El camino hacia el progreso de los estudios preclínicos de las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad: una perspectiva sobre los modelos derivados de roedores y HiPSC, parte 2

Además de los modelos transgénicos desarrollados por laboratorios académicos individuales, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) lideran actualmente el Proyecto de validación preclínica y descubrimiento de objetivos de Accelerating Medicines Partnership-AD (AMP-AD), que es un consorcio de subvenciones multiinstitucionales y multidisciplinarias. que colectivamente pretenden acelerar los procesos de descubrimiento de fármacos para la EA (https://www.nia.nih.gov/research/dn/amp-ad-target-discovery-and-preclinicalvalidation-project).

Con el rápido desarrollo de la biotecnología, la tecnología transgénica se ha ido aplicando gradualmente al campo biológico. La tecnología transgénica es una tecnología de ingeniería genética que introduce genes extraños en organismos para que muestren características específicas. Sin embargo, ha habido controversia sobre la relación entre los modelos transgénicos y la memoria.

Algunos investigadores creen que los modelos transgénicos pueden tener un efecto positivo sobre la memoria. Por ejemplo, algunos experimentos con animales transgénicos han demostrado que al cambiar ciertos genes, se puede mejorar la capacidad de aprendizaje y la memoria de los animales. Estos resultados experimentales muestran que la tecnología transgénica puede potencialmente mejorar la capacidad cognitiva humana.

Aunque los resultados de estas investigaciones son muy interesantes, también debemos ser cautelosos porque los resultados obtenidos después de estos procesos experimentales no son el resultado de una promoción humana o una aplicación apresurada. Necesitamos realizar más investigaciones sobre esta tecnología para comprender sus riesgos potenciales para el medio ambiente y los seres humanos, y medir su posible impacto social. Al mismo tiempo, también debemos admitir que la mejora de la memoria no depende sólo de los genes sino también de la salud física y unos hábitos de vida saludables para conseguir un buen estado de memoria a través de canales normales.

En resumen, debemos esperar los aspectos positivos de la tecnología transgénica y regularla y evaluarla adecuadamente. Mediante el uso racional de la tecnología transgénica, podemos cambiar nuestro genoma, lo que nos ayudará a resolver algunos problemas médicos y ambientales y al mismo tiempo promoverá el progreso humano en muchos campos, incluida la mejora de la memoria. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche puede mejorar significativamente la memoria porque tiene efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antienvejecimiento, que pueden ayudar a reducir la oxidación y las reacciones inflamatorias en el cerebro, protegiendo así la salud del sistema nervioso. Además, Cistanche también puede promover el crecimiento y la reparación de las células nerviosas, mejorando así la conectividad y la función de las redes neuronales. Estos efectos pueden ayudar a mejorar la memoria, la capacidad de aprendizaje y la velocidad del pensamiento, y también pueden prevenir la aparición de disfunciones cognitivas y enfermedades neurodegenerativas.

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Particularmente relevante para esta revisión es el brazo de AMP-AD, denominado iniciativa Modelo de Desarrollo y Evaluación de Organismos para LOAD (MODEL-AD). MODEL-AD tiene como objetivo generar nuevas líneas de ratones transgénicos que modelen con precisión los fenotipos de la EA y sirvan como una plataforma mejorada para el desarrollo de fármacos y modelos más traducibles y biológicamente relevantes para la validación preclínica de DMT.

La iniciativa MODEL-AD está compuesta por el Centro de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana, el Laboratorio Jackson, Sage Bionetworks, la Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh y un centro en la Universidad de California Irvine.

Juntos, este consorcio pretende establecer la próxima generación de modelos de EA in vivo basados ​​en datos humanos de forma rigurosa y altamente controlada. Al hacerlo, su objetivo es alinear las características fisiopatológicas de los modelos de EA con las etapas correspondientes de la enfermedad clínica utilizando biomarcadores traducibles como medio para aumentar la traducibilidad de los hallazgos preclínicos.57

Hasta la fecha, se han generado 54 modelos de ratón AD, incluidos ratones fAD, APOE, APP, MAPT/tau, así como modelos LOAD basados ​​en la acumulación de Ab y otras variantes previamente identificadas relacionadas con LOAD (https://www.model-ad.org). /strain-table/), que están disponibles a través de JAX/IU/Pitt AD Precision ModelsCenter.

Modelos de toxinas químicas de la EA

Además de los modelos transgénicos más recientes, los modelos de roedores con EA se basaron históricamente en la exposición a compuestos tóxicos que causan neurodegeneración selectiva y provocan deterioros cognitivos y conductuales similares a los observados en pacientes con EA.

Mientras que en el estudio de la EA y la EP se ha empleado una variedad de modelos de exposición a toxinas, los modelos de EA han sido reemplazados en gran medida por los modelos transgénicos más recientes discutidos anteriormente.

Los modelos químicos de EA inducen una patología similar a la EA mediante el uso de compuestos que interrumpen selectiva y reversiblemente la actividad de las neuronas colinérgicas o toxinas que alteran permanentemente los procesos de homeostasis celular que conducen a la muerte celular, como el ácido okadaico y varias clases de metales pesados ​​58 (Tabla 2). Aunque estos modelos producen algunos déficits neurológicos y conductuales que se asemejan a los síntomas de la EA, incluidos problemas de aprendizaje y memoria, en gran medida carecen de lesiones patológicas de la EA (es decir, las placas Ab y las NFT).

Los modelos animales que se centran explícitamente en la alteración de las neuronas colinérgicas se basan en la ahora algo anticuada hipótesis colinérgica de la EA.59 En tales modelos, los antagonistas de los receptores muscarínicos, por ejemplo, el compuesto escopolamina, se administran a regiones específicas del cerebro, como el HP, para bloquear actividad endógena de acetilcolina e inducen deterioros cognitivos en el aprendizaje y la memoria.60

Otros modelos de intervención química de la EA implican la administración local o periférica de neurotoxinas que conducen a la muerte celular neuronal inespecífica61-64 (Tabla 2).

Modelos transgénicos de EP

Como es el caso de la EA, los modelos de ratón transgénicos de la EP permiten el estudio de las características clínicas de la enfermedad inducidas mediante la manipulación de loci genéticos asociados con las formas mendelianas de la enfermedad, y ahora se pueden comprar cientos de líneas únicas comercialmente.

Al igual que la EA, la mayoría de los casos clínicos de EP se clasifican como esporádicos, y las formas hereditarias de la enfermedad representan menos del 1% de todos los casos.89 Las alteraciones genéticas en los genes SNCA, LRRK2 y UCH-L1 están relacionadas con formas autosómicas dominantes de PD, mientras que las alternancias en los genes PRKN, PINK1 y DJ-1 están asociadas con las formas autosómicas recesivas90 (Tabla 1).

Los dos genes más comúnmente atacados en los modelos transgénicos de EP son SNCA y LRRK2.91,92 Las mutaciones en estos genes causan EP familiar y también se asociaron con la forma esporádica de EP a través de GWAS.93

Además, se ha establecido bien el papel de la sobreexpresión de SNCA en la EP familiar (casos de triple/duplicación) y esporádica.94

Hasta la fecha, la mayoría de los modelos transgénicos que manipulan SNCA no sólo introducen mutaciones familiares sin sentido sino que también emplean una estrategia de sobreexpresión mediante la inserción de múltiples copias del gen SNCA humano o de ratón para imitar el aumento de la producción de a-sinucleína (a-syn), ya sea sola o en combinación, con una mutación familiar sin sentido.95–97

Una mutación sin sentido en LRRK2 es la mutación más comúnmente reportada asociada con la EP familiar,98 y se han generado varias líneas de ratones transgénicos basadas en una variedad de mutaciones conocidas en LRRK2.

La mutación GS2019S, por ejemplo, da como resultado una mutación de ganancia de función con actividad quinasa mejorada.99 Otros modelos, como las mutaciones R1441C/G, T1348N y A2016T, informan cambios en la expresión o agregación de a-syn y, en algunos casos, déficits motores nominales; sin embargo, los déficits precisos y las características clínicas varían sustancialmente entre los modelos.89,92,100

Además de los genes SNCA y LRRK2, se han generado muchas otras líneas transgénicas a las que se dirigen otros genes asociados a la EP (Tabla 1). Mientras que muchos de estos modelos alteran con éxito la expresión y agregación de a-syn, la mayoría exhibe poca o ninguna neurodegeneración y, en consecuencia, las funciones motoras permanecen relativamente intactas92 (Tabla 1).

Un análisis cuidadoso de los agregados a-syn producidos en muchas de estas líneas transgénicas ha revelado además que las inclusiones formadas no se parecen a los cuerpos de Lewy (LB) naturales observados en cerebros postmortem con EP, sino que muestran una composición estructural única.101

El fracaso de los modelos transgénicos para reproducir los aspectos moleculares y neurodegenerativos de la EP probablemente se deba a una combinación de varios factores. La principal de estas preocupaciones es que la naturaleza y el alcance de la participación de genes relacionados con familias y la forma esporádica más común de la enfermedad aún no están claras, lo que pone en duda la relevancia de los modelos basados ​​en la manipulación de estos genes para la gran mayoría de los casos de EP.

Otra limitación es que los modelos transgénicos dan como resultado una sobreexpresión del transgén que no imita los niveles fisiológicos y, por tanto, puede introducir artefactos. Además, la forma esporádica de la enfermedad probablemente implica alteraciones en múltiples genes, y la susceptibilidad se ve aún más afectada por componentes ambientales, lo que sugiere que los modelos transgénicos monogénicos pueden tener una utilidad limitada.

En general, muchos de los mismos problemas que afectan a los modelos transgénicos de la EA se aplican a los modelos de la EP: actualmente existe una falta de comprensión del papel preciso de los genes relacionados con la familia en la etiología de la EP y en qué medida contribuyen a las formas esporádicas de la enfermedad.

Estos problemas han hecho que sea extremadamente difícil producir un modelo de EP transgénico, que reproduzca fielmente la acumulación de a-syn y la formación de LB, lo que a su vez conduce a un patrón de neurodegeneración y alteraciones del comportamiento que coinciden con los observados en poblaciones clínicas.

Los modelos transgénicos actuales recapitulan sólo algunas de estas características y, como resultado, han demostrado tener poca validez predictiva para evaluar la eficacia de posibles DMT. Por el contrario, los modelos de toxinas químicas de la EP todavía se utilizan ampliamente debido a su capacidad para reproducir fielmente la neurodegeneración selectiva por DA característica de la EP.

Modelos de toxinas químicas de la EP

Durante el último medio siglo, se ha empleado una amplia variedad de compuestos tóxicos para modelar el patrón de neurodegeneración observado en la EP. De estos, cuatro modelos de lesiones químicas han surgido como los más utilizados para la investigación preclínica y sus efectos se han caracterizado ampliamente.

Estos incluyen 6-hidroxidopamina (6-OHDA), un análogo de catecolamina; 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), un análogo opioide sintético; rotenona, un pesticida; y paraquat, un herbicida102 (Tabla 2). Otro modelo de EP no transgénico se basa en la inyección de fibrillas preformadas (PFF; proteínas a-syn monoméricas recombinantes convertidas en forma agregada fibrilar) en el cerebro de animales, lo que desencadena la hiperfosforilación de proteínas a-syn endógenas y provoca una patología similar a LB en el SN. pars compacta (SNpc)87,88 (Tabla 2).

Estos modelos basados ​​en toxinas pueden inducir, con diversos grados, agregación a-syn y neurodegeneración selectiva de neuronas DA en la vía nigroestriatal, una deficiencia notable de sus contrapartes de modelos transgénicos.

Sin embargo, las vías implicadas en el desencadenamiento de la muerte celular y el grado de pérdida de neuronas DA varían sustancialmente entre los modelos, que se han revisado en detalle en otro lugar.103 En última instancia, el resultado de la pérdida de células DA en la EP es que los núcleos motores del cuerpo estriado ya no pueden mantener función fisiológica normal, causando una amplia gama de capacidades motoras deterioradas.

Sin embargo, la pérdida de neuronas DA nigroestriatales no es, en sí misma, un modelo de EP per se, sino que imita un parkinsonismo más general caracterizado por un espectro más amplio de síntomas motores.104

Hasta este punto, aunque algunos modelos basados ​​en toxinas, incluidos PFF, MPTP crónico y administración de rotenona, pueden inducir agregados a-syn y formación similar a LB, son distintos de las inclusiones de LB características en la EP y de la distribución general de estos agregados. no refleja el patrón observado en PDbrains.102

Estos modelos también tienen una capacidad limitada para modelar la naturaleza progresiva de la EP y la propagación de la patología a otras regiones del cerebro, ya que los pacientes con EP también sufren neurodegeneración en regiones subcorticales y, eventualmente, corticales en las últimas etapas de la enfermedad.105

En resumen, los modelos basados ​​en la exposición a toxinas demuestran algunas similitudes con las patologías observadas en la EP; sin embargo, el mecanismo de muerte celular inducido por las toxinas probablemente sea distinto de aquellos que subyacen a la pérdida neuronal en la EP.106,107 Es de destacar que los esquemas de dosificación típicos para los modelos de EP con toxinas químicas ocurren durante días o semanas, mientras que el curso de la EP se desarrolla durante décadas y progresa a lo largo de décadas. años.

Estas limitaciones sugieren que los modelos basados ​​en la exposición a toxinas destinados a inducir la muerte selectiva de las neuronas DA en la vía nigroestriatal presentan una imagen incompleta de la EP y proporcionan una explicación de por qué los esfuerzos para identificar DMT en dichos modelos no han logrado ser efectivos en los ensayos clínicos.

Modelos de vectores virales para EP y ADVentajas de los sistemas de vectores virales

Los sistemas de administración de vectores virales ofrecen varias ventajas que son difíciles de lograr con otros enfoques.108 En primer lugar, los sistemas de vectores virales proporcionan un control sólido sobre la expresión temporal del gen de interés.

En segundo lugar, el envejecimiento es el principal factor de riesgo de los trastornos del espectro AD-PD, y la posibilidad de administrar el vector en cualquier momento de la vida del animal representa una gran ventaja para el diseño del estudio. En tercer lugar, los vectores virales apoyan la administración y expresión local de transgenes, lo que permite orientación precisa y específica de las regiones de interés del cerebro.

En cuarto lugar, se pueden lograr fácilmente manipulaciones de dosis precisas con el uso de vectores virales. En quinto lugar, el modelo de interés se puede crear en múltiples especies animales, desde pequeños roedores hasta grandes primates no humanos.

En sexto lugar, es fácil realizar diferentes variaciones de genes para obtener un fenotipo de interés. En séptimo lugar, la versatilidad y flexibilidad de las diferentes plataformas de vectores utilizadas para la transferencia de genes mediada por virus al sistema nervioso central son enormes.

Los sistemas virales, incluidos los vectores adenoasociados (UAV) recombinantes y los vectores lentivirales (LV), apoyan de manera eficiente y sólida la expresión genética a corto o largo plazo, respectivamente, tanto a nivel local como global. Por último, los sistemas basados ​​en vectores virales son significativamente más económicos. , tanto en términos de esfuerzo como de costos, en relación con otros modelos de enfermedades.

Modelos de vectores virales de AD y PD: AAV y LV

El enfoque del vector viral para modelar los fenotipos de AD y PD in vivo ha sido utilizado por varios grupos diferentes utilizando rAAV o LV. Desde su primer uso a principios del milenio, se han desarrollado y utilizado una variedad de modelos basados ​​en virus para la EA.

Los modelos iniciales de tauopatía AAV explotaron AAV2/2 para expresar la proteína P301L humanatau en el cerebro de ratones y ratas.109,110 En estos estudios, se inyectó el vector AAV-tau-P301L en el prosencéfalo basal de ratas adultas, lo que condujo a niveles aumentados de taupatía. durante al menos 8 meses después de la transducción. Significativamente, se encontraron tau hiperfosforilada y agregados que se asemejan a NFT entre 3 y 4 semanas después de la transducción.110,111

Estos estudios proporcionaron la primera prueba del concepto de que la inyección de AAV-P301L tau podría dar como resultado una expresión persistente de la proteína y su agregación en ratones y ratas.

Consistentemente, la inyección de AAV de tipo salvaje (WT) o APP de triple mutante dio como resultado la formación de placas de Ab, pero no una neurodegeneración manifiesta. Estos hallazgos contrastan con las observaciones anteriores de que AAV-WTtau o AAV-P301L tau eran capaces de causar una neurodegeneración significativa de las neuronas piramidales HP.112

En experimentos más recientes, se utilizó AAV2/5 para administrar WT tau y el vector de control GFP en el HP dorsal de ratas Fischer 344 envejecidas.113 Ambos virus se expresaron de manera robusta en neuronas HP y condujeron a una estructura axonal aberrante, degeneración axonal y fragmentación de tau en Los axones HP comparados con los axones de control que expresan GFP parecían normales.

En otro modelo, la tau P301L expresada a partir del promotor de la sinapsina I humana fue administrada por el vector AAV2/9 en la corteza entorrinal lateral, lo que permitió a los autores detectar múltiples formas de variantes de tau fosforiladas y agregadas antes de la pérdida de sinapsis de la vía perforante y la neurodegeneración.114

Estos datos respaldan la utilidad de los enfoques basados ​​en AAV en la EA, particularmente en el modelado de cambios patológicos tempranos, como la degeneración y degradación axonal. Varios estudios utilizaron modelos basados ​​en virus destinados a inducir otros aspectos patológicos de LOAD.115,116 Por ejemplo, AAV-BRI-Ab42 y Se utilizaron vectores AAV-BRI-Ab40 para la expresión y secreción controlada de péptidos Ab en HP de roedores.116

En particular, los animales inyectados con AAV-BRIAb42- demostraron que estos vectores eran capaces de inducir la formación de placas, pero esto no se observó con la expresión de rAAV2/1-BRIAb40.

En otro estudio, se utilizó AAV2/2 para administrar Ab40 y Ab42, un fragmento C-terminal de APP que contiene los péptidos Ab (C100) y un mutante V717F de C100 al HP y al cerebelo de ratones.

Curiosamente, los mutantes Ab42 y V717F demostraron una mayor inducción de microgliosis y alteración de la barrera hematoencefálica (BHE) en comparación con las formas Ab40, pero no activaron la formación de placas, la inducción de astrocitos ni la neurodegeneración. El uso de la tecnología AAV y LV para expresar diversas formas de Ab y sus precursores seguirá siendo un método esencial para estudiar su papel en LOAD.117

Más recientemente, LV se ha utilizado para expresar TDP-43, Ab42 o ambos en la corteza motora de ratas, lo que descubrió que la pérdida de TDP-43 implica a la microglía como causa de la degeneración sináptica observada en LOAD. 118

Además, lenti-TDP-43 desencadenó alteraciones en el procesamiento de APP asociadas con la producción de Ab42 e indujo actividad de caspasa y neuroinflamación, que se observó de manera similar con lenti-Ab42.

La expresión combinada de la proteína TDP-43 y Ab42 produjo un resultado similar al de TDP-43 solo, pero con la característica adicional de pérdida neuronal, lo que sugiere un posible efecto sinérgico entre los dos factores. Otro estudio que utilizó LV para expresar TDP-43 en la corteza motora encontró alteración del metabolismo de los aminoácidos, estrés oxidativo y muerte neuronal.119

Estos resultados en conjunto demuestran la utilidad de los sistemas modelo de EA basados ​​en el VI para dilucidar factores patogénicos clave relacionados con la disfunción proteica implicada en la EA, mientras que Ab y tau se han probado ampliamente en LOAD, lo que coincide con la noción arraigada desde hace mucho tiempo de que Ab es un sospechoso clave en la patogénesis de la EA. . Sin embargo, los continuos fracasos en los ensayos de medicamentos destinados a reducir los niveles de amiloide exigen reorientar el esfuerzo hacia otros posibles culpables.

Múltiples estudios recientes demostraron que APOEε4 puede contribuir a la toxicidad asociada con el fenotipo de la EA y, hasta la fecha, APOE sigue siendo el factor de riesgo genético más importante y replicable para la EA.120

Dado el papel de APOEε4 en la patogénesis de la EA y el posible efecto protector de la isoforma ε2, Hu y sus colegas121 generaron modelos de ratón utilizando isoformas APOE AAV8-impulsadas por el promotor GFAP expresado específicamente en astrocitos en todas las regiones del cerebro, lo que resultó en un aumento general. en los niveles de APOE en todo el cerebro del ratón.

La sobreexpresión de APOEε4 mediada por virus en los ratones APOEε4-TR aumentó las partículas de lipoproteína APOE poco lipidadas y disminuyó el colesterol asociado a APOE en los ratones APOEε4-TR. Por el contrario, la sobreexpresión de APOEε2 en APOEε4-TR los ratones mejoraron la lipidación de APOE y el colesterol asociado.

Además, la sobreexpresión de APOEε4 elevó los niveles de Ab endógeno, mientras que la sobreexpresión de APOEε2 tendió a reducir el Ab endógeno. Con base en estos datos, los autores sugieren que aumentar APOEε2 en portadores de APOEε4 es una estrategia beneficiosa para tratar la EA, mientras que aumentar APOEε4 en portadores de APOEε4 es perjudicial. En otro estudio, se realizó una inyección intracerebral directa utilizando AAV para expresar APOEε2.

El estudio informó que la sobreexpresión de APOEε2 redujo notablemente los niveles de Ac solubles (incluidos los oligoméricos) e insolubles en el cerebro, así como la carga de amiloide, en dos modelos de amiloidosis cerebral en ratones en los que la patología depende de la expresión de las isoformas de APOEε4 de ratón o humana.122

Zhao et al.122 demostraron además que se puede lograr una reducción generalizada de Ab cerebrales mediante una única inyección del virus mediante administración intratalámica de AAV que expresa APOEε2.

En conjunto, estos datos sugieren que la administración del gen AAV de APOEε2, utilizando un AAV, puede rescatar los efectos perjudiciales de APOEε4 sobre la patología amiloide cerebral; por lo tanto, este enfoque puede representar una vía terapéutica viable para tratar o prevenir LOAD.

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