Discusión

El envejecimiento de la población sigue creciendo a un ritmo sin precedentes en todo el mundo. El envejecimiento se asocia con una disminución de las funciones celulares, la acumulación de daños y una mayor probabilidad de enfermedades crónicas que conducen al colapso de los sistemas y, finalmente, a la muerte [3–7]. La prevalencia de patologías relacionadas con la edad en etapas avanzadas de la vida tiene un impacto significativo en la calidad de vida y los costes sanitarios. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de intervenciones con una actividad antienvejecimiento efectiva que pueda explotarse como un geroprotector para retrasar el envejecimiento y prolongar la vida útil.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y tiene la capacidad de eliminar las especies reactivas de oxígeno y prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres, y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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El envejecimiento celular está controlado por una red de procesos biológicos complejos interconectados [8, 9]. Estudios recientes han demostrado que intervenir en los procesos biológicos de envejecimiento puede aumentar sustancialmente la vida útil saludable de los organismos modelo, incluidos los mamíferos [10, 14]. El envejecimiento cronológico en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae es el sistema modelo bien establecido para determinar las intervenciones del envejecimiento celular posmitótico humano [16-19].

Desarrollamos un método cuantitativo nuevo, rápido y económico llamado PICLS para medir CLS utilizando (1) células de levadura incubadas con medios y compuestos de prueba en placas transparentes de 96-pocillos; (2) el colorante fluorescente yoduro de propidio (PI), un impermeabilizante celular que solo ingresa a las células muertas [23–25]; y (3) un lector de microplacas para la lectura de supervivencia celular cuantitativa. Para tener en cuenta, la medición de la densidad celular (y el crecimiento celular) a OD600nm se puede realizar desde la misma placa. Para las células de levadura muertas en 96-placas de pocillos, encontramos una alta correlación lineal entre la fluorescencia de PI y la absorbancia de OD600nm dentro de un rango de densidad celular óptimo correspondiente a 0,05–12 OD. Este enfoque metódico se puede utilizar para cuantificar la viabilidad celular en ensayos de alto rendimiento.

Hay varias innovaciones importantes asociadas con PICLS: (i) PICLS es actualmente el único método libre de crecimiento para la cuantificación de CLS. Se recorta del protocolo un paso crítico que demanda tiempo y recursos y, por lo tanto, PICLS es el primer verdadero cribado de alto rendimiento (HTS) para agentes químicos y condiciones de cultivo para la medición de CLS. (ii) La idea metódica detrás de PICLS se puede formular generalmente como un método basado en placa donde (a) la fracción de células muertas/supervivientes y (b) la cantidad total de células se determina directamente simultáneamente desde la misma placa con una intensidad óptica dispositivo de medición (el lector de placas comúnmente disponible). En este trabajo, usamos 96-placas de pocillos, pero 384-las placas de pocillos parecen también aplicables (posiblemente con cierta sensibilidad reducida debido a la menor cantidad de cultivo). Se puede utilizar cualquier agente colorante que distinga las células muertas de las supervivientes y que tenga fluorescencia o absorción en un canal que no interfiera con la medición general de la densidad celular (p. ej., a través de la absorción a OD600nm). Aplicamos yoduro de propidio que marca selectivamente las células muertas, pero esto no es crítico para PICLS.

Fig. 7 Prueba del efecto de los análogos de 2,5-anhidro-D-manitol en la vida útil cronológica de la levadura. La cepa de levadura prototrófica (CEN.PK113-7D) se cultivó en el medio sintético definido con diferentes concentraciones de 2,5-anhidro-Dmanitol (2,5-AM), D-fructosa , D-manitol, D-maltosa y D-sorbitol en 96-placas de pocillos a 30 grados. Se midió una DO600nm de crecimiento celular en diferentes puntos de tiempo de 24 h, 48 h y 72 h utilizando un lector de microplacas y un gráfico trazado frente a diferentes concentraciones de 2,5-AM, fructosa, manitol, maltosa y sorbitol. B La vida útil cronológica (CLS) de diferentes concentraciones de células incubadas con 2,5-AM, fructosa, manitol, maltosa y sorbitol se determinó mediante el método basado en fluorescencia con yoduro de propidio. Se cuantificó la supervivencia celular en diferentes puntos de edad cronológica y se consideró el punto de tiempo de crecimiento de 72 h como el día 1. C El CLS de las células envejecidas se determinó mediante el método de crecimiento en medio líquido YPD. El punto de tiempo de crecimiento de 72 h se consideró como el día 1. En varios puntos de edad cronológica, se transfirió un cultivo de 3- μl a una segunda placa de 96-pocillos que contenía 200 μl de medio YPD. Se midió la DO600nm de crecimiento en medio líquido YPD después de la incubación durante 24 horas a 30 grados utilizando un lector de microplacas. El gráfico se representa en relación con el día 1. D El crecimiento en medio líquido YPD de una placa de pocillos 96- se fotografió después de la incubación durante 24 ha 30 grados. E En varios puntos de edad cronológica, se observaron cultivos de 3-μL en la placa de agar YPD. Se fotografió el crecimiento después de la incubación durante 48 horas a 30 grados. Todos los datos se representan como medias ± SD.; *PAG<0.05, **P<0.01, and  ****P<0.0001 based on two-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons tests (B and C). n.s, non-significant 

Observamos que las microplacas negras generalmente se recomiendan para los ensayos de fluorescencia porque este material apaga parcialmente la autofluorescencia. Sin embargo, evaluamos el método en microplacas transparentes y encontramos una efectividad similar a la de las microplacas negras. Dado que las microplacas negras se asocian con altos costos, esta es una ventaja significativa para los proyectos de detección de alto rendimiento a gran escala.

Validamos nuestro método desarrollado con intervenciones antienvejecimiento conocidas, como la administración de rapamicina y la restricción calórica [10–16] al reproducir su efecto en el CLS de la levadura. Estos resultados sugieren que nuestro método es eficaz para identificar nuevas intervenciones antienvejecimiento. Hemos aprovechado nuestro protocolo recientemente desarrollado para la detección de agentes químicos para identificar nuevos compuestos antienvejecimiento (Fig. 8). Identificamos 2,5-anhidro-D-manitol (2,5-AM) extendiendo el CLS de la levadura. Según nuestros resultados, sugerimos el uso de 2,5-AM de forma individual o en combinación con otras intervenciones antienvejecimiento.

2,5-AM es un análogo de la fructosa, y ambos azúcares pueden entrar en la vía glucolítica. La glucólisis es un proceso metabólico en el que la glucosa es fosforilada primero por la hexocinasa para formar glucosa-6-fosfato (G6P). La fosfoglucoisomerasa interconvierte G6P en fructosa-6-fosfato (F6P) que luego se metaboliza en diferentes intermediarios glucolíticos aguas abajo, incluido el piruvato que ingresa al ciclo mitocondrial del TCA. Al igual que la glucosa, la fructosa también es fosforilada por la hexocinasa para formar F6P. La fosfofructocinasa convierte la F6P en fructosa-1,6-bisfosfato (FBP), que se metaboliza aún más en diferentes intermediarios glucolíticos aguas abajo. 2,5-AM también puede ser fosforilado por la hexocinasa para formar 2,5-AM- 6-fosfato (2,5-AM6P) [39–41]. Además, la fosfofructocinasa convierte 2,5-AM6P en 2,5-AM- 1,6-bisfosfato (2,5-AMBP). Sin embargo, la 2,5-AMBP no se puede metabolizar más en intermediarios glucolíticos aguas abajo [39–41].

Dado que 2,5-AM es un análogo de la fructosa, investigamos si la fructosa también puede prolongar la vida útil de la levadura. Sin embargo, no observamos la actividad antienvejecimiento de la fructosa al extender el CLS de la levadura. El manitol y la maltosa también pueden entrar en la glucólisis y metabolizarse en intermediarios glucolíticos aguas abajo. También examinamos el efecto del manitol y la maltosa en la vida útil de la levadura. La fructosa, el manitol y la maltosa tampoco pueden extender el CLS de la levadura.

Como el sorbitol, otro azúcar aún no metabolizado, se informó anteriormente que afecta el CLS en concentraciones muy altas (18 por ciento equivalente a 1 M) [20, 45], deseábamos aclarar si la actividad antienvejecimiento de 2,{{7 }}AM podría deberse al aumento de la osmolaridad del medio de cultivo. Nuestros experimentos demostraron que el sorbitol no logra aumentar el CLS de la levadura en las concentraciones más bajas que son efectivas en el caso de 2,5- AM. Dado que el sorbitol requiere concentraciones más altas para aumentar el CLS de la levadura, el mecanismo antienvejecimiento de 2,5-AM es independiente de los efectos de la osmolaridad. Estos hallazgos revelaron que la actividad antienvejecimiento de 2,5-AM es específica y no tiene paralelo con varios otros análogos con estructuras químicas similares.

Sin embargo, queda por investigar cómo 2,5-AM extiende la vida útil. Será interesante examinar si 2,5-AM modula directamente las características del envejecimiento [8]. TORC1 y AMPK son los complejos sensores de glucosa involucrados en el proceso de envejecimiento [32, 43]. Sin embargo, la vida útil cronológica extendida por la inhibición de TORC1 se reduce cuando se inhibe AMPK. La glucosa y los intermediarios glucolíticos regulan la actividad de TORC1 y AMPK [34, 46, 47]. Se ha demostrado que la 2,5-AMBP inhibe la actividad de la aldolasa que cataliza la conversión de FBP en gliceraldehído-3-fosfato (G3P) y dihidroxiacetona fosfato (DHAP) [39, 40]. DHAP se interconvierte en G3P por la triosafosfato isomerasa. La evidencia reciente sugiere que DHAP es la molécula de señal de glucosa importante que activa TORC1 [48].

El flujo glucolítico se ve comprometido cuando la síntesis de G3P y DHAP se ve afectada, lo que lleva a una menor producción de ATP. Curiosamente, la AMPK se activa cuando el estado energético de las células se ve comprometido e inhibe el crecimiento celular al inhibir el TORC1 [46, 47]. Por lo tanto, la relación antagónica de AMPK y TORC1 es una adaptación metabólica eficiente para garantizar el equilibrio de la homeostasis celular para las células sanas. Aunque no observamos un efecto de 2,5-AM en el crecimiento celular (Figs. 6 y 7). Estos hallazgos descartaron cualquier efecto de restricción de glucosa que comprometiera el crecimiento celular (Fig. 5), sin embargo, extendieron la vida útil con un fenotipo de crecimiento lento [49]. Sin embargo, la prolongación de la vida útil de la rapamicina no requiere una dosis más alta que comprometa el crecimiento celular (Fig. 4). Por lo tanto, no podemos excluir la posibilidad de actividad antienvejecimiento de 2,5-AM a través de TORC1/AMPK o independientemente de TORC1/AMPK.

A diferencia del efecto inhibidor de 2,5-AMBP sobre la aldolasa, se informa que activa la piruvato quinasa, la última enzima de la glucólisis [39–41]. La piruvato quinasa cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato en piruvato, una de las fuentes para generar NAD plus (nicotinamida adenina dinucleótido). NAD plus es un metabolito importante que regula varios procesos y funciones celulares fundamentales para mantener las células sanas y prolongar la vida útil [50, 51]. El piruvato también es el sustrato principal de las reacciones mitocondriales para generar varios metabolitos básicos para sintetizar elementos vitales, incluidos aminoácidos, ácidos nucleicos y ATP, esencialmente para la supervivencia celular y el envejecimiento saludable [52–55]. De hecho, la disminución de la actividad mitocondrial está asociada con el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad [53–56]. Recientemente, la 2,5-AM se ha propuesto como un posible agente terapéutico para tratar el cáncer de leucemia mieloide aguda (LMA) [57].

Como nota al margen, llamamos a nuestro nuevo método PICLS (método CLS basado en PI) con el juego de palabras "pepinillos" en mente. Mientras que todos los elementos de nuestro nuevo protocolo ya se han descrito de forma independiente en otro lugar, su combinación "fermentada" hace que la medición sea simple y económica, y finalmente lista para un alto rendimiento.

En conclusión, hemos desarrollado un método cuantitativo para medir la vida útil cronológica de la levadura e identificamos 2,5-AM como un nuevo compuesto antienvejecimiento. Actualmente se está realizando un estudio para investigar los mecanismos de la actividad antienvejecimiento de 2,5-AM.

Materiales y métodos

Cepa de levadura, medios y productos químicos

En este estudio se utilizó el antecedente genético de la cepa prototrófica CEN.PK113-7D [35, 36]. Medio rico en estándar YPD (extracto de levadura Bacto al 1 por ciento, peptona Bacto al 2 por ciento y glucosa al 2 por ciento), agar YPD (agar Bacto al 2,5 por ciento) y medio sintético definido (SD) que contiene 6,7 g/l de base de nitrógeno de levadura con sulfato de amonio sin aminoácidos (DIFCO) y glucosa al 2 por ciento. La solución madre de rapamicina (Enzo) se preparó en dimetilsulfóxido (Sigma). La concentración final de DMSO no superó el 1 por ciento en ningún ensayo. Concentraciones de trabajo de 2,5-anhidro-D-manitol (Santa Cruz), D-fructosa (Sigma), D-manitol (Sigma), D-maltosa (Sigma) y D-sorbitol (Sigma) preparadas frescas por disolviendo directamente el polvo en medio y filtrando esterilizado.

Condiciones de crecimiento de la levadura

La cepa de levadura se recuperó del stock de glicerol congelado en medio de agar YPD a 30 grados. La levadura se hizo crecer en medio SD durante la noche a 30 grados con agitación a 220 rpm. Las células cultivadas durante la noche se diluyeron a OD600nm~0,2 en medio SD nuevo para iniciar los experimentos de duración cronológica.

Análisis cronológico de la vida útil

Los experimentos de vida útil cronológica (CLS) se realizaron en {{0}}placas de pocillos con un total de 20{{10}} µL de cultivo de levadura como se describió anteriormente [58]. El inóculo celular se transfirió a la 96-placa de pocillos que contenía concentraciones doblemente diluidas en serie (0-10 nM) de rapamicina. Para el ensayo de restricción calórica, se prepararon inóculos celulares en medio SD que contenía glucosa al 2 %, 0,5 % y 0,25 % y se transfirieron a 96-placas de pocillos. Asimismo, el inóculo celular se transfirió a 96-placas de pocillos que contenían concentraciones doblemente diluidas en serie (0–8 mM) de 2,5-anhidro-D-manitol, D-fructosa, D-manitol, D-maltosa y D-sorbitol. Las células se incubaron a 30 grados y se midió el crecimiento en diferentes momentos. El punto de tiempo de crecimiento de 72 h se consideró como el día 1 para el ensayo CLS. La supervivencia celular se cuantificó en varios puntos de tiempo de edad mediante tres enfoques diferentes: (i) método basado en fluorescencia de yoduro de propidio, (ii) crecimiento en medio líquido YPD y (iii) ensayo de detección.

(i) Método basado en fluorescencia de yoduro de propidio:Los procedimientos detallados para desarrollar el enfoque basado en fluorescencia de yoduro de propidio (PI) se mencionan en la sección de resultados. Para el ensayo CLS, se transfirieron {{0}}µl de células de levadura en diferentes puntos temporales de edad a una segunda placa de 96-pocillos. Las células se lavaron y se incubaron en 100 µl de PBS 1x con PI (5 µg/ml) durante 15 min en la oscuridad. Se incluyeron controles de muestras positivas y negativas para el análisis cuantitativo. El control positivo (células hervidas a 100 grados durante 15 min) se tiñó con PI y se procesó en la misma placa de 96-pocillos. Las muestras sin células teñidas con PI sirvieron como control negativo. Después de la incubación, las células se lavaron y se resuspendieron en 100 µl de PBS. La lectura de fluorescencia de la muestra (excitación a 535 nm, emisión a 617 nm) y OD600nm se midieron con el lector de microplacas (BioTek). La intensidad de fluorescencia de cada muestra se normalizó con OD600nm. La intensidad de fluorescencia normalizada de cada muestra se restó de la señal de fondo de la muestra negativa sin teñir. La intensidad de fluorescencia obtenida de la muestra de control positivo (células muertas hervidas) se consideró 0 por ciento de supervivencia celular. Confirmamos la muerte de la célula b permitiéndole crecer en el medio. Se calculó la supervivencia celular de muestras de diferentes puntos de tiempo de edad normalizando la intensidad de fluorescencia con una muestra de control positivo (células hervidas).

donde Iij(535nm∕617nm) es la intensidad fluorescente medida en el pocillo con las coordenadas de placa i y j con excitación a 535 nm y emisión a 617 nm, ID(535nm∕617nm) es la intensidad fluorescente medida para una celda con 100 por ciento muerta las células teñidas con PI, IC (535nm∕617nm) es la intensidad fluorescente medida para las células sin PI, y los valores de OD respectivos son la absorción medida para las células respectivas a 600 nm normalizando el número de células.

(ii) Excrecencia en medio líquido YPD:El cultivo estacionario de levadura (3-μL) de diferentes puntos de tiempo de edad se transfirió a una segunda placa de 96-pocillos que contenía 200 μL de medio YPD y se incubó durante 24 ha 30 grados. El crecimiento (OD600nm) de células envejecidas se midió mediante el lector de microplacas. La cuantificación de la supervivencia celular para cada punto de edad se determinó en relación con el día 1 (considerado 100 por ciento de supervivencia celular) como se describió anteriormente [19, 20, 58].

(iii) Ensayo de detección:El cultivo estacionario de levadura (3 μL) de diferentes puntos de tiempo de edad se colocó en la placa de agar YPD y se incubó durante 48 ho a 30 grados. El crecimiento de células envejecidas en la placa de agar YPD se fotografió utilizando el sistema de imágenes BioRad GelDoc.

Análisis de los datos

El análisis estadístico de todos los resultados, como el valor medio, las desviaciones estándar, la correlación (R2), la significación y la representación gráfica, se realizó con el software GraphPad Prism v.9.3.1. Los resultados se compararon estadísticamente utilizando el ANOVA unidireccional ordinario y el ANOVA bidireccional seguido de una comparación múltiple mediante la prueba post hoc de Dunnett o la prueba post hoc de Sidak. En todos los gráficos, los valores de P se muestran como *P<0.05,  **P<0.01, ***P<0.001, and ****P<0.0001 were considered significant. n.s, non-significant.

Expresiones de gratitudLos MA y FE del autor son los inventores de dos solicitudes de patente (10202201534P y 10202201536U) que incluyen parte del trabajo descrito en este artículo.

Contribución del autorMA concibió el proyecto, realizó los experimentos y analizó los datos. FE co-concibió el proyecto, evaluó los datos e ideó una estrategia. MA y FE escribieron el documento, y todos los autores revisaron el documento y aceptaron su versión final.

FondosEste trabajo fue apoyado por el Instituto de Bioinformática (BII), el Fondo de Desarrollo Profesional A*STAR (C210112008) y la subvención Global Healthy Longevity Catalyst Awards (MOH-000758–00).

Declaraciones

Conflicto de interesesLos autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acceso abiertoEste artículo tiene una licencia Creative Commons Attribution 4.0 International License, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales. ) y la fuente, proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor.

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