerpo ciliar, los principales objetivos de la EAU, y puede reducir el estrés oxidativo en el suero. Sin embargo, queda por estudiar el mecanismo preciso.

La microglía activada es la principal fuente de citocinas proinflamatorias en condiciones degenerativas de la retina [29]. Las citoquinas proinflamatorias, incluidas las IL y el TNF, están fuertemente asociadas con la inflamación ocular [30] y la retinitis [6,29]. Además de la microglía, las células de Müller se activan en todos los eventos patológicos que ocurren en la retina [31]. Las células de Müller activadas participan en el efecto neuroinflamatorio en la retina al sintetizar y liberar moléculas relacionadas con la inflamación [31]. Postulamos que la betaína mitiga la respuesta inflamatoria en ratas inducidas por EAU al suprimir la activación de microglia y células de Müller. La regulación al alza de VCAM1 está muy involucrada en la infiltración de células inflamatorias [32]. VCAM1 se acelera a los fagocitos Tlym CD4 a través de la interacción con el antígeno tardío-4 [3]. Además, Serpina3n, una enzima que inicia inflamación [34], se ha detectado en células de Müller, astrocitos y epitelio pigmentario retiniano de retinas dañadas por la luz [35] y tiene niveles significativamente variables en la retina de Nrl'mouse con células cónicas dañadas [36]. Serpina3n aumenta en EAU ratas con inflamación retiniana severa pero disminuyó significativamente en el grupo EAU tratado con betaína. Se informó un hallazgo similar para la esquizofrenia con neuroinflamación [34], ya que la Serpina3n murina es un ortólogo de la Serpina3 humana [37]. Además, se observó un aumento de la IL-1 en las lesiones de la retina inducidas por el alto contenido de fructosa [38]. Postulamos que el efecto antiinflamatorio de la betaína está asociado con la regulación negativa de VCAM1, Serpina3n e IL-1 en ratas inducidas por EAU. La vía Keep-Nrf2 se utiliza para controlar el estrés oxidativo [39]. La betaína se conocía como una molécula antioxidante, que se asoció con la vía Keapl-Nrf2 en el modelo de lesión hepática aguda inducida por paracetamol [40]. Además, el perfil de expresión génica hepática se realizó después del tratamiento con 3H-1,2-ditiol-3-tiona, que tiene la función de mejorar la desintoxicación de carcinógenos y proteger contra la neoplasia [4]. El resultado de este perfil reveló que el gen inducible por Keap1-Nrf2 regulado por nrf2-dependiente de 3H-1,2-ditiol-3-, incluido AF033381, como la betaína homocisteína metil transferasa se incrementó y se involucró en la desintoxicación y la antioxidación [41]. La respuesta inflamatoria en EAU fue inducida por la infiltración de células inflamatorias, como las células T y los macrófagos [42], y la producción de estrés oxidativo, especialmente en las mitocondrias fotorreceptoras de etapa temprana [43]. Según estos resultados, el tratamiento con betaína era candidato para aliviar el daño tisular inducido por EAU mediante la modulación de la vía Keap1-Nrf2, como vía clave para la regulación del estrés oxidativo.

El efecto antioxidante de la betaína ha sido ampliamente evaluado en modelos de lesiones inducidas por radicales [44]. En el cerebro con daño oxidativo inducido por levodopa, la betaína aumentó hasta los niveles de CAT y SOD, que son enzimas antioxidantes representativas [4]. SOD1, SOD2 y SOD3 se activan por diferentes mecanismos y se localizan en el citoplasma, las mitocondrias y la matriz extracelular, respectivamente [45]. La betaína, como molécula antioxidante, participa en la reducción del daño oxidativo [46]. El estrés oxidativo reducido se extendió a la resolución de la inflamación, indicada por macrófagos/microglía positivos para Ibal en muchas enfermedades, incluida la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple [47]. El tratamiento con betaína aumentó los niveles de ARNm del marcador de estrés oxidativo, en comparación con los del grupo EAU más vehículo. Este resultado implica que el tratamiento con betaína redujo el estrés oxidativo en el sistema circulatorio sin interferir con la proliferación de células T en los órganos inmunitarios del modelo EAU de rata.

En conjunto, el presente estudio sugiere que la betaína puede mitigar la inflamación en las retinas y los cuerpos ciliares de las ratas inducidas por EAU, posiblemente a través de mecanismos antioxidantes y antiinflamatorios.

Este artículo está extraído de https://doi.org/10.5607/en21011