La inducción de inmunidad entrenada periférica en el páncreas incita la actividad antitumoral para controlar la progresión del cáncer de páncreas Parte 2

Discusión

Si bien el tráfico de -glucano se ha caracterizado previamente, el tropismo específico de -glucano al páncreas no se ha informado previamente37. Mostramos que las partículas de glucano pueden ingresar directamente al páncreas y también pueden ser fagocitadas por macrófagos que luego ingresan al páncreas. La relación entre la cavidad peritoneal y el páncreas no ha sido bien definida, y los estudios relacionados con la fisiopatología de la pancreatitis aguda (PA) han identificado que los macrófagos peritoneales son los principales contribuyentes a la respuesta inflamatoria en la PA, lo que respalda una conexión entre el peritoneo y el páncreas38.

De hecho, nuestros datos de imágenes muestran que los macrófagos peritoneales que fagocitan WGP marcados con isótopos se dirigen principalmente al páncreas. Los estudios sobre lesiones hepáticas han respaldado aún más este modelo de un intercambio dinámico de células entre la cavidad peritoneal y los órganos sólidos que es independiente de la circulación 39. En conjunto, esto sugiere que incluso en condiciones homeostáticas existe un nivel basal de intercambio de células inmunitarias entre el páncreas y cavidad peritoneal que puede ser aprovechada en el marco de particulado -glucano.

Los macrófagos son una parte importante del sistema inmunitario innato del cuerpo humano y tienen poderosas funciones de identificación, fagocitación y eliminación de bacterias y sustancias extrañas. La periodontitis, una enfermedad infecciosa crónica caracterizada por inflamación gingival y pérdida de hueso alveolar, es la principal causa de pérdida de dientes en adultos. Ahora está claro que la destrucción tisular de la periodontitis es causada por la respuesta inmunitaria del huésped a la infección, y los macrófagos, como parte importante de la respuesta inmunitaria del huésped, juegan un papel importante en la aparición y el desarrollo de la inflamación.

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Si bien este estudio investigó partículas de -glucano WGP, también puede ser interesante investigar si el -glucano soluble derivado de levadura muestra un tropismo similar y un mecanismo de señalización dentro del páncreas. Se sabe que los -glucanos en partículas emiten señales directamente a través de Dectin-1, mientras que se cree que los -glucanos solubles funcionan a través de una vía dependiente de CR3-para ejercer sus propiedades antitumorales40,41. Un estudio mostró que la administración IP de β-glucano soluble resultó en el tráfico a la sangre periférica y APC en el peritoneo, el bazo y la médula ósea, lo que indica que, a pesar de los diferentes mecanismos de señalización molecular, puede ser posible una capacidad similar para activar la inmunidad entrenada42. Sin embargo, dado que nuestros datos indican que este tráfico depende de dectina-1, solo las partículas de glucano pueden mostrar tráfico directo al páncreas a través de partículas y solubles que pueden iniciar mecanismos de inmunidad entrenada.

Además, estudios previos que caracterizan el tráfico de β-glucano soluble inyectado por vía intravenosa muestran tráfico hacia el bazo, los riñones y el hígado, aunque no mencionan el tropismo hacia el páncreas43. Como no se había pensado anteriormente que el páncreas fuera un objetivo del tráfico de -glucanos, no está claro si el páncreas simplemente nunca se ha estudiado o si no se produce tráfico pancreático.

Los estudios futuros deben abordar la biodistribución de glucano tanto soluble como particulado a través de varias vías de administración.

-El tráfico de glucano al páncreas tiene un impacto multifactorial en las poblaciones inmunitarias presentes en el páncreas. En primer lugar, la llegada de glucano al páncreas afecta directamente a las poblaciones de macrófagos residentes M2 inmunosupresores presentes en el páncreas que se sabe que son importantes en la promoción de tumores pancreáticos. Los datos de CyTOF y scRNA-Seq mostraron una desaparición casi completa de la población de macrófagos residentes 7 días después de la administración de WGP. Curiosamente, la desaparición de la población de macrófagos residentes coincide directamente con la aparición recíproca de una población de macrófagos Ly6Clo. Esta población de macrófagos Ly6Clo tiene marcadores fenotípicos similares a los de la población residente, aunque se inclina más hacia un fenotipo M1.

Por lo tanto, es probable que los macrófagos residentes entren en contacto con el β-glucano que se ha transportado al páncreas y estas células se repolaricen y, por lo tanto, adquieran un fenotipo celular diferente que da como resultado la formación de un grupo único. En segundo lugar, la llegada de -glucano al páncreas da como resultado una señalización amplificada de quimiocina/receptor de quimiocina que recluta macrófagos derivados de monocitos infiltrantes proinflamatorios Ly6CHi desde la periferia hasta el páncreas. Veinticuatro horas después de la administración de WGP, se encuentra que los niveles de CCL2 en lisados ​​pancreáticos completos aumentan 30-veces. En consecuencia, mostramos que la fuerte afluencia celular dependiente de -glucano al páncreas depende de CCR2.

Si bien nos enfocamos en la dinámica del compartimento mieloide debido a la importancia observada de la señalización de CCR2/CCL2, hubo una mejora inicial interesante del grupo 11 el día 3 y luego la desaparición el día 7 después del tratamiento con WGP. El grupo 11 se caracterizó como ILC2 según la expresión de varios marcadores como KLRG1, IL-5, IL-13 e ICOS. Se sabe que las ILC2 son células residentes en tejidos a largo plazo44. Estudios recientes han demostrado que la activación de ILC2 locales por alarminas específicas de tejido induce su proliferación, migración de ganglios linfáticos y diseminación sanguínea. Se ha demostrado que las ILC2 de varios tejidos, como el intestino y el pulmón, ingresan a la sangre por extrusión de estos tejidos perturbados y migran a otros tejidos, como el hígado44–46.

Tal mecanismo podría explicar el aumento inicial y luego la desaparición de ILC2 en el páncreas. Dado que las ILC2 se han implicado recientemente en la respuesta de los tumores pancreáticos a la inmunoterapia47, se justifica más investigación que investigue el impacto de la WGP y el inicio de la inmunidad entrenada en la población de ILC2 del páncreas.

Aunque el inicio de una afluencia de células inmunitarias proinflamatorias al páncreas es importante en sí mismo, es el CCR2 más Ly6CHi infiltrando poblaciones de macrófagos derivados de monocitos de la periferia que muestran características de inmunidad entrenada lo que conlleva las implicaciones más importantes como la inducción de Aún no se ha caracterizado la inmunidad entrenada periférica en el páncreas. Esta inmunidad entrenada inducida también está asociada con la reprogramación metabólica y epigenética.

Si bien se sabe que CCR2 es un receptor importante en el reclutamiento de monocitos, esta es también la primera indicación de que la señalización de CCR2 en los monocitos es un requisito para el establecimiento de la inmunidad entrenada periférica. Se observa que CCR2 más monocitos/macrófagos se han relacionado con metástasis y progresión tumoral48,49. Sin embargo, nuestros datos sugieren que el reclutamiento de monocitos/macrófagos reprogramados y entrenados CCR2 más ejercen fuertes efectos antitumorales.

Esto se demuestra directamente con nuestro experimento de mezcla en el que los ratones que recibieron CCR2 más células mieloides de ratones entrenados con WGP mostraron una carga tumoral significativamente menor en comparación con los ratones que recibieron células mieloides CCR2- del mismo ratón entrenado.

Como mostramos que la inmunidad entrenada periférica se ha establecido en el páncreas, nos preguntamos si estas células podrían ser reactivadas por células tumorales o sus factores secretados. Se demostró que la reexposición de células mieloides pancreáticas entrenadas con WGP in vivo a medios acondicionados para tumores provoca vigorosamente una respuesta entrenada. Kalafati et al. mostró recientemente un papel para los granulocitos en mecanismos antitumorales impulsados ​​por la inmunidad entrenados21, sin embargo, dado su uso de modelos subcutáneos de cáncer, el estudio actualmente informado es la primera instancia que sugiere que las células mieloides en un órgano específico pueden ser entrenadas para reaccionar directamente a células tumorales de ese mismo órgano.

Ha sido bien establecido que las células mieloides son capaces de matar directamente las células tumorales a través de mecanismos de fagocitosis y producción de ROS50–54, y aquí mostramos que el entrenamiento de WGP aumenta significativamente las funcionalidades antitumorales directas de la fagocitosis mejorada de las células tumorales y la citotoxicidad mediada por ROS para células tumorales

Además, mientras destacamos que los medios acondicionados para tumores pueden reactivar las células mieloides entrenadas, también identificamos un factor específico, MIF, en los medios acondicionados para tumores que está involucrado en esta activación. Estos datos sugieren que la inducción de inmunidad entrenada podría participar en mecanismos de inmunovigilancia tumoral. Por ejemplo, en las primeras etapas del desarrollo tumoral, los tumores secretan factores solubles que pueden volver a estimular las células innatas entrenadas, lo que conduce a la erradicación de estas células tumorales.

Luego traducimos esta comprensión del potencial antitumoral de las células mieloides innatas entrenadas que ingresan al páncreas a modelos ortotópicos de PDAC, donde observamos una disminución dramática en la carga tumoral y un aumento en la supervivencia de los ratones que recibieron solo una administración de WGP. Además, demostramos que las células responsables del control del tumor son principalmente células derivadas de CCR2 más mieloides entrenadas. A diferencia de otros modelos propuestos de control de tumores que parecen estar completamente impulsados ​​por la inducción de inmunidad entrenada centralmente en el BM21, en cambio, en este modelo el tráfico temprano de WGP al páncreas y la producción resultante de CCL2 en el páncreas recluta reclutas entrenados CCR2 más células mieloides de la periferia que son las principales responsables de los efectos antitumorales. La WGP que se dirige directamente al páncreas también repolariza los macrófagos M2-similares a los tejidos hacia los macrófagos M1-similares que también pueden restringir la progresión del tumor.

Si bien la reducción del tumor observada en ratones implantados con tumores KPC que habían sido mezclados con CCR2 más células entrenadas fue significativa, no fue tan sorprendente como en ratones que recibieron IP WGP. Esto respalda que los efectos antitumorales de IP WGP son dobles; el reclutamiento de CCR2 más células mieloides antitumorales entrenadas en el páncreas y la repolarización de macrófagos residentes protumorigénicos funcionan en conjunto para provocar respuestas innatas antitumorales que conducen a una carga tumoral reducida en modelos de PDAC.

También observamos la alta expresión de MHCII en estos monocitos/macrófagos entrenados, que probablemente desempeña un papel en el procesamiento de antígenos tumorales y la comunicación con las células T para provocar respuestas inmunitarias adaptativas contra el tumor. Curiosamente, aunque confirmamos que estos mecanismos antitumorales no dependen de las respuestas inmunitarias adaptativas, observamos un aumento significativo de las células T CD8 más presentes en los tumores mixtos CCR2 más. Además, dado que se observó que las células mieloides en los tumores mostraban altos niveles de PD-L1 y que la presencia de células CCR2 plus entrenadas en el páncreas parecía reclutar células T CD8 plus, razonamos que WGP puede potenciar los efectos de los anti -Terapia PD-L1.

Según la literatura, la terapia con mAb anti-PD-L1 por sí sola no tuvo ningún beneficio en la supervivencia, mientras que la combinación de WGP y anti-PD-L1 se sinergizó para producir mejores resultados de supervivencia que la WGP sola55. Esto sugiere que las células inmunitarias innatas entrenadas pueden activar las células inmunitarias adaptativas en el TME, sin embargo, es probable que el microambiente inmunosupresor deba ser superado aún más por los efectos combinados de anti-PD-L1. Es importante destacar que, a pesar de la mejora de la supervivencia, todos los ratones finalmente sucumbieron al tumor, por lo que se justifican futuras investigaciones sobre la optimización de este tratamiento en términos de dosificación y número de tratamientos.

Las células mieloides inmunosupresoras juegan un papel fundamental en la creación de la TME inmunosupresora en PDAC. Aquí, demostramos la capacidad de involucrar a estas células mieloides en el entorno de PDAC a través de la inducción de inmunidad innata entrenada en el páncreas.

Es importante destacar que también mostramos que la capacidad de iniciar la inmunidad entrenada en el páncreas potencia los efectos terapéuticos de la inmunoterapia, como la terapia de bloqueo del punto de control inmunológico anti-PD-L1. Dando mayor aplicabilidad clínica a estos hallazgos, también mostramos que la inducción de inmunidad entrenada en el entorno adyuvante puede disminuir el tamaño del tumor y prolongar la supervivencia. Estos hallazgos enfatizan el potencial del uso de -glucano para dirigirse terapéuticamente a las células mieloides dentro del TME y destacan que la inducción de inmunidad entrenada periférica en el páncreas podría desempeñar un papel importante en la reprogramación del TME supresor de PDAC, lo que podría prolongar la vida de los pacientes. diagnosticado con esta malignidad mortal.

Métodos

Declaración ética.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas éticas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Louisville. Los experimentos se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados 19471 y 19536.

Ratones.

En todos los experimentos se utilizaron ratones machos y hembras de seis a ocho semanas de edad. Los ratones C57BL/6 J de tipo salvaje (WT) se compraron en el Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME, EE. UU.) o se criaron en las instalaciones para animales libres de patógenos específicos (SPF) de la Universidad de Louisville. Los ratones C57BL/6 Dectin-1 knockout (Dectin-1-/-) se describieron anteriormente56. Se adquirieron ratones knockout globales CCR2 de Jackson Laboratory. Los ratones albinos C57BL/6 fueron proporcionados amablemente por el Dr. Jonathan Warawa de la Universidad de Louisville. Se adquirieron ratones NOD/SCID/IL2r Null (NSG) de Jackson Laboratory. El tamaño tumoral máximo permitido por la IUCAC no superaba los 2000 mm3. Se controló diariamente el crecimiento tumoral de los ratones y se les practicó la eutanasia cuando la carga tumoral excedía el tamaño limitado. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12-h a temperatura ambiente con humedad controlada (alrededor del 55 por ciento).

Todos los animales se alojaron en una instalación de barrera y solo se usaron ratones sanos para los experimentos. Todos los ratones tenían al menos 6 semanas de edad y todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con todas las leyes pertinentes y las pautas institucionales proporcionadas por la Instalación de crianza de roedores (RRF) y aprobadas por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC). de la Universidad de Louisville.

Preparación de -glucano.

Biothera proporcionó glucano particulado altamente purificado en forma de partículas de glucano completo (WGP) aislado de Saccharomyces cerevisiae. Antes de su uso, WGP se sonicó suavemente durante 15 s, dos veces con un sonicador Qsonica Q55-110 Q55 (Cole-Parmer) para garantizar que los agregados se rompieran.

Elaboración y uso de DTAF-WGP.

Se mezcló DTAF (Sigma-Aldrich) a 2 mg/ml con una suspensión de 20 mg/ml de WGP en tampón de borato (pH 10,8). Esto se incubó a temperatura ambiente durante 8 h con mezcla continua. Después de la incubación, la WGP se centrifugó y se lavó con DPBS libre de endotoxinas estéril fría (Sigma-Aldrich) cinco veces o hasta que el sobrenadante ya no contenía DTAF visible. La concentración se ajustó a 10 mg/mL en el DPBS libre de endotoxinas para el almacenamiento. Aproximadamente 1 mg de DTAF-WGP se inyectó IP en ratones C57BL/6 y Dectin-1-/- y los órganos se recolectaron 3 días después.

Preparación del 89Zr-WGP.

WGP (100 mg) se mezcló con Deferoxamine SCN (2,7 mg, en 0,8 ml de DMSO) y se suspendió en 10 ml de tampón de carbonato de sodio (0,1 M, pH 9,4) durante la noche. a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación suave. A continuación, la WGP marcada con deferoxamina se lavó con agua desionizada (10 × 40 ml), y se mezclaron 30 mg de WGP marcada con deferoxamina con 3 mCi de oxalato de 89Zr en 2 ml de tampón Tris•HCl (0,5 M, pH 7,5), y luego se incubó a 37 oC durante 60 min con agitación. A continuación, el 89Zr-WGP se centrifugó y se lavó con 3 ml de PBS estéril. La radiactividad de 89Zr-WGP se midió con un calibrador de dosis y se utilizó para estudios in vitro e in vivo.

Biodistribución y exploración PET/CT usando 89Zr-WGP.

Se realizaron imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET)/tomografía computarizada (TC) en ratones C57BL/6 y Dectin-1-/- 48 h después de la inyección IP de 1 mg de 89Zr-WGP puro o inyección de 1 × 106 peritoneal macrófagos que habían sido co-cultivados con 25 ug/ml de 89Zr-WGP durante 2 hy luego lavados suavemente para eliminar el exceso de 89Zr-WGP. Los ratones se escanearon durante 15 min con un Siemens R4 MicroPET seguido de 10 min de tomografía computarizada. Se utilizó el software IAW de Siemens para la adquisición y reconstrucción de la señal PET, y el software IRW de Siemens para fusionar y analizar los datos de imagen.

Al final del estudio de imágenes, se sacrificó a los ratones y se extrajeron los órganos de interés. Para la biodistribución se recogieron 50 uL de sangre periférica mediante una técnica de sangrado retrobulbar. Se recogieron, pesaron y colocaron en un Contador gamma automático 2470 Wizard (PerkinElmer) para medir la radiactividad de cada tejido. Los valores de CPM se calcularon utilizando el software Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Procesamiento pancreático.

Después de la eutanasia, se cosechó el páncreas del ratón y se cortó suavemente en trozos más pequeños usando unas tijeras estériles. Se suspendieron en un tubo de 15 ml en medio completo (RPMI) con tampón de digestión 1X compuesto por 300 U/ml de colagenasa I, 60 U/ml de hialuronidasa y 80 U/ml de DNasa (Sigma). Estos se colocaron en una incubadora rotatoria a 37 grados con 5 por ciento de CO2 durante 15 a 20 min. A continuación, el tampón de digestión se inactivó con RPMI 1640 completo enfriado con hielo y se lavó. Las células se pasaron a través de un filtro de cesta de nailon estéril de 40 µm y se trituraron pequeños trozos de tejido sin digerir utilizando un tapón de jeringa estéril para generar una suspensión de una sola célula. Si se observaba que existía una cantidad apreciable de glóbulos rojos (RBC) en la muestra, se realizaba la lisis de RBC agregando 2 ml de 10x ACK estéril (Thermo Fisher Scientific).

Administración de WGP in vivo.

A los ratones se les administró una dosis intraperitoneal única de 1 mg de WGP suavemente sonicada, perlas de poliestireno de 3 μm (Sigma-Aldrich) o microesferas fluorescentes de 3 μm (Polysciences) (todas de 1 mg en 200 ul de PBS estéril) o 200 ul de PBS estéril en el día 0. Para los estudios de inmunidad típicamente entrenados, 7 días después de la dosis IP inicial, los ratones fueron sacrificados usando CO2, y el páncreas junto con otros tejidos de interés se extirparon y procesaron. Para los estudios de titulación de dosis, se administraron IP 0,5, 1 y 2 mg de WGP en 200 uL de PBS estéril. Para los estudios de titulación de tiempo, se inyectó a los ratones 1 mg de WGP y se recogió el páncreas después de 24 h, 48 h, 3, 7, 10, 16 y 30 días después.

Reestimulación ex vivo.

Para evaluar el fenotipo entrenado de células mononucleares en ratones tratados con WGP o PBS ex vivo, después de procesar el páncreas, las suspensiones de células pancreáticas se sembraron en placas de 24 pocillos y se estimularon con LPS (10 ng/ml), el sobrenadante de KPC cultivado y Pan02 células (40 por ciento) y MIF recombinante (rMIF) (10 ng/ml). MIF fue un obsequio generoso del Dr. Robert Mitchell de la Universidad de Louisville y se expresó, purificó y replegó como aliado procariótico como se describió anteriormente57. Las células se cultivaron en DMEM y se incubaron a 37 grados con 5 por ciento de CO2 durante 5 a 6 h en presencia de brefeldina A 1X (BioLegend). A continuación, las células se recolectaron utilizando un raspador de células, se lavaron, se sedimentaron y luego se tiñeron para determinar la expresión de citoquinas intracelulares.

Ensayo de entrenamiento y reestimulación in vitro.

Los macrófagos peritoneales o las células CD11b plus seleccionadas del páncreas de un ratón se sembraron en una 24-placa de pocillos durante 2 horas a 37 grados y 5 % de CO2 para permitir la unión de las células a las placas, después de lo cual las células flotantes se separaron suavemente. aspirado Las células adheridas se lavaron suavemente con PBS estéril y luego se resuspendieron en 1 ml de DMEM constituido por FBS al 10 por ciento y penicilina/estreptomicina al 1 por ciento.

Para el entrenamiento inicial de las células, se añadieron al pocillo apropiado 25 ug/ml de partículas WGP, 25 ug/ml de micropartículas de poliestireno de 3 μm (Sigma-Aldrich) o 100 ul de PBS y se incubaron durante 24 h. Después de 24 h, los pocillos se lavaron suavemente para eliminar el estímulo inicial y se añadió DMEM nuevo y las células se incubaron con CO2 al 5 por ciento a 37 grados durante 7 días. Después de 7 días, se aspiró el medio y se reemplazó con medio nuevo, y las células se reestimularon con LPS (100 ng/mL), el sobrenadante de células KPC o Pan02 (40 por ciento) o PBS como control. Veinticuatro horas después de la estimulación, se recogieron los sobrenadantes y se usaron en un ELISA para TNF- e IL-6.

Medios condicionados por tumores.

Aproximadamente 1 × 106 células KPC o Pan02 se cultivaron en una placa de seis pocillos en 4 ml de DMEM completo a 37 grados y 5 por ciento de CO2. Después de 3 días, los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -80 grados en alícuotas para usar como medio acondicionado para tumores. Como control, el páncreas de un ratón C57BL/6 se procesó en una suspensión de una sola célula y 1 × 106 de estas células se cultivaron en una placa de seis pozos en 4 mL de DMEM completo y a 37 grados y 5 por ciento de CO2, y los sobrenadantes también se recogieron después de 3 días. Como control, el páncreas de ratones vírgenes se procesó en una suspensión unicelular y se sembró en una placa de seis pocillos durante 1 día. Las células no adherentes se eliminaron por lavado y luego estas células se cultivaron durante 3 días y se recogió el sobrenadante.

Adquisición de macrófagos peritoneales.

Los ratones se sacrificaron y se inyectaron 5 ml de RPMI estéril en el peritoneo con una jeringa de calibre 25-. Se masajeó el abdomen para liberar los macrófagos peritoneales. Se hizo una pequeña incisión y se utilizó una pipeta de transferencia para retirar la suspensión. Luego, la cavidad peritoneal se lavó varias veces con RPMI frío y las células se sedimentaron a 458 × g.

Citometría de flujo.

Las suspensiones de células individuales en PBS con FBS al 1 por ciento se bloquearon con Fc Block murino (anti-CD16/CD32) a 4 grados durante 15 min. Los anticuerpos marcados con fluorocromo para la viabilidad (APC/Cy7) y los marcadores de superficie CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) y CCR2 (R&D Systems) fueron usado. La información relacionada con todos los Abs de flujo se resume en la Tabla complementaria 3. Después de 30 minutos de incubación en la oscuridad a 4 grados, las células se lavaron con PBS frío y se filtraron a través de un filtro de malla de 40 µm. Las muestras se adquirieron con un citómetro FACSCanto II (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Se usó el software FACSDiva versión 6 en FACSCanto para adquirir todos los datos.

tinción intracelular para la expresión de citocinas.

Después de la estimulación, las células se tiñeron para los marcadores de superficie deseados como se describe anteriormente. A continuación, las células se lavaron con PBS frío y se añadieron 500 ul de tampón de fijación (Biolegend) a los tubos, se agitaron brevemente con vórtex y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min. Luego se añadió aproximadamente 1 ml de tampón de permeabilización (Biolegend) y las muestras se centrifugaron a 458 × g durante 5 min a 4 grados, seguido de un lavado más con 1 ml de tampón de permeabilización. Las células se resuspendieron en 200 ul de tampón de permeabilización y las células se tiñeron con anticuerpos contra TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6 e IFN o el control de isotipo respectivo durante la noche a 4 grados. Luego, las células se lavaron, filtraron y los datos se adquirieron usando un citómetro de flujo.

Aislamiento FACS de CD11b más macrófagos para entrenamiento in vitro.

El páncreas se procesó en una suspensión unicelular como se describe anteriormente. Las células se lavaron con 1 ml de PBS y se incubaron con bloque Fc durante 10 minutos a 4 grados, seguido de tinción con colorante de viabilidad (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) y CD11b plus (APC) durante 30 minutos a 4 grados. Las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en tampón de ejecución MACS frío (Miltenyi Biotech). Las células ViabilityCD45 plus CD11b plus se clasificaron usando un FACS Aria III (BD Biosciences). Las células se recolectaron en 50 por ciento de FBS, 40 por ciento de PBS y 10 por ciento de HEPES (Corning). Después de la clasificación, las células se lavaron con PBS y luego se colocaron en placas para el entrenamiento in vitro, como se describió anteriormente.

ELISA.

Los sobrenadantes de las células entrenadas in vitro junto con los estándares se analizaron usando kits ELISA murino TNF- e IL-6 (BioLegend). El ensayo se realizó según las instrucciones del fabricante y todas las condiciones se realizaron por triplicado. También se usó un kit ELISA para rMIF (sistemas R y D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para cuantificar rMIF en medios acondicionados para tumores Pan02 y KPC y el sobrenadante de células pancreáticas cultivadas sin tratar. Para cuantificar las modificaciones de las histonas, se adquirieron kits ELISA (kit de cuantificación de histona H3K4 de trimetilo, kit de cuantificación de histona H3K27 de acetilo, kit de cuantificación de histona H3K27 de trimetilo y kit de cuantificación de histona H3 total) de EpiGentek y los ensayos se realizaron según las indicaciones del fabricante. instrucciones. El lactato se midió mediante el kit I de ensayo de L-lactato (Eton Bioscience).

Análisis de Western Blot.

Las células CD11b plus de ratones inyectados con PBS o WGP (24 h) se separaron usando microperlas CD11b (Miltenyi Biotech). La histona se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Active Motif, Inc.) y la concentración de proteína se determinó utilizando la cuantificación de Bradford. Las histonas se separaron mediante geles SDS-PAGE Tris-HCl al 15 por ciento y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore). La membrana se bloqueó con BSA al 5 % a temperatura ambiente durante 1 hora y se incubó durante la noche a 4 grados con anticuerpos primarios que incluían trimetilhistona H3 (lys4) mAb de conejo, acetilhistona H3 (lys27) XP Rabbit mAb, trimetil -histona H3 (Lys27) Rabbit mAb y histona H3 XP rabbit mAb (Cell Signaling Technology), luego se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (GE Healthcare) a temperatura ambiente durante 1 h. La membrana se desarrolló con Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) y se detectó a través de Medical Film Processor (Konica Minolta Medical & Graphic). Se utilizaron estándares de proteína preteñidos Precision Plus Protein Kaleidoscope como marcador de proteína estándar (Bio-Rad).

qRT-PCR.

Después de aislar las células CD11b plus del páncreas de ratón en ratones tratados con WGP y sin tratar, las células se guardaron en TRIzol. Los ARN se aislaron y se transcribieron inversamente utilizando la amplificación de reactivos de transcripción inversa TaqMan (qRTPCR) utilizando el sistema de detección de RT-PCR de un solo color Bio-Rad MyiQ. Brevemente, el ADNc se amplificó en una mezcla de reacción de 25 uL que constaba de la supermezcla SYBR Green PCR (Bio-Rad), 100 ng de plantilla de ADN complementaria y cebadores seleccionados (200 nM) utilizando las condiciones de ciclo recomendadas.

H más E.

Siete días después de la inyección con PBS/perlas de micropartículas o WGP, se recogieron los páncreas y se fijaron en formalina al 4 por ciento durante 1 semana, seguido de inclusión en parafina de acuerdo con los procedimientos estándar. Los tejidos embebidos en parafina se cortaron en secciones de 5 mm de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E) para el análisis morfológico.

Medición de amilasa sérica.

La amilasa sérica murina se midió usando el kit de ensayo de actividad de amilasa (Millipore Sigma) y se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se inyectó WGP a los ratones y, 7 días después, se extrajo sangre de los ratones mediante una técnica de sangrado retrobulbar. Estas muestras se usaron para analizar la amilasa sérica.

Depleción de células T in vivo.

Las células T se agotaron usando un mAb anti-CD4 solo, mAb antiCD8 solo o mAb anti-CD4 y anti-CD8 juntos. Los anticuerpos se fabricaron internamente. En este procedimiento de agotamiento, a los ratones se les inyectó IP con WGP el día 1 y también se les inyectó IP con 200 µg de mAbs el día 1 y el día 4 durante el período de tratamiento. Los ratones se sacrificaron el día 7 (clon CD4 GK1.5, clon CD8 53-6.72). La eficiencia de agotamiento se confirmó el día 7.

Depleción de células NK in vivo.

Las células NK se agotaron mediante la inyección intraperitoneal de 100 µg de mAb PK136 (producido en el laboratorio del Dr. Jun Yan en la Universidad de Louisville) los días -1 y 5 durante el período de tratamiento. Se inyectó WGP el día 0 y el día 7 se sacrificó a los animales y se evaluó la eficiencia de agotamiento de las células NK tiñendo los tejidos pancreáticos para NK1.1.

Agotamiento de Ly6G.

Los neutrófilos se agotaron inyectando 300 µg de mAb anti-Ly6G (Bio X Cell) o IgG2a de rata de control de isotipo (Bio X Cell) en los días -1, 2 y 6 durante el tratamiento. Aproximadamente 1 mg de WGP se inyectó IP el día 1. Los ratones se sacrificaron el día 7 y se evaluó la eficiencia del agotamiento del páncreas. En el tumor, a los ratones modelo se les inyectaron 300 µg de mAb anti-Ly6G o IgG2a de rata de control de isotipo los días -2, 4, 10 y 16. A los ratones se les administró WGP el día 0 y se les implantaron tumores pancreáticos KPC ortotópicos el día 7. Los ratones se sacrificaron el día 21 y los tejidos pancreáticos se tiñeron con Ly6G para evaluar la eficacia de eliminación de granulocitos en ese momento.

Preparación de muestras de citometría de masas CyTOF.

Los anticuerpos de citometría de masas se adquirieron de Fluidigm o se crearon internamente mediante la conjugación de anticuerpos purificados disponibles en el mercado con el isótopo metálico apropiado utilizando los kits MaxPar X8 Polymer o MCP9 Polymer (Fluidigm). Muestras pancreáticas de tres ratones PBS y tres ratones WGP de 7-días se procesaron en una solución unicelular y se realizó la estimulación ex vivo como se describe anteriormente. Las células se rasparon suavemente de las placas usando un raspador de células estéril, se lavaron con PBS y se colocaron en un tubo de cultivo estéril. Se utilizaron aproximadamente 2 × 106 células por muestra. Primero se tiñeron las células para comprobar su viabilidad con cisplatino 5 uM (Fluidigm) en RPMI 1640 sin suero durante 5 min a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron con RPMI 1640 que contenía FBS al 10 por ciento durante 5 min a 300 × g. Las células se tiñeron con los anticuerpos de superficie durante 30 min a temperatura ambiente y se lavaron dos veces con tampón de tinción Maxpar Cell (Fluidigm).

Para la tinción de citocinas intracelulares, las células se fijaron con 1 ml de tampón 1X Maxpar Fix I durante 30 min a temperatura ambiente y luego se lavaron dos veces con 2 ml de tampón 1X Maxpar Perm-S durante 5 min a 800 × g. A continuación, se añadió el cóctel de anticuerpos citoplásmicos/secretados y se incubó con las células durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, las células se lavaron con 1 ml de tampón 1X Maxpar Perm-S durante 5 min a 800 × g y se secaron suavemente para eliminar todo el líquido del tubo.

A continuación, para teñir los antígenos nucleares, las células se suspendieron en 1 ml de tampón de tinción de antígenos nucleares 1X Maxpar durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió el cóctel de anticuerpos de antígenos nucleares y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces durante 5 min a 800 × g con 2 ml de tampón de permeabilidad de tinción de antígeno nuclear. Finalmente, las células se fijaron con formaldehído al 1,6 por ciento durante 10 min a temperatura ambiente, luego se incubaron durante la noche en 125 nM de IntercalatorIridium (Fluidigm) a 4 grados.

Adquisición de datos CyTOF.

Una vez que las células estuvieron listas para la adquisición, las muestras se lavaron dos veces con Cell Staining Buffer (Fluidigm) y se mantuvieron en hielo mientras se esperaba la adquisición. Directamente antes de la adquisición, las células se suspendieron en una solución 1:9 de solución de adquisición de células: perlas de calibración de elementos EQ 4 (Fluidigm). Se utilizó un sistema Helios CyTOF y, siguiendo los procedimientos de puesta en marcha y ajuste adecuados, las muestras se analizaron a una velocidad menor o igual a 500 eventos/segundo hasta 300,000 eventos. Usando el software CyTOF, los archivos FCS se normalizaron. Archivos FCS y estos archivos estaban listos para el análisis de datos.

Análisis de datos CyTOF.

Los datos de CyTOF se analizaron con FlowJo, el paquete de software CytoBank58 y el flujo de trabajo CyTOF59 que incluye un conjunto de paquetes disponibles en R (r-project.org)60–63. Para el análisis realizado dentro del flujo de trabajo de CyTOF, se usaron archivos de espacio de trabajo de FlowJo exportados desde Flow Workspace y CytoML61.

Secuenciación de ARN: extracción y aislamiento de ARN.

Siete días después de la administración de PBS o WGP IP, se recogieron los páncreas, se procesaron en una suspensión de células individuales, se tiñeron para viabilidad, CD45 y CD11b, y se clasificaron usando un FACS Aria III. Las muestras se prepararon por triplicado para cada grupo experimental. Una vez que se aislaron estas células mieloides, las células se lavaron 2x con PBS enfriado con hielo y luego se lisaron con Trizol (Invitrogen). Los ARN se extrajeron utilizando un kit QIAGEN RNAeasy (QIAGEN).

Se comprobó la integridad del ARN aislado mediante el sistema Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y se cuantificó mediante un ensayo fluorométrico Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se prepararon bibliotecas de mRNA-Seq enriquecidas con poli-A siguiendo el protocolo estándar del kit Universal Plus mRNASeq (Tecan Genomics, Redwood City, CA) usando 10 ng de RNA total.

Todas las muestras se ligaron con adaptadores Illumina y se codificaron individualmente. La ausencia de dímeros adaptadores y un tamaño de biblioteca uniforme de ~300 pb se confirmaron con el Agilent Bioanalyzer 2100. La concentración de la biblioteca y el comportamiento de secuenciación se evaluaron con un aumento estandarizado de PhIX con una celda de flujo de secuenciación Nano MiSeq de Illumina. Se cargaron 1,8 pm de las bibliotecas agrupadas con un 1 % de PhiX en una celda de flujo de secuenciación del kit de alto rendimiento v2 de NextSeq 500/550 75 ciclos y se secuenciaron en el secuenciador Illumina NextSeq 500 con un objetivo de 60 millones de lecturas de 1 x 75 pb por muestra.

secuenciación de ARN.

Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit Universal Plus mRNA-seq con cuantificación de bibliotecas NuQuant® (NuGen). Las seis muestras se distribuyeron en cuatro líneas de secuenciación en una sola ejecución. Los 24 archivos de secuenciación sin procesar de un solo extremo (.fastq)64 se descargaron desde BaseSpace65 de Illumina al servidor KBRIN para su análisis. El control de calidad (QC) de los datos de secuencia sin procesar se realizó mediante FastQC (versión 0.10.1)66. Las secuencias se alinearon con el genoma de referencia del ratón mm10 usando STAR (versión 2.6)67, generando archivos de alineación en formato bam. La expresión diferencial de las transcripciones codificantes de proteínas ENSEMBL se realizó utilizando DESeq268,69. Los recuentos sin procesar se obtuvieron de los archivos de formato bam alineados con STAR mediante HTSeq (versión 0.10.0)70. Los recuentos sin procesar se normalizaron mediante el método Relative Log Expression (RLE) y luego se filtraron para excluir genes con menos de diez recuentos en las muestras71. Los datos de RNA-seq se depositaron con el acceso GEO GSE187464.

Secuenciación de ARN: análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes.

Se utilizó el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) para caracterizar aún más la biología de los genes que comprenden las condiciones de WGP frente a PBS y sus diferencias72. Los conjuntos de genes se obtuvieron de la base de datos de firmas moleculares (MSigDB) para procesos biológicos de ontología génica (GO) y vías de Reactoma. Para cada conjunto de genes, todas las ubicaciones de genes probadas en la comparación de ratones de control tratados con WGP frente a PBS se ordenaron de mayor a menor importancia utilizando valores de p. Este enfoque permite incluir genes altamente regulados hacia arriba y hacia abajo dentro de cada conjunto de genes, un enfoque que refleja con mayor precisión las condiciones en una vía biológica. Para este análisis, a una tabla de conjuntos enriquecidos le sigue un gráfico de enriquecimiento que muestra el perfil de la puntuación de enriquecimiento (ES) y la posición de los miembros del conjunto de genes en la lista ordenada por rango.

Secuenciación de células individuales: aislamiento de células individuales y secuenciación de ARN.

Las células CD45 plus vivas se separaron del páncreas de ratón, se lavaron y se resuspendieron en PBS 1x (sin calcio ni magnesio) que contenía 0,04 por ciento de BSA. Se capturaron células individuales y se construyeron bibliotecas de ADNc con código de barras utilizando el kit de reactivos de 3' de una sola célula Chromium Next GEM (v3.1, 10X Genomics) y el controlador Chromium, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas se agruparon y secuenciaron usando una configuración de 28 pb × 8 pb × 125 pb para lectura1 × índice i7 x lectura2 en Illumina NextSeq 500 con el kit de alto rendimiento de ciclo NextSeq 500/550 150 v2.5 (20024907).

Desde la secuenciación celular: perfiles de expresión génica.

Los archivos Bcl se desmultiplexaron en archivos fastq utilizando el software CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{10}}). El número total de lecturas secuenciadas fue de 506 913 062. Las lecturas fueron de buena calidad según lo determinado por FastQC66. Los recuentos de genes se midieron usando el "recuento" de CellRanger, utilizando el genoma de referencia cell ranger-mm10-3.0.0 para ratones. Se generó una matriz de conteo para cada muestra y una muestra agregada con el número esperado de celdas establecido en 5000.

Los datos de conteo sin procesar determinados por CellRanger se usaron como entrada para un canal de análisis personalizado en R que usa una variedad de herramientas de análisis de una sola célula basadas en Seurat. El diagrama de rodilla (Fig. 7b complementaria) muestra un gráfico que muestra los recuentos de UMI clasificados para cada código de barras de celda para los datos agregados en los tres grupos. Las celdas por encima del punto de inflexión representan posibles dobletes, mientras que las que están debajo de la rodilla representan celdas de fondo. Las medidas de control de calidad de las celdas se analizaron con Seurat v373 y los códigos de barras de las celdas con las siguientes características se eliminaron del análisis: recuentos bajos (posibles celdas de fondo) con un límite de FDR de 0.01 de la función DropletUtils74 "emptyDrops", Recuentos altos (posibles células dobles) con más recuentos que el punto de inflexión del gráfico de rodilla, contenido mitocondrial superior al 30 por ciento y contenido ribosómico superior al 40 por ciento. Los genes (características) se filtraron aún más para eliminar los identificadores de genes retirados y los genes que no se expresaron en al menos dos células. Consulte la Fig. 7a, b complementaria para ver el número inicial y filtrado de códigos de barras y genes celulares.

Los datos de expresión se normalizaron utilizando SCTransform75, donde se realizó una regresión de los genes del ciclo celular, el contenido ribosómico y el contenido mitocondrial. Luego, las celdas se agruparon y la reducción de la dimensión se realizó utilizando UMAP76. Los nombres de los grupos iniciales se asignaron mediante una técnica de puntuación de enriquecimiento GSVA77,78 modificada. Para cada uno de estos grupos, se identificaron los principales genes marcadores. Los genes expresados ​​​​diferencialmente que comparan cada grupo con cada otro grupo (todas las comparaciones por pares) se determinaron utilizando Seurat73 y MAST79. Los datos de scRNA-seq se depositaron con el acceso GEO GSE187464.

Identificación de clusters generados con scRNA-Seq.

Los grupos no derivados de mieloides se clasificaron generalmente como células B (MS4A1), células plasmáticas (SDC1), células T CD8 más (CD3e, C8a), células T CD4 más (CD3e, CD4), células T reguladoras (T -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), células T δ (CD3e, TRGC1, TRGC2, IL7Ra) y células inmunitarias innatas tipo 2 (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg, GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS y Rxrg)80–82. Los neutrófilos se identificaron a través de la expresión de MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8 y ADAM8, aunque pueden estar subrepresentados en estos análisis debido a su bajo contenido de ARN y altos niveles de RNasas intrínsecas83. Las células dendríticas convencionales (cDC) se identificaron mediante la expresión de ITGAX e ITGAE y las DC plasmocitoides (pDC) se identificaron mediante ITGAX y Siglech.

Clasificación de grupos mieloides de scRNA-Seq.

El grupo 5 expresó ITGAMIntADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- y no expresó TNFAIP2, lo que indica que estas células son macrófagos residentes. El clúster 10 expresó ITGAM-HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Los grupos 3 y 4 expresaron ITGAMInt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, lo que sugiere que ambos son subconjuntos de monocitos/macrófagos infiltrantes, aunque los genes inflamatorios mejorados expresados ​​en el grupo 3 se usaron para identificar el grupo 3 como monocitos/macrófagos infiltrantes inflamatorios .

Ensayos de fagocitosis.

El páncreas de ratones inyectados con micropartículas/PBS y ratones entrenados con WGP in vivo se recolectaron 7 días después de la inyección y se procesaron como se describió anteriormente en una suspensión de células individuales. Aproximadamente 2 × 106 se lavaron con HEPES diluido 50x en RPMI 1640 y luego se incubaron en 100 μL de esta solución durante 1 hora a 37 grados para activar las células. El Invitrogen promueve Green S.

Se utilizó el kit de fagocitosis Aureus BioParticlesTM para citometría de flujo (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 100 μL de las partículas reconstituidas o 1 × 106 células tumorales GFP más KPC se agregaron a las células pancreáticas activadas y se incubaron durante 1 hora a 37 grados. Las muestras se agitaron suavemente cada 15 min. La reacción se detuvo agregando 1 ml de PBS frío. Las muestras se incubaron con Fc Block durante 10 minutos a 4 grados, se tiñeron para viabilidad, CD45, CD11b y F4/80 durante 30 minutos a 4 grados y luego se analizaron con un BD FACSCanto. Para el análisis, después de seleccionar células vivas y CD45, se determinó que las células que emitían fluorescencia en el canal FITC eran fagocíticas.

Ensayo de citotoxicidad.

El páncreas de los ratones tratados con WGP y PBS se recolectó y las poblaciones de CD11b plus se aislaron utilizando microesferas magnéticas CD11b plus (Miltenyi Biotec) y un separador autoMACS Pro (Miltenyi Biotec). A continuación, las células CD11b plus purificadas se lavaron y contaron, y se sembraron en placas en una proporción de 1:20 tumor:células efectoras en una placa de 96-pocillos. Todas las muestras experimentales se corrieron por triplicado. Después de sembrar las células CD11b plus, los inhibidores de ROS N-acetil-Lcisteína (NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 μM, Sigma-Aldrich) o DFO (50 μM, Farmacopea Europea) se agregaron a una conjunto de células derivadas de PBS y WGP durante 1 h antes de la adición de 5000 KPC que expresan luciferasa más células tumorales pancreáticas a todos los pocillos. Después de 24 h, de cocultivo, las placas se centrifugaron y se mezclaron 20 µL del sobrenadante con 100 µL del Luciferase Assay Reagent (Promega). La actividad de luciferasa medida en el sobrenadante se correlacionó con las células tumorales que habían sido destruidas por las células efectoras y se midió usando un luminómetro (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). La señal de luciferasa espontánea de las células tumorales en placas se sustrajo de la medición del sobrenadante. Los valores de luciferasa se representan como unidades de luz relativas (RLU).

Modelos tumorales in vivo de cáncer de páncreas.

Una línea celular KPC sobre un fondo C57BL/6 derivada de LSL-KrasG12D/ plus; LSL-Trp53R172H/ más; El modelo de ratón Pdx1-Cre (KPC) se compró a Ximbio. Estas células y Pan02, que fueron un generoso regalo del Dr. Yong Lu de la Universidad de Wake Forest, se usaron en un modelo ortotópico de cáncer de páncreas. Una línea KPC transfectada con GFP y luciferasa (KPCGFP más Luc plus) también fue una generosa contribución del Dr. Michael Dwinell del Medical College of Wisconsin. Estas células se utilizaron exclusivamente en ratones albinos C57BL/6.

Para la implantación del tumor, los ratones se anestesiaron con isoflurano, y el abdomen de los ratones se preparó con betadina y se cubrió de manera estéril. Se realizó una laparotomía media de 2 cm mediante técnica aséptica con instrumental estéril. Después de la laparotomía, se externalizaron el páncreas y el bazo. Las células tumorales se suspendieron en PBS enfriado con hielo y se mezclaron en una proporción de 1:1 con matriz de membrana basal Matrigel (Corning). 0.1 × 106 células tumorales en 50 ul de la solución de PBS-matrigel se inyectaron en la cola del páncreas utilizando una jeringa de insulina de calibre 30-. La formación de una pequeña burbuja indicó una implantación exitosa. El peritoneo se cerró con sutura recubierta trenzada de ácido poliglicólico absorbible 5/0 y la piel se cerró con sutura trenzada de seda no absorbible 5/0. (CP Médico). Se administró buprenorfina para el control del dolor hasta 72 h después de la cirugía y se monitorearon los ratones.

Imágenes en vivo.

A los ratones implantados ortotópicamente con células tumorales GFP más Luciferasa más KPC se les inyectaron IP 150 mg/kg de peso corporal a 100 µl de XenoLight D-Luciferin-K más sustrato bioluminiscente salino (PerkinElmer). Después de 10 minutos, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se colocaron dentro de un Photon Imager de Biospace Lab, que es una modalidad óptica in vivo de bajo nivel de luz dedicada para imágenes bioluminiscentes y fluorescentes. Se tomaron imágenes de ratones y se usaron para medir el tamaño y el crecimiento del tumor.

Modelo de mezcla de tumores.

Los ratones se entrenaron con 1 mg de WGP y 7 días después, las poblaciones de CD11b más CCR2 plus y CD11b más CCR2− se clasificaron y mezclaron 1:1 con células tumorales KPC 1 × 105 células tumorales. Las células se implantaron ortotópicamente en ratones WT y 3 semanas más tarde, los ratones se sacrificaron y se evaluó el tamaño del tumor.

Terapia combinada con mAb anti-PD-L1.

Los ratones C57BL/6 se trataron con WGP el día −7 y se les implantaron tumores pancreáticos ortotópicos KPC el día 0. Los ratones se trataron con 200 µg de mAb anti-PD-L1 anti-ratón (Bio X Cell) o control de isotipo IgG2b de rata (Bio X Cell) los días 3, 7 y 11. A continuación, se controló la supervivencia de los ratones.

WGP como tratamiento.

A los ratones C57BL/6 se les implantaron tumores pancreáticos ortotópicos KPC el día 0 y los días 4 y 11 se les administró a los ratones 1 mg de IP WGP o PBS. A continuación, se controló la supervivencia de los ratones.

Análisis estadístico.

Todos los resultados se repitieron al menos tres veces independientes para verificar a menos que se especifique lo contrario. Se muestran resultados representativos. Los resultados se representan como media ± SEM. Los datos se analizaron mediante una prueba t de Student de dos colas o una prueba U de Mann-Whitney. Las comparaciones de grupos múltiples se realizaron utilizando un ANOVA de una o dos vías seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey. Los análisis de correlación se realizaron utilizando el coeficiente de correlación de Pearson (distribución normal). La significación estadística se fijó en p < 0.05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism Software Versión 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Resumen de informes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Disponibilidad de datos

Los datos fuente se proporcionan en este documento. Los datos de RNASeq están disponibles con el acceso GEO GSE187464 y los datos de scRNA-Seq están disponibles con el acceso GEO GSE187464. Los datos de origen se proporcionan en este documento.

Recibido: 2 de abril de 2021; Aceptado: 17 de enero de 2022.

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Expresiones de gratitud

Los autores desean agradecer al Dr. Wolfgang Zacharias, al Dr. Mei Zhang y a Sabine Waigel del Centro de Genómica del Centro de Cáncer Brown por su ayuda en RNA-Seq y scRNASeq. También nos gustaría agradecer al Dr. Clint Geller por corregir el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NIH R01CA213990 y R01AI128818 (JY). CD y CTW fueron apoyados en parte por NIH P20GM135004. Parte de este trabajo se realizó con la asistencia de UofL Genomics Facility, que cuenta con el apoyo de NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), el Brown Cancer Center y las tarifas de los usuarios. CyTOF se realizó en Functional Immunomics Core respaldado por NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). El apoyo de secuenciación y bioinformática para este trabajo fue proporcionado por NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) y NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). El contenido de este trabajo es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa los puntos de vista oficiales del NIH o del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS).

Contribuciones de autor

AEG diseñó y realizó los experimentos, analizó los datos, interpretó los resultados y escribió el manuscrito. RS, CD y HG contribuyeron al diseño experimental, la adquisición de datos y el análisis de datos. MRW, XH y MZ asistido en la adquisición de datos y preparación de materiales. KA y ECR contribuyeron al análisis computacional y la interpretación de los análisis de RNA-Seq y JHC y ECR contribuyeron al análisis computacional y la interpretación de los análisis de ScRNA-Seq. DT y CTW contribuyeron al análisis de los datos de CyTOF. RAM, H.-gZ e YL contribuyeron con materiales y guiaron el proyecto. RAM realizó una revisión crítica. JY dirigió el diseño experimental y el estudio general, interpretó los datos, supervisó la investigación y ayudó en la redacción y revisión del manuscrito.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Información adicional

Información complementaria La versión en línea contiene material complementario disponible en https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a Jun Yan.

Información de revisión por pares

Nature Communications agradece a George Miller y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Las reimpresiones y la información sobre permisos están disponibles en http://www.nature.com/reprints

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral sobre las reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados y las afiliaciones institucionales.

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