El mecanismo de Cistanche Deserticola que promueve la función intestinal

Yuan Gao, Chuanjie Zong, Fen Liu, Lei Fang, Runlan Cai, Yue Shi, Xi Chen, Yun Qi

Resumen

Feniletanoideglucósidos(PhG), una clase de compuestos polifenólicos, se consideran uno de los principales constituyentes bioactivos deCistanchedeserticolaYC Ma (CD), cuyo extracto se utiliza por vía oral en la medicina tradicional china. Aunque estudios farmacológicos previos informaron que las PhG ejercen muchas actividades, sus perfiles de transporte intestinal no se han aclarado. En este estudio, investigamos la permeabilidad intestinal de un extracto rico en PhG (PRE) deCistancheDeserticolacomo un sistema integrado en el modelo de monocapa de células Caco-2 utilizando un sistema de bioensayo. Los resultados mostraron que PRE se transporta principalmente a través de difusión pasiva pobremente absorbida por un gradiente de concentración sin eflujo, lo que proporciona la base farmacocinética para la aplicación clínica de PhG enCistanche Desertica. También determinamos la permeabilidad intestinal de tres principalesPhG[actósido (AC), isoactósido (IS) y equinacósido (EC)]por HLPC. Además, desarrollamos un nuevo método de detección de fluorescencia por HPLC para determinar con precisión la cantidad de flujo de CA e IS. Como era de esperar, las características de transporte de los tresPhGson consistentes con los de PRE, indicando que el presente sistema de bioensayo es apropiado y confiable para la evaluación de las características de transporte de grupos de ingredientes activos (AIG) en PRE. Además, este sistema también puede ser adecuado para otros extractos de plantas con una bioactividad adecuada.

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Introducción

La línea celular Caco-2, que se derivó de adenocarcinomas de colon humanos, exhibe características similares a las de los enterocitos. En condiciones normales, las células Caco-2 se diferencian espontáneamente de las células maduras y forman monocapas intactas [1]. Las células adyacentes se adhieren a través de uniones estrechas formadas en el lado apical de la monocapa, que pueden discriminar los fármacos transportados pasiva y activamente a través de la capa epitelial [2]. Debido a la similitud morfológica y bioquímica con los enterocitos normales, las monocapas de células Caco-2 sirven como un modelo in vitro bien aceptado para el estudio del potencial de absorción intestinal y las características de transporte de los fármacos [3, 4].

A diferencia de los productos químicos, los extractos de plantas (PE) son mezclas cuya actividad biológica y componentes activos a menudo no están bien identificados [5]. Además, las propiedades de transporte intestinal de la PE, a diferencia de las propiedades de sus constituyentes, están estrechamente relacionadas con el uso clínico. Las mediciones de flujo para una muestra de prueba a través de una monocapa de células Caco-2 comúnmente involucran métodos químicos, como HPLC, LC/MS, etc. Aunque estos métodos son herramientas poderosas, son complejos, requieren mucho tiempo, son costosos y ocasionalmente requieren equipos sofisticados. Más importante aún, ni un solo componente ni uno minoritario pueden reflejar el PE como un todo. Por lo tanto, se debe establecer un enfoque novedoso independiente de la determinación de los constituyentes para identificar y evaluar las características de transporte del PE.

CistanchedeserticolaYC Ma (CD), una planta holoparásita, es una medicina tradicional china común que se usa principalmente para tratar la deficiencia renal, la debilidad corporal y el estreñimiento, y estos usos se han registrado oficialmente en la Farmacopea China [6]. Los glucósidos feniletanoides (PhG), incluidos el equinacósido (EC), el acteósido (AC), el isoactósido (IS), etc., son una clase de compuestos polifenólicos [7]. Se consideran uno de los principales constituyentes bioactivos deCistancheespecie [8]. Los estudios farmacológicos han demostrado que la bioactividad dePhGes diversa e incluye efectos antioxidantes [9], antifatiga [10], hepatoprotectores [11], inmunomoduladores [12], antiinflamatorios [7, 13] y neuroprotectores [14]. Sin embargo, las características del transporte intestinal dePhGno han sido investigados. En este estudio, exploramos la permeabilidad intestinal de un extracto rico en PhG (PRE) de CD como un sistema integrado y la permeabilidad de tres PhG principales (AC, IS y EC) en células Caco-2 diferenciadas. Nuestros resultados indicaron que el PRE se transporta principalmente a través de una difusión pasiva pobremente absorbida por un gradiente de concentración sin eflujo, lo que proporciona la base farmacocinética para la aplicación clínica de las PhG en la EC.

Materiales y métodos

Materiales

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS and EC (>98 por ciento) se compraron a Must Biotechnology Co. (Chengdu, China). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero bovino fetal (FBS) y los aminoácidos no esenciales (NEAA) fueron producidos por Gibco BRL (Grand Island, NY, EE. UU.). Las placas 6-well TranswellTM (área de crecimiento de la membrana de inserción 4,67 cm2) se obtuvieron de Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, EE. UU.). El colágeno de cola de rata se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). Todos los reactivos y productos químicos para el análisis de HPLC eran de calidad analítica.

Elaboración de PRE a partir de Cistanche deserticola

El material de CD secado al aire se pulverizó y se extrajo por percolación con etanol al 70 por ciento. La fracción rica en PhG se preparó como se describió previamente [10] y se extrajo con alcohol n-butílico saturado con agua. El licor de extracto se concentró y se secó a presión reducida. La espectrofotometría UV de resina macroporosa [15] midió un contenido de PhG del 78,4 por ciento. La muestra final representó un rendimiento de 1,75 por ciento de materia prima por peso seco. La muestra obtenida se almacenó a -20 grados hasta su uso posterior.

Determinación de AC, IS y EC por HPLC

Se usó un sistema HPLC Shimadzu equipado con el software de solución LC para analizar los contenidos de AC, IS y EC en PRE. Se utilizó una columna Intersil C18 de fase inversa (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) y se mantuvo a temperatura ambiente. Las fases móviles fueron acetonitrilo y agua que contenía 0,1 por ciento de ácido fosfórico (v/v) con elución en gradiente (Tabla 1) a un caudal de 1,0 ml/min. El detector del espectrofotómetro UV se ajustó a 334 nm. Para determinar con precisión el flujo de CA e IS, desarrollamos un nuevo método de detección de fluorescencia por HPLC (HPLC-FLD). Después de un análisis estructural y escaneo de longitud de onda de fluorescencia (datos no mostrados), obtuvimos las condiciones óptimas de detección de fluorescencia para CA (Ej: 338 nm, Em: 448 nm) e IS (Ej: 320 nm, Em: 434 nm)

El método analítico de HPLC se validó utilizando las siguientes características de rendimiento: estabilidad, linealidad, sensibilidad, precisión (variabilidad intra e interdiaria) y exactitud. Los analitos en el tampón de transporte se almacenaron a 25 grados en la oscuridad durante 24 horas y se midió su estabilidad. Los analitos fueron altamente estables en presencia de vitamina C (0.4 por ciento) porque los valores de desviación estándar relativa (RSD) en las áreas de los picos fueron < 3.5="" por="" ciento.="" la="" ecuación="" de="" regresión="" lineal,="" el="" coeficiente="" de="" correlación,="" el="" rango="" de="" linealidad,="" el="" lod="" y="" el="" loq="" para="" ac,="" is="" y="" ec="" se="" muestran="" en="" la="" tabla="" 2.="" los="" lod="" (18–30="" nm)="" y="" loq="" (60–100="" nm)="" los="" valores="" ilustran="" que="" los="" métodos="" hplc-fld="" y="" hplc-uv="" son="" muy="" sensibles.="" los="" valores="" rsd="" que="" expresan="" la="" precisión="" del="" método="" fueron="" todos="">< 2="" por="" ciento="" para="" la="" variabilidad="" intradía="" e="" interdiaria,="" lo="" que="" indica="" una="" buena="" precisión.="" para="" la="" evaluación="" de="" la="" recuperación,="" se="" agregaron="" ac,="" is="" y="" ec="" al="" tampón="" de="" transporte="" para="" producir="" tres="" niveles="" de="" concentración="" (alto,="" medio="" y="" bajo).="" los="" valores="" de="" recuperación="" del="" método="" para="" los="" analitos="" se="" resumen="" en="" la="" tabla="" 3.="" las="" recuperaciones="" promedio="" oscilaron="" entre="" el="" 90,0="" %="" y="" el="" 96,4="" %,="" lo="" que="" indica="" una="" buena="" precisión.="" en="" conclusión,="" los="" métodos="" de="" hplc="" establecidos="" son="" satisfactorios="" con="" respecto="" a="" la="" linealidad,="" sensibilidad,="" precisión="" y="" exactitud="" para="" la="" cuantificación="" de="" ac,="" is="" y="" ec="" en="" el="" tampón="" de="">

Determinación de PRE por sistema de bioensayo

El bioensayo (capacidad antioxidante total) se basó en el ensayo FRAP (poder antioxidante/reductor férrico) que describimos anteriormente [16] y validamos en términos de linealidad y precisión (variabilidad intradía e interdía). La linealidad del método de bioensayo se determinó en base a las curvas de calibración. El rango de concentración de linealidad fue 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x más 0.0968, R2=0.996). La precisión del método de bioensayo establecido se determinó en términos de variabilidad intradía e interdía para un análisis de PRE (10,0 ug/ml). La repetibilidad intradía del método se determinó en base a cinco determinaciones consecutivas en el mismo día. La repetibilidad entre días se midió en base a cinco determinaciones consecutivas en tres días diferentes. Los valores de RSD para la precisión del método fueron 1,014 por ciento y 4,72 por ciento para la variabilidad intradía e interdiaria, respectivamente, lo que indica una buena precisión. Por lo tanto, el método de bioensayo establecido es satisfactorio con respecto a la linealidad, precisión y exactitud para la cuantificación de PRE en tampón de transporte.

Cultivo de células

Se cultivaron células Caco{{0}} a 37 grados y 95 por ciento de humedad relativa en una atmósfera que contenía 5 por ciento de CO2 y un medio que consistía en DMEM, 10 por ciento de FBS, 1 por ciento de NEAA, 1 por ciento de L-glutamina, penicilina ( 100 U/ml) y estreptomicina (100 ug/ml). El medio se cambió cada dos días durante el crecimiento y la diferenciación celular. Las células se cultivaron en frascos de plástico de 75- cm2 y se recolectaron cada 3 a 5 días con 0,05 por ciento de EDTA-tripsina. Para los experimentos de transporte, las células se sembraron a una densidad de 1 x 105 células/cm2 en insertos Transwell recubiertos con colágeno. Aproximadamente 21 días después de la siembra, las monocapas se usaron para los experimentos de transporte. Su integridad se determinó midiendo la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) a través de las monocapas con un EVOM equipado con ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., EE. UU.). Los valores TEER de la monocapa de células Caco-2 debían superar los 500 O∙cm2.

Experimentos de transporte

La monocapa se lavó con tampón de transporte (tampón P que contenía HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, glucosa 10 mM, CaCl2 3 mM y NaCl 145 mM, pH 7,4) y luego se preincubó durante 20 min a 37 grados. Después de retirar el tampón de transporte, se añadió tampón de transporte fresco que contenía muestras de prueba a la cámara apical (AP) (1,5 ml) en estudios direccionales de AP a basolateral (BL) o a la cámara BL (2,5 ml) en estudios direccionales de BL a AP. Para los ensayos AC, IS y EC usando HPLC, se extrajo una alícuota (300 ul) de cada cámara receptora a diferentes intervalos de tiempo (30, 60, 90 y 120 min). La cámara receptora se rellenó con el mismo volumen de tampón de transporte fresco precalentado (37 grados) después de cada muestreo. Las muestras recolectadas se almacenaron a -20 grados para su uso posterior. Para la determinación de PRE mediante bioensayo, solo se tomaron las muestras a los 120 min. Debido a la inestabilidad de PRE, AC, IS y EC, se añadió 0,4 por ciento (p/v) de vitamina C para estabilizar las muestras con el fin de determinar los contenidos de AC, IS y EC por HPLC, y las muestras para el PRE bioensayo fueron analizados inmediatamente después de ser muestreados. Se calculó el valor del coeficiente de permeabilidad aparente (Papp o 'Papp) de cada muestra.

Análisis de los datos

Los valores de Papp en las direcciones AP BL o BLAP de AC, IS y EC se calcularon con base en la siguiente ecuación: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), donde Papp es el coeficiente de permeabilidad aparente (cm/s) determinado por HPLC. (4Q/4t) es la tasa de aparición del compuesto de prueba (AC, IS o EC) en el lado del receptor (μmol/s); A es el área superficial del inserto (cm2); C0 es la concentración inicial del compuesto de prueba en el lado del donante (μmol/ml). Específicamente, se usó la unidad de masa "ug" en lugar de "μmol" cuando se calcularon los valores de 'Papp. Los datos se expresan como la media ± SD.

Resultados

Composición de Acteoside, Isoacteoside y Echinacoside en PRE de Cistanche Deserticola

Debido a que AC, IS y EC se consideran los principales PhG bioactivos de las especies Cistanche [8], analizamos su contenido en PRE mediante HPLC-UV. El cromatograma representativo se muestra en la Fig. 1. La identificación de estos componentes se basó en la comparación de los tiempos de retención y el espectro UV con los de los estándares auténticos a una longitud de onda de 334 nm. Los contenidos de AC, IS y EC en PRE fueron 26,60 por ciento, 1,84 por ciento y 32,83 por ciento, respectivamente. Así, estos tres compuestos suponen el 61,27 por ciento del PRE; además, los resultados anteriores indican que el contenido de PhG en PRE es del 78,4 por ciento. Por lo tanto, AC, IS y EC representan aproximadamente el 80 por ciento de los PhG en PRE.

Capacidades antioxidantes totales de PRE, AC, IS y EC

Se han informado estudios de la actividad antioxidante de PhG de CD [9], y AC, IS y EC representan aproximadamente el 80 por ciento de PhG en PRE. Por lo tanto, se ensayaron las capacidades antioxidantes totales de PRE, AC, IS y EC y se expresaron utilizando los valores de FRAP (× 10–6 mmol). Como se muestra en la figura 2, cuando el valor de FRAP fue de 8 × 10–6 mmol, las concentraciones finales de PRE, AC, IS y EC fueron de 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml y 4,89 ug/ml. ml, respectivamente, lo que indica que la capacidad antioxidante total de estas cuatro muestras se clasificó de la siguiente manera: AC > EC > PRE > IS. La bioactividad del PRE se atribuye a sus grupos de principios activos (AIG). Para aproximadamente el 60 por ciento de PRE, AC y EC mostraron una actividad antioxidante total más fuerte que PRE e IS. Debido a que IS (1,84 por ciento) constituye una fracción muy pequeña de PRE, otros componentes, como el IS débilmente antioxidante, también son claramente activos en PRE. Sorprendentemente, la actividad antioxidante total difería en casi 7-veces entre AC y su isómero IS, lo que indica no solo el número de grupos hidroxilo fenólicos [9], sino también la posición de los grupos hidroxilo fenólicos en la molécula afectada por el efecto anti -efecto oxidativo.

Validación de las monocapas de Caco-2

Para validar el sistema de monocapa de células Caco-2, los valores de Papp de propranolol (un marcador bien transportado) y Lucifer yellow (un marcador mal transportado) desde AP a BL a través de las monocapas de Caco-2 se determinaron como 1,51 × 10–5 cm/s y 2,8 × 10–7 cm/s, respectivamente, y estos valores coincidieron con los publicados en informes anteriores [17, 18]. El ensayo de actividad de fosfatasa alcalina también confirmó que las monocapas de células Caco-2 eran cualitativamente comparables con el epitelio del intestino delgado [19]

La permeabilidad de Acteoside, Isoacteoside y Echinacoside

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), mientras que los de los fármacos poco absorbidos fueron bajos (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

La permeabilidad del PRE

Los resultados anteriores indican que la capacidad antioxidante total de PRE se debe al menos al 61,27 por ciento de AIG de PRE. Por lo tanto, evaluamos la TR de PRE con base en su curva de concentración-efecto de capacidad antioxidante total y calculamos los valores de 'Papp para reflejar las características de transporte de PRE. Los valores de 'Papp de PRE para AP!BL y BL!AP fueron (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s y (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, respectivamente, lo que indica que este compuesto era poco permeable. Además, la salida o el transporte activo no fue evidente porque la relación de 'Papp BL a AP / 'Papp AP a BL para PRE fue 1,45 [20]. Además, la TR bidireccional de PRE aumentó linealmente entre aproximadamente 300 y 900 ug/ml (Fig. 5). La falta de preferencia direccional de los resultados sugiere que la difusión pasiva es el principal mecanismo de transporte de PRE.

Discusión

En comparación con los productos farmacéuticos altamente purificados, la PE es generalmente una mezcla que consta de cientos de constituyentes con propiedades fisicoquímicas muy diferentes. Por lo tanto, PE ejerce una acción sinérgica sistemática, multiobjetivo y multicanal debido a su complejo AIG [21], lo que dificulta el análisis de las características de transporte de PE. Para evaluar las propiedades de transporte de la PE de manera más científica, algunos investigadores han identificado múltiples componentes, en lugar de uno solo, en la PE [22–24]. Sin embargo, un número limitado de constituyentes no puede reflejar el PE en su conjunto. Sin embargo, es imposible determinar todos los componentes en PE. Además, si diversos componentes en PE muestran características de transporte completamente diferentes, las características de transporte holísticas de PE serán difíciles de identificar.

En la década de 1990, se utilizaron sistemas de bioensayo para evaluar la TR de los agentes antimicrobianos [25]. En 2005, Eguchi y sus colegas [26] evaluaron la actividad antioxidante del extracto de zanahoria mediante el uso de medios BL de células Caco-2 diferenciadas; este enfoque es más apropiado para reflejar situaciones in vivo.

Basado en un informe previo de la actividad de PhGs [9] y nuestros resultados (Fig. 2), la TR de AIG en PRE puede evaluarse determinando la capacidad antioxidante total del medio en la cámara receptora. Después de los experimentos de transporte, encontramos que el TR de PRE era similar en ambas direcciones, y este transporte estaba insaturado y mal absorbido ('Papp < ​​1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3],="" y="" no="" indicó="" eflujo,="" lo="" que="" sugiere="" que="" la="" difusión="" pasiva="" a="" favor="" de="" un="" gradiente="" de="" concentración="" es="" el="" principal="" mecanismo="" de="" transporte="" de="" pre="" (fig.="" 5).="" además,="" las="" características="" de="" transporte="" de="" pre="" son="" consistentes="" con="" las="" de="" ac,="" is="" y="" ec,="" los="" componentes="" efectivos="" que="" muestran="" actividad="" antioxidante="" en="" pre="" (fig.="" 4="" y="" tabla="" 4).="" este="" resultado="" era="" esperado="" e="" indicó="" que="" el="" presente="" sistema="" de="" bioensayo="" es="" apropiado="" y="" confiable="" para="" la="" evaluación="" de="" las="" características="" de="" transporte="" de="" aig="" en="" pre="" en="" células="" caco-2="">

En contraste con el valor de Papp canónico, que se usa comúnmente para reflejar el transporte de un solo compuesto, el valor de 'Papp obtenido del TR basado en la curva de efecto de concentración puede no solo reflejar los componentes que penetran las monocapas con una estructura intacta sino también también involucran otros factores relacionados con la actividad objetivo, como los metabolitos de los componentes, los productos degradados químicamente e incluso algunas citoquinas secretadas por las células Caco-2 en respuesta a la estimulación que puede afectar la bioactividad objetivo. Por lo tanto, el multifactor mencionado anteriormente, en lugar de solo los componentes intactos transportados, determina el valor de 'Papp. Por lo tanto, 'Papp puede correlacionarse más fuertemente dentro de las situaciones Vivo que el valor canónico de Papp [26]. En este estudio, aclaramos la naturaleza de difusión pasiva y absorción deficiente de PRE en función de su valor de 'Papp, y esta naturaleza puede estar relacionada con la alta dosis y el largo período de tratamiento clínico de CD [27]. Sin embargo, estos hallazgos proporcionarán una guía más sistemática para los médicos en la aplicación de CD cuando solo se hayan identificado las características de transporte de la mayoría de AIG en CD, no solo de PhG.

Sin embargo, el elemento de bioactividad seleccionado debe ser lo suficientemente sensible para ser detectado en el medio de la cámara receptora, lo que presenta un desafío para el establecimiento de un sistema de bioensayo para evaluar las características de transporte de PE. Además, la bioactividad también debería depender de tantos componentes como sea posible. En nuestro estudio, el ensayo de capacidad antioxidante total fue más apropiado que varios otros métodos (Fig. S1). Pero aun así, nuestro ensayo solo puede detectar el TR de PRE a los 120 min.

En conjunto, el presente estudio estableció un nuevo sistema de bioensayo para evaluar la permeabilidad intestinal de PRE en células Caco-2 diferenciadas. Los resultados obtenidos mostraron que una difusión pasiva pobremente absorbida por un gradiente de concentración sin eflujo es el principal mecanismo de transporte de PRE (Fig. 5), lo que proporciona la base farmacocinética para la aplicación clínica de PhG en EC. El uso de un nuevo sistema de bioensayo para evaluar la TR y, por lo tanto, calcular los valores de 'Papp para evaluar la propiedad de transporte intestinal de AIG en PE es claramente factible. Este enfoque también puede ser adecuado para otros PE dada la bioactividad adecuada

información de soporte

S1 Fig. Efectos de PRE sobre (A) anión superóxido, (B) radical hidroxilo, (C) producto de peroxidación lipídica y (D) radical DPPH. Los procedimientos de ensayo se realizaron de acuerdo con informes anteriores [1, 2] sin usar tampón de transporte. Los valores IC50 (50 por ciento de concentración de inhibición) y SC50 (50 por ciento de concentración de barrido) se calcularon en base a las curvas estándar de concentración-respuesta. (DOCX)

Contribuciones de autor

Concibió y diseñó los experimentos: YG XC YQ. Realizó los experimentos: YG CZ FL LF RC YS. Analizó los datos: CZ YG YQ. Reactivos/materiales/herramientas de análisis aportados: RC. Escribió el papel: YG YQ

Departamento de Centro de Investigación de Farmacología y Toxicología, Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales, Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Beijing, República Popular China,

Universidad de Medicina China de Heilongjiang, Harbin, Heilongjiang, República Popular China