La gestión del oxígeno disuelto por un contactor de membrana de fibra hueca de polipropileno afecta a la crianza del vino

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Resumen

Fondo: Numerosas prácticas enológicas pueden provocar un exceso de oxígeno disuelto en el vino, determinando defectos sensoriales y cromáticos a corto y largo plazo. Por ello, es necesario gestionar el exceso de oxígeno antes del embotellado. Métodos: En este estudio, se realizó la gestión del contenido de oxígeno disuelto mediante un aparato contactor de membrana de fibra hueca de polipropileno en dos vinos de diferentes variedades de uva (Aglianico y Falanghina). Los vinos fueron analizados después de 11- meses de crianza. El contenido de antocianinas y acetaldehído se evaluó por HPLC. Además, otrosfenólicoLos compuestos y las características cromáticas se analizaron por métodos espectrofotométricos. Se realizaron análisis NMR y HR ESIMS para evaluar el número de proantocianinas y pigmentos poliméricos. Resultados: Tras 11 meses de crianza, en ambos vinos se detectó una disminución de SO2 libre y total respecto a los valores iniciales. En los vinos con mayores niveles de oxígeno disuelto se observó una pérdida más notable. No se detectaron diferencias significativas en términos de parámetros de color. En vino tinto con el mayor contenido de oxígeno, una formación masiva de polímerospigmentosy se observaron taninos reactivos BSA, a diferencia de los vinos con niveles de oxígeno más bajos. Conclusión: El estudio demostró que el contactor de membrana puede resultar una herramienta exitosa para gestionar el oxígeno disuelto en los vinos para prevenir su deterioro oxidativo.

Palabras clave: oxidación; contactor de membrana; vino; pigmentos poliméricos

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1. Introducción

El vino es un sistema químicamente dinámico, e incluso después de la fermentación, su composición continúa evolucionando durante el almacenamiento. Estos cambios posteriores a la fermentación se denominan envejecimiento, pero se debe hacer una distinción entre los cambios que se producen durante la fase de maduración (por ejemplo, el almacenamiento a granel del vino en tanques o barricas), cuando todavía se permite la intervención del enólogo, y los que tienen lugar lugar durante la fase de crianza una vez sellado el vino en botella y la única intervención posible se limita a la selección de las condiciones de conservación más adecuadas.

Entre los compuestos del vino, los fenoles son los más afectados por la crianza. Se originan de las uvas (flavonoidesy no flavonoides) y constituyen uno de los parámetros de calidad del vino más importantes. Durante la vinificación y crianza, los compuestos fenólicos sufren principalmenteoxidaciónreacciones, que no solo afectan a la composición fenólica en sí, sino que también determinan cambios en cuanto a características sensoriales, como el color y la astringencia.

Los compuestos fenólicos son los principales reactivos que se oxidan en presencia de oxígeno y metales (Fe3 más Cu2 más), dando lugar a una cascada de transformaciones químicas que pueden provocar un deterioro excesivo del vino [1]. Vinooxidaciónconsiste en una serie de reacciones: primero, el oxígeno se reduce a peróxido de hidrógeno al interactuar con metales de transición, incluidos los iones de hierro y cobre, en presencia de subunidades de catecol que se oxidan a quinonas [2]. Las quinonas reaccionan fuertemente con compuestos nucleófilos, como antioxidantes (dióxido de azufre, glutatión, ácido ascórbico), tioles volátiles aromáticos deseables

(es decir, 3-sulfanilhexanol), tioles aromáticos indeseables (es decir, sulfuro de hidrógeno), aminoácidos (es decir, fenilalanina, metionina) y numerosos polifenoles (principalmente flavonoles). Los productos de estas reacciones pueden conducir a la formación de condensadopigmentos poliméricos—particularmente importante en los vinos tintos— o incluso a la pérdida de color y caracteres varietales [3]. En un paso posterior, las especies ferrosas o cuprosas reaccionan con el peróxido de hidrógeno mediante la reacción de Fenton para producir el radical hidroxilo, un oxidante fuerte, capaz de reaccionar con todos los constituyentes orgánicos en proporción a su concentración [4]. El compuesto orgánico más abundante en el vino es el etanol, que se convierte en acetaldehído una vez oxidado por el radical hidroxilo.

Como consecuencia deoxidación, en el vino tinto, los pigmentos de antocianina nativos se transforman rápidamente en pigmentos más estables a través de varios tipos de reacciones, como reacciones de condensación mediada por aldehído con taninos y reacciones de cicloadición que conducen a la formación de proantocianinas [5]. Las reacciones de oxidación también contribuyen a modificar la astringencia del vino al cambiar la estructura de los taninos como consecuencia de reacciones intra e intermoleculares mediadas por el oxígeno [6]. Estos “productos estabilizados” antocianos o taninos pigmentados persisten mucho más tiempo en el vino que en sus formas iniciales [7]. Por lo tanto, las bajas cantidades de oxígeno en el vino tinto son importantes para estabilizar el color o la astringencia. El propio Pasteur, en sus estudios sobre el vino, teorizó que solo cuando un vino se expone al oxígeno puede desarrollar atributos que lo conviertan en un producto de alta calidad finamente añejado. Durante la vinificación, el oxígeno juega un papel crucial en el proceso de fermentación. Favorece la síntesis de biomasa de levaduras y favorece una buena fermentación. Varios estudios han demostrado que el riesgo de fermentaciones estancadas y lentas se reduce después de adiciones de oxígeno de 10-20 mg/L [8].

En los vinos blancos, la oxidación suele ir asociada a importantes cambios de color. El color marrón normalmente no es deseado porque es un signo de oxidación en el vino blanco de mesa. La coloración marrón puede ser inducida por oxidación enzimática o química mediada por oxígeno. Esta última es más lenta que la oxidación inducida por enzimas. El vino blanco es generalmente más sensible al O que el vino tinto. Incluso pequeñas adiciones de O. al vino blanco pueden conducir a la pérdida de aroma, especialmente afrutado con la aparición de sabores desagradables descritos como caramelo, rancio, alimentos de granja, miel y vegetales cocidos. Las quinonas generadas a partir de la oxidación pueden reaccionar con los tioles mediante la reacción de adición de Michael o generar H2O2, como se informó anteriormente. El ambiente oxidativo a través de todas las fases de la vinificación se correlaciona positivamente con la formación de estos productos. Durante el envejecimiento del vino tinto en barricas de roble, el proceso oxidativo también induce la formación de sotolona a través de la oxidación de la treonina o por la reacción del acetaldehído con el ácido -cetobutírico. La degradación oxidativa de fenilalanina y -feniletanol en un barril también conduce a concentraciones más altas de fenilacetaldehído [9].

Como se describió anteriormente, el oxígeno puede tener efectos beneficiosos o perjudiciales sobre la calidad del vino. El nivel de exposición al oxígeno del vino durante la vinificación o el envejecimiento es crucial ya que puede afectar el producto final. Singleton [10] estimó la cantidad de oxígeno que el vino blanco o tinto podría absorber antes de que aparecieran los defectos oxidativos. En el vino blanco la tolerancia es de unas 10 saturaciones de aire frente al vino tinto que puede tolerar más de 30 saturaciones de aire (180 mLO2/L). También recomendó unas 10 saturaciones para mejorar la calidad del vino tinto.

El manejo del oxígeno durante las fases de vinificación y almacenamiento es, por lo tanto, importante y debe manejarse de acuerdo con los conocimientos adquiridos para evitar la aparición de caracteres oxidativos. Después de la vinificación, el vino suele pasar por una serie de prácticas de estabilización como decantación, refrigeración y filtración que pueden determinar una entrada de oxígeno descontrolada. Además, ahora son comunes los nuevos métodos de vinificación que utilizan tanques de acero inoxidable y sistemas que permiten un microsuministro de oxígeno controlado (microoxigenación). Incluso cuando se han realizado esfuerzos específicos para producir vinos que sean lo más resistentes posible a futuras tomas de oxígeno, todo el oxígeno disuelto descontrolado en el vino puede determinar un mayor desarrollo de caracteres oxidantes una vez embotellado. En este contexto, el uso de un contactor de membrana para gestionar el oxígeno en un vino antes del embotellado podría ser una estrategia exitosa para obtener los mejores vinos posibles.

Los contactores de membrana se encuentran entre los sistemas industriales más utilizados, y esta tecnología ha demostrado ser útil en una variedad de aplicaciones líquido/líquido y gas/líquido en fermentación, productos farmacéuticos, tratamiento de aguas residuales, separaciones quirales, fabricación de semiconductores, carbonatación de bebidas, extracción de iones metálicos. , extracción de proteínas, eliminación de COV de gases residuales, destilación osmótica y desalcoholización del vino [11,12]. Es un dispositivo que logra transferencia de masa gas/líquido o líquido/líquido sin dispersión de una fase dentro de otra. Aunque la tecnología de contactores de membrana se introdujo como herramienta para la gestión de gases en los vinos [13,14], hasta el momento son pocos los estudios que han abordado la eficacia de su aplicación antes del embotellado para regular la evolución de los vinos blancos y tintos durante la crianza en botella.

En este estudio, se realizó una desoxigenación parcial en dos vinos monovarietales: Aglianico y Falanghina. El efecto de la eliminación de oxígeno en varios parámetros del vino como el contenido de acetaldehído y SO2 libre y combinado se evaluó después de 1 1 mes de envejecimiento en botella. Para el vino tinto, también se evaluó el efecto sobre las características cromáticas y los principales compuestos fenólicos.

2. Resultados y Discusión

En este estudio, dos vinos comerciales (Aglianico (R) y Falanghina (W)) fueron sometidos a un proceso de desoxigenación utilizando tecnología de contactor de membrana para obtener tres vinos con niveles decrecientes de oxígeno disuelto (alto (H), medio (M), y baja (L) para cada vino) antes de la fase de embotellado. Después de 11 meses de crianza en botella, los efectos sobre el anhídrido sulfuroso, acetaldehído, caracteres cromáticos,pigmentos poliméricos, VRF, BSA-taninos y fenoles totales fueron evaluados.

2.1. Dióxido de azufre

La concentración de SO2 libre y total se controló después de 11 meses de envejecimiento en el vino Aglianico (Tabla 1). Para todas las muestras se observó una pérdida de SO2 con respecto al tiempo de embotellado (SO libre, 18 mg/L, SO tot, 43 mg/L), y el mayor descenso en los valores de SO2 total se observó en los vinos con mayor contenido de oxígeno en el embotellado (RHO2 y RMO2), como se esperaba.

Durante el proceso de crianza, la forma más abundante de SO2 libre al pH del vino, el ion bisulfito (HSO, en equilibrio con el SO molecular), es consumida por la reacción con el peróxido de hidrógeno y varios componentes electrofílicos del vino, como los producidos por la cascada de oxidación, incluyendo quinona y acetaldehído [15]. En entornos de bodega, es una práctica común medir el llamado “SO libre”, que es la suma de SO molecular y el ion bisulfito. Este último compuesto puede formar aductos covalentes con electrófilos, llamados aglutinantes de SO2, que pueden clasificarse como débiles o fuertes según la constante de disociación de los aductos de sulfito formados. Estos aductos de sulfito se denominan SO unido, y la suma

de SO libre y enlazado da el "SO total". Los SO libres y enlazados están en equilibrio entre sí en el vino. Además, durante la oxidación, por el equilibrio entre estas dos formas de SO2 y por el consumo de SO2 libre, se libera la forma combinada para restablecer el equilibrio. En todos los vinos tintos tratados se detectaron valores de SO2 libre inferiores a 3,84 mg/L tras 11 meses de crianza en botella. Estos valores están muy por debajo del límite de cuantificación de los métodos oficiales de análisis de SO2 libre [16]; por lo tanto, es más correcto considerar despreciable el valor de SO libre, mientras que los valores de SO total, fueron menores en las muestras envasadas con mayor contenido de oxígeno disuelto (RHO2). El cambio entre el envejecimiento del vino libre y combinado podría ser la razón por la cual se detectaron niveles decrecientes de SO2 total en los vinos a medida que aumentaba el oxígeno disuelto en el embotellado. Aparte del consumo de SO2 debido a las reacciones de oxidación, una parte también puede perderse durante el envejecimiento debido a las reacciones del anhídrido sulfuroso con los flavanoles. El mecanismo de formación de productos 4/ß-sulfonados aún es incierto. Se plantea la hipótesis de que los derivados monoméricos 4ß-sulfonados se forman por la despolimerización catalizada por ácido de las proantocianidinas [17].

Las concentraciones de SO2 libre y total (Tabla 1) fueron monitoreadas luego de 11 meses de crianza en vino blanco cuyo comportamiento resultó ser el mismo que en vino tinto. Además, en este caso se detectó una pérdida de SO2 libre y total respecto a los valores iniciales (SO libre, 26 mg/L y SO total, 89 mg/L). Además, los vinos con mayor contenido de oxígeno a embotellado (WHO2) mostró un menor contenido de SO2 libre y total.

El acetaldehído, formado por la oxidación del etanol catalizada por metales durante la oxidación del vino, fue superior a los 11 meses de crianza en la muestra WHO, respecto a la muestra WMO, y WLO, como era de esperar dado el menor contenido de SO libre y total, en la muestra WHO, muestras (Cuadro 2). Debido a que la relación en peso entre el acetaldehído y el dióxido de azufre es 1,4/1 (1,4 mg de SO2 consumido por 1 mg de CH3CHO), pudimos evaluar que la cantidad de acetaldehído en la muestra WHO está totalmente combinada con SO, (50 mg de acetaldehído combinado con 70 mg de SO2) y considerando los niveles insignificantes de dióxido de azufre libre después de 11 meses de envejecimiento, se espera que futuras exposiciones al oxígeno puedan conducir a la aparición de acetaldehído libre.

En vinos tintos, la concentración de acetaldehído no difiere entre las muestras analizadas. Esto probablemente se deba al hecho de que, en presencia de antocianinas y una mayor concentración de flavanoles, el acetaldehído está involucrado en una serie de reacciones con estos fenoles durante el envejecimiento. Como se analiza a continuación, la reacción más importante que involucra acetaldehído, antocianinas y flavonoles es la formación de compuestos con puente de etilo [18,19] y oligómeros enlazados con etilo, que pueden reaccionar con acetaldehído, antocianinas y flavonoles adicionales para generar un pirano. anillo u otras estructuras de tipo polimérico. En última instancia, estos productos pueden alterar los atributos sensoriales del vino [20] al afectar algunas características clave del vino, como el color, el sabor y la astringencia.

2.2. Efecto sobre pigmentos y caracteres cromáticos

Los datos sobre el contenido de antocianinas monoméricas en vinos tintos tratados después de 11 meses de envejecimiento en botella mostraron (Tabla 3 y Materiales complementarios Figura S1) una pérdida de malvidina-3-glucósido en la muestra RHO2 con una concentración de oxígeno más alta que en RMO2 y RLO2. De manera consistente, se detectaron diferencias en términos de antocianinas totales entre vinos (Figura 1). Los vinos con baja concentración de oxígeno al momento del embotellado presentaron una mayor concentración de antocianos nativos totales en comparación con aquellos con mayor concentración de oxígeno disuelto. El efecto del tratamiento de contactor de membrana en varias clases de pigmentos, determinado por el método de Harbertson, incluyó una concentración baja significativa esperada en SPP (pigmentos poliméricos cortos) en las muestras RLO, en comparación con las muestras RHO2 y RMO2 que mostraron el mayor aumento de estos importantes compuestos estables (Tabla 4). Los LPP (pigmentos poliméricos largos) no fueron significativamente diferentes en todas las muestras. Los pigmentos poliméricos (SPP y LPP) se definen como pigmentos resistentes al blanqueo con bisulfito. Se forman por la reacción entre los antocianos y los taninos durante la crianza del vino [21], dando lugar a una estabilización del color con el tiempo. La principal diferencia entre estas dos clases de pigmentos es que, a diferencia del SPP, el LPP tiende a precipitar con la proteína [22]. A medida que el vino tinto envejece, se suele observar una mayor formación de LPP respecto a SPP. Por lo tanto, los cambios detectados para SPP y no para LPP pueden reflejar un estado oxidativo temprano de los vinos Aglianico después de 11 meses de crianza. La participación de las antocianinas nativas en las reacciones que producen nuevos pigmentos poliméricos es consistente con la disminución de las antocianinas nativas totales que se muestra en la (Tabla 4), y con efectos similares observados en los vinos tintos durante la microoxigenación [23].

A medida que el vino envejece y a través de diferentes exposiciones al oxígeno, estos pigmentos poliméricos adquieren una importancia crucial para el color del vino y pequeñas cantidades de acetaldehído pueden reaccionar con las antocianinas para producir nuevos pigmentos rojos estables [19,24]. El hecho de que no se detectaran diferencias significativas en términos de intensidad de color y tonalidad (Tabla 5) probablemente se deba, como ya se observó para LPP, al tiempo relativamente corto de envejecimiento.

2.3. Efecto sobre los pigmentos del vino tinto: análisis NMR y HR ESIMS

Con el objetivo de comprender la base molecular de los cambios observados en los vinos tratados con diferentes niveles de oxígeno, se sometieron muestras de RHO2, RMO2 y RLO a análisis basados ​​en RMN, como se describe en la Sección 3. Una inspección cuidadosa de los Los espectros H-NMR obtenidos de las tres muestras no revelaron ninguna diferencia perceptible entre los tres vinos comparados (Materiales complementarios, Figura S2). Por lo tanto, decidimos investigar los mismos vinos mediante HR ESIMS dada la mayor sensibilidad intrínseca de la técnica en comparación con la espectroscopia de RMN. Los tres vinos fueron fraccionados por HPLC/Vis utilizando una columna C-18. Para cada vino se obtuvieron tres fracciones: la primera fracción se recogió de 15 a 25 min (fracción 1), la segunda de 25 a 30 min (fracción 2), y finalmente una tercera fracción (fracción 3) desde 30 min hasta el final de la corrida cromatográfica. De acuerdo con los datos informados en la literatura [25], en la primera fracción se esperaba que se produjeran antocianinas no acetiladas, mientras que en la segunda fracción se recolectarían piranoantocianinas potenciales. Las tres fracciones obtenidas (1-3) para cada uno de los tres vinos analizados (RHO, RMO y RLO) se sometieron a un análisis ESIMS HR de barrido completo en el modo de iones positivos. En la infracción 1 de todos los vinos, detectamos un pico iónico que se asignó a malvidina-3-O-glucósido (493.1332;△=-1.648; correspondiente a C23H2sO12 plus ), mientras que los picos iónicos se relacionaron con el otro común las antocianinas del vino, cuando se detectaron, presentaron errores superiores a 10 ppm y no se consideraron confiables (Materiales complementarios Figura S3). En cuanto a las fracciones 2 y 3 de RMO2 y RLO, resultaron ser básicamente superponibles entre sí, mientras que los espectros de masas de las fracciones 2 y 3 del RHO, el vino mostró algunas peculiaridades interesantes. Más específicamente, en RHO, fracción 2 se observó un pico iónico centrado en m/z517.1317(△=-4.569; correspondiente a C25H25O12). Este pico se atribuyó a la vitisina B (materiales complementarios, figura S4) [26]. En el espectro de masas de la fracción 3 de RHO, dos picos de iones en m/z809.2294(△=0.827; correspondiente a Ca0H4O18)(Figura de materiales complementarios S5) y 1029.2871(△=-0.065 ; correspondientes a CsH53O25 (Figura de materiales complementarios S6), respectivamente, estaban contenidos. Estos picos de iones eran indicativos de la aparición de pigmentos poliméricos. El pico en m/z 809 se atribuyó a los dímeros con puente de etilideno constituidos por una unidad de malvidina-3-O-glucósido y un resto de (epi)catequina[27I, y el pico en m/z1029 se asignó a la etilideno- dímero con puente constituido por dos unidades de O-glucósido de malvidina-3-, de las cuales una se presentó en su forma de flavilio y la otra en su forma de pseudobase [28,29].

La vitis en B y los pigmentos con puente de etilideno (m/z 809 y 1029) son el resultado de la reacción química entre el acetaldehído y las antocianinas o los flavan-3-oles. El acetaldehído puede actuar como nucleófilo en su posición alfa o como electrófilo en la funcionalidad carbonilo. La reacción entre el nucleófilo acetaldehído y la posición electrófila C4 de las antocianinas conduce a la formación de Vitisina B, un compuesto bastante estable clasificado como piranoantocianina. Por el contrario, cuando el acetaldehído actúa como electrófilo al sufrir un ataque nucleofílico por el C8 y, en menor medida, incluso por las posiciones C6 de los flavan-3-oles o las antocianinas, se forman dímeros con puente de etilideno. No es sorprendente que hayamos observado vitisina B y pigmentos rojos solo en el vino RHO2, ya que tales productos, como se mencionó anteriormente, se forman por la reacción del acetaldehído con antocianinas y flavanoles-3-, y el acetaldehído es una molécula principalmente resultante del proceso oxidativo sufrido por los vinos a lo largo del tiempo mediante la exposición al oxígeno atmosférico. Por lo tanto, cantidades más altas de acetaldehído están ciertamente presentes en RHO, que en RMO y RLO, vinos que parecen haber sido protegidos del oxígeno a un

2.4. Efecto sobre VRF, BSA-Taninos y fenoles totales

Aunque poco después del tratamiento con contactor de membrana, los niveles de fenoles totales fueron similares entre los vinos tratados, después de 11 meses de envejecimiento en botella, el número de fenoles totales fue mayor en la muestra con mayores concentraciones de oxígeno en el embotellado, como se muestra en la Tabla 6. Esto podría deberse probablemente al papel que jugó el oxígeno en la formación de compuestos fenólicos más reactivos al hierro y en una variación de la estructura molecular de las estructuras fenólicas monoméricas y poliméricas como ya se ha demostrado en vinos que experimentan diferentes consumos de oxígeno durante el envejecimiento [6]. Esto se confirma con la tendencia observada en la Tabla 6 para BSA-reactivos a taninos y flavans reactivos a vainillina y en la Tabla 4 para SPP que mostró una diferencia estadística después de los 11 meses de crianza.

mayor medida que RHO2.

Las concentraciones de taninos reactivos a las proteínas BSA se determinaron por el método de Habertson en RHO, RMO y RLO. Durante el envejecimiento, se observó un aumento del nivel de taninos reactivos a BSA en RHO2, consistente con una posible polimerización de estructuras de taninos [27 ]. De hecho, Harbertson [30] mostró que la precipitación de BSA aumentó en función del aumento del grado de polimerización (o tamaño) de trímeros a octámeros. Como consecuencia, cada cambio en la composición y tamaño de los taninos puede afectar su capacidad de reaccionar con BSA. La oxidación de los taninos provoca la formación de enlaces intramoleculares e intermoleculares entre los flavonoides. Este último hace que los polímeros se alarguen y se vuelvan más reactivos a las proteínas salivales [31]. Este tipo de reacciones pueden, de hecho, modificar la estructura del tanino y, por lo tanto, los enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas con las proteínas [32].

Como la astringencia es causada por la agregación inducida por taninos y la precipitación de proteínas salivales [33], el aumento de taninos BSA en RHO2 sugiere que los cambios

experimentada por los taninos mediante estas reacciones durante la crianza podría contribuir a modificar la percepción de la astringencia.

En cambio, los flavans reactivos a la vainillina (VRF) pueden proporcionar más información relacionada con el tamaño de los taninos condensados. De hecho, la vainillina reacciona con el anillo A de los flavanoles en la posición 6 u 8, pero también el acetaldehído reacciona con las mismas posiciones del anillo A de los flavanoles. Por lo tanto, una disminución de VRF puede considerarse como una medida indirecta de la polimerización oxidativa de flavanoles vinculada a reacciones desencadenadas por acetaldehído e involucrando taninos y antocianinas [34].

En nuestro estudio, se observó una concentración ligeramente menor de VRF en la muestra RMO2. La falta de una tendencia clara en función de la cantidad de oxígeno podría deberse al hecho de que estas moléculas también pueden sufrir escisión hidrolítica en presencia de oxígeno por nuevos reordenamientos moleculares con la formación de nuevos enlaces intra e intermoleculares [6].

3. Materiales y Métodos

3.1. Vinos

Se utilizaron dos vinos comerciales tinto Aglianico y blanco Falanghina producidos en el sur de Italia por la bodega Cantina del Taburno. Los detalles de las muestras junto con algunos parámetros básicos se muestran en la Tabla 7. Los parámetros base se determinaron según el compendio de métodos internacionales de análisis de vinos y mostos de la OIV (2007).

3.2. Gestión del oxígeno del vino

Se utilizó un sistema industrial ISIOX (Tebaldi srl) equipado con un contactor de membrana gas-líquido (Liqui-Cel9, Transverse-flow, South Lakes Dr. Charlotte, NC, USA, corte 50 g/mol) y una bomba centrífuga en acero inoxidable. usó. La membrana proporciona una interfaz fija y bien determinada para la transferencia de masa gas/líquido sin pasar de una fase a otra. La estructura del contactor de membrana (fibra hueca hidrofóbica) está hecha de polipropileno (PP) y ofrece un área de contacto (gas/líquido) muy grande de 20 m²2.

El proceso de desoxigenación consta de ciclos continuos en los que el N, el vacío o una combinación de los dos primeros procesos (mezcla) que circula por una superficie de la membrana de polipropileno se enriquece gradualmente con el oxígeno procedente del vino que circula por el otro lado de la membrana. La fuerza impulsora del proceso es la diferencia en la presión parcial de oxígeno a través de la membrana. Durante el proceso, el vino circula continuamente desde un depósito cerrado hasta el aparato de desoxigenación.

Para lograr el nivel requerido de oxígeno, se monitoreó el contenido de oxígeno en el vino a través de todos los procesos hasta que se alcanzó el nivel objetivo.

El control del proceso se realizó mediante la monitorización del nivel de O, en los vinos mediante el uso de un PC incorporado con lógica de programación muy sencilla y sensores específicos, que monitorizan la temperatura y el contenido de oxígeno (sistema de luminiscencia, Hach Lange, rango de medida {{{{2} }}} a 20 mg/LO, resolución: 0,01 mg/L O2, precisión:0-5mg/LO2±0,1). Para controlar la presión de entrada y salida se utilizaron presostatos electrónicos, así como la presión del gas en el proceso y el nivel de cualquier vacío.

Se aplicaron diferentes tratamientos de desoxigenación al vino para obtener diferentes muestras con diferentes contenidos de oxígeno. La cantidad de oxígeno en el vino blanco fue respectivamente O2 blanco alto, OMS2=2.7 mg/L, O2 blanco medio, OMM2=1 mg/L, O2 blanco bajo, WLO2= 0. 25mg/L.

La cantidad de oxígeno en el vino tinto fue respectivamente tinto alto O, RHO,=1 mg/L, tinto Medio O2, RMO2=0.5 mg/L, tinto Bajo O2, RLO2=0 .2 mg/L. Ambos conjuntos de vinos fueron filtrados a 1 μm antes de ser inyectados en la máquina, con el fin de evitar el fenómeno de ensuciamiento y humectación de membranas [35].

3.3. Muestras Embotellado y Envejecimiento

Después de los tratamientos, los vinos se embotellaron y todas las botellas se sellaron con tapones sintéticos coextruidos Nomacorc (Nomacorc SA, Thimister Clermont, Bélgica) verde selecto 100, que permiten que el oxígeno pase a través del corcho en un de forma controlada (0,4 mg O2 a los 3 meses, 0,7 mg O a los 6 meses, 1,2 mg O a los 12 meses y 1,1 mg O al año del primer año de crianza). Las botellas se envejecieron durante 11 meses a 15 grados.

3.4. Métodos de análisis

3.4.1. Determinación de acetaldehído por cromatografía líquida de alta resolución

Los análisis de acetaldehído se realizaron derivatizando vino de muestra experimental y HPLC.

El análisis de derivatización fue el siguiente: se dispensaron 100 μL de muestra de vino en un vial, seguido de la adición de 20 μL de solución de SO recién preparada de 1,120 mg/L, 20 μL de ácido sulfúrico al 25 % (reactivo de Carlo Erba al 96 %) y 140 μL de 2 g /L2,4-reactivo de dinitrofenilhidrazina. Después de mezclar, la solución se dejó reaccionar durante 15 minutos a 65 grados y luego se enfrió rápidamente a temperatura ambiente [36].

El HPLC utilizado fue un aparato Shimadzu LC10 ADVP (Shimadzu Italia, Milán, Italia) equipado con un controlador de sistema SCL-10AVP, dos bombas LC-10ADVP para crear el gradiente de disolvente necesario , un detector SPD-M 10 AVP, y un sistema de inyección full Rheodyne modelo 7725 (Rheodyne, Cotati, CA, USA). La separación se llevó a cabo en una columna Waters Spherisorb (C 18, sustrato de partículas de sílice, ODS2 250x4,6 mm, diámetro de partículas de 5 um, tamaño de poro de 80 A) equipada con una precolumna. La eficiencia óptima de separación se obtuvo utilizando un caudal de 0,75 ml/min, temperatura de columna de 35 grados; Los solventes de la fase móvil fueron: (A) 0,5 por ciento de ácido fórmico (Sigma Aldrich mayor o igual al 95 por ciento) en agua milli-Q (Sigma Aldrich) y (B) acetonitrilo (Sigma Aldrich mayor o igual al 99,9 por ciento) ; protocolo de elución de gradiente fue: 35 por ciento B a 60 por ciento B (t=8 min), 60 por ciento B a 90 por ciento B (t =13 min), 90 por ciento B a 95 por ciento B (t{{29 }} min,2-min hold), 95 por ciento B a 35 por ciento B（t=17 min, 4-min hold）, tiempo de ejecución total, 21 min, inyecciones de muestras 50 μL y el la detección se realizó controlando las señales de absorbancia a 365 nm.

The calibration curves were made up by injecting 5 solutions(in triplicate) containing their respective standards covering the range of linearity 10-120mg/L and were characterized by a correlation coefficient (R7)>0.976. Se realizaron tres réplicas analíticas por cada réplica experimental.

3.4.2. Análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de antocianinas

Los análisis de antocianinas nativas se realizaron con un aparato HPLC Shimadzu LC10 ADVP (Shimadzu Italia, Milán, Italia) equipado con un controlador de sistema SCL-10AVP, dos bombas LC-10ADVP para crear el gradiente de solvente necesario, un detector SPD-M 10 AVP, y un sistema de inyección full Rheodyne modelo 7725 (Rheodyne, Cotati, CA, USA). Según el método descrito en el Compendio de Métodos Internacionales de Análisis de Vinos y Mostos de la OIV [37].

Los solventes de HPLC fueron los siguientes: solvente A: agua mili-O (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)/ácido fórmico (Sigma-Aldrich Mayor o igual al 95 por ciento)/acetonitrilo (SigmaAldrich Mayor o igual al 99,9 por ciento) (87:10:3)/v; disolvente B: agua/ácido fórmico/acetonitrilo (40:10:50)o/v. El gradiente fue: condiciones de tiempo cero 94 por ciento A y 6 por ciento B; después de 15 min, las bombas se ajustaron al 70 por ciento de A y al 30 por ciento de B, a los 30 min al 50 por ciento de A y al 50 por ciento de B, a los 35 min al 40 por ciento de A y al 60 por ciento de B, a los 41 min, al final del análisis, a 94 por ciento A y 6 por ciento B. Se aplicó un tiempo de reequilibrio de 5 min antes de los análisis sucesivos según lo informado por [38]. La columna utilizada para los análisis fue una columna de agua

Se utilizó una columna de orbe de esfera (C 18, sustrato de partículas de sílice, ODS2 250 × 4,6 mm, diámetro de partículas de 5 μm, tamaño de poro de 80 A) con una precolumna. Se inyectó una cantidad de 50 μL de estándares de calibración o vino en la columna. Se detectaron las señales de absorbancia a 520 nm. La sensibilidad del detector fue de 0,01 unidades de absorbancia a escala completa (AUFS). Todas las muestras se filtraron a través de filtros de membrana Durapore de 0,45 um (Millipore-Irlanda) en viales de vidrio y se inyectaron inmediatamente en el sistema de HPLC.

La curva de calibración se obtuvo inyectando 5 soluciones (por triplicado) que contenían concentraciones crecientes de malvidin-3-monoglucósido (Extrasynthese, Lyon, Francia). La calibración se caracterizó por un coeficiente de correlación (R')=0.996. El rango de linealidad de la curva de calibración fue 2-200 mg/L. La precisión del método utilizado se comprobó mediante seis análisis repetidos de una muestra de vino tinto que contenía 118,4 mg/l de antocianinas monoméricas totales. El coeficiente de variación se incluyó entre el 1,1 por ciento (para malvidina 3-monoglucósido) y el 9,1 por ciento (para malvidina 3-(6II-cumaroil)-glucósido) y demostró la buena reproducibilidad del análisis HPLC. Las concentraciones de antocianinas monoméricas se expresaron como mg/L de monoglucósido de malvidina-3-.

El fraccionamiento de los vinos RLO2, RMO2 y RHO2 se realizó de acuerdo con el método de análisis OIV usando el mismo HPLC Shimadzu LC10 ADVP que se informó anteriormente. Se realizaron tres réplicas analíticas por cada réplica experimental.

3.4.3. Análisis de espectrometría de masas de ionización por electropulverización de alta resolución (HR ESIMS) de vinos tintos

La separación por HPLC de los vinos tintos realizada como se ha descrito anteriormente proporcionó tres fracciones para cada vino. La primera fracción se recolectó de 15 a 25 min (fracción 1), la segunda de 25 a 30 min (fracción 2), y la tercera fracción (fracción 3) de 30 min hasta el final de la cromatografía. correr (45 minutos). Cada fracción recolectada se secó, se solubilizó en metanol y se analizó mediante HR-ESIMS en inyección de flujo continuo en el modo de iones positivos. Los experimentos HR ESIMS se realizaron en un sistema cuaternario Agilent 1260 Infinity IⅡ HPLC acoplado a un instrumento MS (FTMS) híbrido de transformada de Fourier con trampa de iones lineal LTQOrbitrap XL equipado con una fuente ESI ION MAX (Thermo-Fisher). Se utilizaron los siguientes ajustes de fuente (rango de masas m/z 100-2000): voltaje de pulverización 4,5 kV, temperatura capilar 300 grados, voltaje capilar 15 V, gas envolvente 20 y gas auxiliar 21 (unidades arbitrarias), voltaje de lente de tubo 140 V, y 25 por ciento de energía de colisión. El cálculo de las fórmulas elementales se realizó utilizando el software Xcalibur v 2.0.7 con una restricción de tolerancia de masa de 5 ppm.

3.4.4. Experimentos de RMN

Una cantidad de 2 mL de cada muestra de vino (RHO2, RMO2 y RLO2) se liofilizó y solubilizó en 700 μL de CDOD (6H 3,31; 5c49,0 ppm). Los experimentos de RMN se realizaron en un espectrómetro Varian Unity Inova 700 equipado con una sonda de frío HCN mejorada 13C y utilizando tubos de RMN Shigemi de 5 mm. Se empleó la secuencia de pulsos Varian estándar de H-NMR.

3.4.5.Análisis químicos estándar y medición espectrofotométrica

Según "OIV Compendium of International Wine and Must Analysis of Wine and Musts Analysis 2007"[37], el análisis químico estándar (grado alcohólico calculado por volumen, azúcares reductores, acidez total, pH, acidez volátil, acidez málica y materia seca total ) fue medido.

Los análisis espectrofotométricos se realizaron con un espectrofotómetro Jenway 7305. Las características cromáticas, la intensidad del color y el matiz se determinaron según los métodos de la OIV [37]. La intensidad del color se determinó como la suma de abs 420 nm, abs 520 nm y abs 620 nm, y el tono como la relación abs 420 nm/abs 520 nm.

Los taninos reactivos con BSA, los pigmentos poliméricos cortos (SPP), los pigmentos poliméricos grandes (LPP) y los fenoles totales fueron determinados por Harbertson et al. ensayo [22]. Los pigmentos poliméricos cortos (SPP) y los pigmentos poliméricos grandes (LPP) se obtuvieron combinando el análisis del sobrenadante obtenido después de la precipitación de proteínas utilizando albúmina de suero bovino BSA

(Sigma-Aldrich) con el blanqueo con bisulfito de pigmentos en vino. El complejo BSA-tanino en el sedimento se volvió a disolver, se añadió cloruro férrico y se leyó a 510 nm. Los fenoles totales se cuantificaron leyendo a 510 nm la muestra de la siguiente manera: se agregaron 50 μL de vino a 825 μL de tampón C y se leyeron en el espectrofotómetro como una solución en blanco. Después de la adición de 125 μL de cloruro férrico, se volvió a leer la muestra para cuantificar la cantidad de fenoles reactivos con el hierro.

Los flavans reactivos a la vainillina (VRF) se determinaron según Gambuti et al. [39]. Brevemente, se agregaron 750 μL de una solución de vainillina (4 por ciento en metanol) a 125 μL de vino diluido y, después de 5 min, se agregaron 375 μL de ácido clorhídrico concentrado. Después de una incubación 15-min de la mezcla a 20 grados, se determinó la absorbancia a 500 nm y se leyó frente a una solución en blanco en la que se usó metanol puro en lugar de la solución de vainillina. Las concentraciones se calcularon como( más )-catequina (mg/l).

3.4.6. Análisis estadístico

Los datos cuantitativos se compararon mediante el procedimiento de diferencias mínimas significativas de Tukey, toda la varianza resultó homogénea. Cuando las varianzas no fueron homogéneas, los datos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Cuando los resultados de la prueba de Kruskal-Wallis fueron significativos (p<0.05), the="" significance="" of="" between-group="" differences="" was="" determined="" by="" the="" bonferroni-dunn="" test="" (5%="" significance="" level).="" these="" analyses="" were="" performed="" using="" xlstat(version="" 2013.6.04;="" addinsoft,="" paris,="" france).="" all="" data="" are="" means="" of="" three="">

4. Conclusiones

Los resultados obtenidos en este estudio confirmaron que los diferentes contenidos de oxígeno en el vino embotellado tienen un impacto en el envejecimiento y la oxidación del vino.

La gestión del oxígeno en el vino Aglianico mediante un contratista de membrana de fibra hueca de polipropileno determinó, tras 11 meses de envejecimiento, un menor contenido de SO2 libre y total en la muestra con mayor nivel de oxígeno disuelto. El mismo comportamiento se observó en el vino Falanghina con un aumento en términos de acetaldehído en la muestra con mayores niveles de oxígeno.

En cuanto a los compuestos fenólicos, se observó una mayor pérdida de antocianos nativos totales en los vinos tintos. Su contenido fue mayor en el vino con menor concentración de oxígeno. Sin embargo, la pérdida de antocianos nativos totales no afectó los parámetros de color de los vinos, como la intensidad del color y la tonalidad.

Los taninos reactivos a BSA y los flavanos reactivos a la vainillina fueron menores en las muestras con contenido medio y bajo de oxígeno con respecto a las muestras con mayor contenido de oxígeno. Esto se debe a que el oxígeno, al participar en reacciones de oxidación, concurre a la formación de pigmentos poliméricos. Como era de esperar, en los vinos tintos con mayor contenido de oxígeno disuelto después del tratamiento con contactor de membrana, la Vitisina B, los dímeros con puente de etilideno y el acetaldehído fueron más abundantes en comparación con los vinos tratados con menor contenido de oxígeno en la fase previa al embotellado. .

En conclusión, la desoxigenación del vino mediante membranas puede ser una técnica adecuada para que la industria vitivinícola prevenga todos aquellos fenómenos oxidativos que puedan alterar la calidad final de los vinos tintos y blancos afectando el contenido de anhídrido sulfuroso y acetaldehído (especialmente en los vinos blancos) . Sin embargo, los enólogos deben considerar que la disminución del contenido de oxígeno puede afectar la estabilidad del color en los vinos tintos.

Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea. Figura S1: Ampliaciones de espectros H-NMR de vinos RHO, RMO2 y RLO, registrados en CD: OD. Figura S2: Estructura de malvidina 3-O-glucósido y HR ESIMS relativo en el modo de iones positivos. Figura S3: Estructura de Vitisina B y HR ESIMS relativo en el modo de iones positivos. Figura S4: Estructura del dímero con puente de etilideno constituido por una unidad de malvidina 3-O-glucósido (abajo) y una unidad de (epi)catequina (arriba) con el HR ESIMS relativo en el modo de iones positivos. Figura S5: Estructura del dímero con puente de etilideno constituido por dos unidades de malvidina 3-O-glucósido, de las cuales la de abajo está en forma de flavilio y la de arriba en forma de pseudobase, junto con el HR ESIMS relativo en modo de iones positivos.

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