La proteasa Calpain2a limita la inmunidad innata al apuntar a TRAF6 en peces teleósteos

El factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6) desempeña un papel clave en la transducción de señales en las vías de señalización antibacterianas y antivirales. Sin embargo, los mecanismos reguladores de TRAF6 en vertebrados inferiores están menos informados. En este estudio, identificamos calpaína2a, como miembro de la familia de proteasas dependientes de calcio con actividad enzimática hidrolítica única, y funciona como un regulador clave para la inmunidad antibacteriana y antiviral en peces teleósteos. Tras la estimulación con lipopolisacáridos (LPS), la eliminación de calpaína2a promueve la regulación positiva de las citocinas inflamatorias. Mecánicamente, calpain2a interactúa con TRAF6 y reduce el nivel de proteína de TRAF6 mediante hidrolización. Después de la pérdida de actividad enzimática, la calpaína2a mutante inhibe competitivamente la formación de dímeros y la autoubiquitinación de TRAF6. La eliminación de calpain2a también promueve la respuesta antiviral celular. La calpaina2a mutante que carece de actividad hidrolasa reprime la ubiquitinación del factor regulador de IFN (IRF) 3/7 de TRAF6. En conjunto, estos hallazgos clasifican a la calpaína2a como un regulador negativo de las respuestas inmunes innatas al atacar a TRAF6 en peces teleósteos.

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Como primera línea de defensa contra patógenos invasores, la inmunidad innata ejerce un papel importante en la protección del cuerpo contra la invasión bacteriana y las infecciones virales. Los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) en la membrana reconocen inmediatamente los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) 1–3. Los tres PRR más estudiados en la inmunidad innata son los receptores tipo Toll (TLR), los receptores tipo RIG-I (RLR) y los receptores tipo NOD (NLR), que reconocen diferentes PAMP y desencadenan cascadas de señales para activar citoquinas proinflamatorias y factor antiviral4–6. El factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF) es una parte indispensable en la lucha contra la invasión bacteriana y las infecciones virales. Como vía de señalización importante activada por lipopolisacárido (LPS), se ha trazado en detalle la vía del factor de transcripción nuclear-κB (NF-κB). La mayoría de las funciones de las proteínas en la vía de señalización de NF-κB se han estudiado ampliamente1,7. El factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) es activado primero por los TLR en respuesta al LPS, e IRAK4 actúa como mediador al activar IRAK1 e IRAK2, que vinculan MyD88 con TRAF68-11. Ubc13 y Uev1A catalizan la ubiquitinación ligada a K63-de TRAF6, que transfiere la cadena de ubiquitina K63 a TAB2 y TAB3, lo que lleva a la activación de TAK112-16. El activador 2 de IKK regulado por TRAF6- (TRIKA2), que está compuesto por TAK1, TAB1 y TAB2, activa el inhibidor de la quinasa IκB (IKK)/fosforilación17–19. El factor de transcripción NF-κB ingresa al núcleo y promueve la producción de citocinas inflamatorias20. Cuando TLR7/9 reconoce el virus, el complejo MyD88- IRAKs-TRAF6 transmite señales al factor regulador de IFN (IRF) 7, promueve la ubiquitinación de IRF7 y activa su fosforilación en el núcleo21,22. En la vía de señalización RLR, RIG I y el gen 5 asociado a la diferenciación del melanoma (MDA5) activan la proteína de señalización antiviral mitocondrial (MAVS)23,24. La agregación de MAVS es una característica importante del inicio de la transmisión de señales RLR23,25,26. TRAF2/3/6 son los primeros factores activados por MAVS27,28. TRAF3 activará la señalización de TBK1-IRF3 y el complejo MAVS-TRAF6 activará la señalización de NF-κB, que promueve la expresión de IFN-127,29.

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El mecanismo molecular de activación de TRAF6 ya ha sido demostrado. TRAF6 en forma de dímero se somete a autoubiquitinación bajo la catálisis de Ubc13 y Uev1A, que está relacionado con el dominio del dedo anular y el dominio de los dedos ZF. El modelo de TRAF6/Ubc13~UB confirma el importante papel del dímero TRAF6 en la agregación y transmisión de la cadena de ubiquitina K6330. Además, se ha informado que el dominio de los dedos anular y ZF recluta conjugados E2~ub en el modelo cristalino de TRAF6 del pez cebra, y se descubrió que TRAF6 podría formar un heterodímero con TRAF5 de la misma familia TRAF por primera vez16. Las proteínas de la familia de la desubiquitinación: A20, CYLD, USP2a, USP4 y USP20 se dirigen a TRAF6 para eliminar la ubiquitinación ligada a K63-y reducir la señalización posterior31–35. El sistema de dos híbridos de levadura descarta la interacción entre UBE2O y TRAF6 y confirma que esta interacción afecta directamente la activación de TRAF6 por MyD8836. En el proceso de transducción de señales aguas abajo de TRAF6, ECSIT como proteína intermedia interactúa con TRAF6 y TAK1 respectivamente, y esta interacción fortalece la unión de TRAF6 y TAK137. En la señalización de TLR4 inducida por LPS, los PRDX evitan que TRAF6 reclute ECSIT para administrar la cadena de ubiquitina K63 y también inhiben BECN1 activado por TRAF6 en la vía de autofagia38. MST4 activa la fosforilación de TRAF6 en Thr463 y Thr486 e inhibe la dimerización y ubiquitinación de TRAF639. En los mamíferos, el mecanismo de regulación de la proteína TRAF6 se ha estudiado ampliamente en la inmunidad antibacteriana y antiviral. Sin embargo, la investigación de TRAF6 en vertebrados inferiores está menos estudiada. La respuesta inmune en peces teleósteos se basa principalmente en las vías TLR y RLR para ejecutar la respuesta inmune después de la infección por patógenos. Por lo tanto, es crucial explorar el mecanismo regulador de las vías de señalización mediadas por TRAF6-. calpaína2 (m-calpaína) es una familia de proteasas dependientes de calcio, que está compuesta por más de 16 miembros en mamíferos y muchos otros organismos40. El estudio más antiguo de la familia de proteínas calpaína está relacionado con el movimiento celular41. La calpaína promueve la migración celular y se descubrió que inhibe la migración de neutrófilos y la activación de p38 MAPK y ERK MAPK42. La actividad de la hidrolasa es una de las funciones importantes de la calpaína. En la regulación inmune, la calpaína-2 promueve la liberación de NF-κB al hidrolizar IkB y activa la vía de señalización43. En este estudio, hemos determinado que calpaína2a interactúa con TRAF6 y actúa como regulador negativo en respuestas antibacterianas y antivirales en peces teleósteos, corvina miiuy (Miichthys miiuy). calpain2a promueve la degradación del nivel de proteína TRAF6 a través de su actividad hidrolasa. Mientras tanto, la calpaina2a mutante que carece de actividad hidrolasa inhibe la formación de la cadena de ubiquitina K63 al inhibir el dímero de TRAF6. Se refleja que tanto la calpaína2a como la calpaína2a mutante terminan la ubiquitinación de TRAF6 a ECSIT/BENC1/IRF3/IRF7. calpain2a detiene el proceso de señalización de NF-κB e IFN al apuntar a TRAF6. Nuestros resultados proporcionan una molécula para el estudio de la regulación inmune mediada por TRAF6-en vertebrados inferiores.

Resultados

calpain2a interactúa con TRAF6 y regula negativamente la señalización de NF-κB.

Para obtener información sobre las proteínas asociadas a TRAF6-en la respuesta de inmunidad innata en peces teleósteos, caracterizamos el interactoma TRAF6 de corvina miiuy mediante purificación por afinidad y espectrometría de masas. Ordenados por intensidad de cuantificación sin etiquetas (LFQ), interceptamos parte de los datos y los mostramos (Fig. 1a). Entre las proteínas asociadas a TRAF6-, la calpaína2a puede regular la actividad de TRAF6 y afectar las vías de señalización mediadas por TRAF6-. En primer lugar, se debe investigar la relación entre calpaína2a y TRAF6 a nivel de proteína; verificamos la interacción de calpaína2a con TRAF6 en líneas celulares de riñón de corvina Miiuy (MKC). Los experimentos de coinmunoprecipitación endógena indicaron que calpaína2a interactúa con TRAF6 (Fig. 1b, c). Como lo muestran los experimentos de transfección transitoria y coinmunoprecipitación, la calpaína2a y TRAF6 sobreexpresadas interactuaron entre sí (Fig. 1d, e). Todo esto indica que calpain2a interactúa con TRAF6 y se necesitan más experimentos para investigar el mecanismo de su acción. Mediante la alineación de secuencias múltiples de las proteínas calpaína2a humana, de ratón, de pez cebra y de corvina, la calpaína2a se conserva evolutivamente entre peces y mamíferos (Fig. 1f). Para determinar la función de calpaína2a en la inmunidad innata, examinamos si calpaína2a estaba asociada con la activación de NF-κB inducida por la estimulación con LPS. Transfectamos células de epitelioma papuloso ciprínido (EPC) con indicador de luciferasa NF-κB, indicador de luciferasa de renilla de control interno y vector que codifica calpaína2a o vector vacío. calpain2a redujo sustancialmente la actividad informadora de NF-κB tras la estimulación con LPS de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1g). Además, las citocinas proinflamatorias como el promotor IL-1 e IL-8 que responden a la estimulación con LPS disminuyeron notablemente en las células EPC sobreexpresadas con calpaína2a (Fig. 1h, i), lo que sugiere un papel potencial de la calpaína2a en la señalización inflamatoria. vías inducidas por la estimulación con LPS.

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Regulación negativa de la señalización de NF-κB inducida por LPS por calpaína2a.

Para investigar el papel potencial de calpaína2a en la señalización de NF-κB, transfectamos calpaína2a en MKC con un gradiente de tiempo de LPS y evaluamos las citoquinas proinflamatorias que responden a LPS. La sobreexpresión de calpaína2a condujo a una regulación negativa de la expresión de IL-1, IL-8 e IL-6 (Fig. 2a). A continuación, diseñamos dos pequeños ARN de interferencia (ARNip) específicos de calpaína2a que regulaban a la baja eficientemente la calpaína2a (Fig. 2b, d). La eliminación de calpaína2a mejoró significativamente las citocinas proinflamatorias inducidas por LPS, incluidas IL -1 e IL -8 en líneas celulares de intestino de corvina (MIC) MKC y Miiuy (Fig. 2c, e). En el grupo de células estimuladas por LPS, la eliminación de calpaína2a mejoró la proliferación celular. De manera similar, en ausencia de estimulación, encontramos que la eliminación de calpaína2a también mejoró la proliferación celular (Fig. 2f). Para determinar si la calpaína2a inhibió las proteínas en la señalización de NF-κB inducida por LPS, la calpaína2a inhibió notablemente el nivel de proteína endógena de TRAF6 pero no MyD88, IRAK4 o TAK1 (Fig. 2g). En resumen, la cinética de calpaína2a y la expresión de citoquinas proinflamatorias sugirieron una participación funcional de calpaína2a en la señalización de NF-κB inducida por LPS.

Fig. 1 calpain2a interactúa con TRAF6 e inhibe la vía de señalización NF-κB. a Lista de interactoma TRAF6 basada en la intensidad de cuantificación sin etiquetas (sección). b, c Células MKC sembradas en placas de 6 cm2. Después de 24 h, los lisados ​​​​celulares se inmunoprecipitaron (IP) con geles de afinidad anti-TRAF6 o anti-calpaína2a. Luego, IB analizó los inmunoprecipitados y los lisados ​​​​celulares con los Abs anti-TRAF6 y anti-calpaína2a, respectivamente. d, e Se transfectaron células HEK 293 sembradas en placas de 6 cm2 con los plásmidos calpain2a-Flag y TRAF6-Myc (2 ug cada uno). Después de 24 h, los lisados ​​​​celulares se inmunoprecipitaron (IP) con geles de afinidad anti-Myc d o anti-Flag e. Luego, IB analizó los inmunoprecipitados y los lisados ​​​​celulares con los Abs anti-Myc y anti-Flag, respectivamente. f Los mismos aminoácidos entre la calpain2a humana (Hu-calpain2), la calpain2a de ratón (Mu-calpain2), la calpain2a de pez cebra (ZF-calpain2a) y la calpain2a de corvina miiuy (M-calpain2a) están resaltados con fondo negro. Las células g-I EPC se transfectaron con calpain2a-Flag o un vector vacío junto con los informadores de luciferasa NF-κB, IL-1 e IL-8. A las 24 h después de la transfección, las células no se trataron (simuladas) o se trataron con LPS durante 6 h. El valor de la actividad luciferasa se logró frente a la actividad luciferasa de Renilla (n=3 por grupo). Se utilizó análisis de transferencia Western para medir la expresión de la bandera calpain2a transfectada transitoriamente. La expresión de tubulina se utilizó como control de carga. Los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vías (g, h, i). **p<0.01. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres experimentos independientes.

La interacción de calpain2a con TRAF6.

El análisis de dominio se realizó utilizando el NCBI de la base de datos de dominio conservado (CDD). calpain2a comprende tres dominios: un dominio de cisteína proteasa (CysPc) de la familia Calpain (aa 46-339), un dominio central de subunidad grande III de Calpain (aa 360-499) y un dominio de mano Penta-EF C-terminal ( aa 500-697). Para determinar qué dominio(s) de calpaína2a eran necesarios para su interacción con TRAF6, creamos tres mutantes de truncamiento: calpaína2a (1-339), calpaína2a (340-697) y calpaína (500-697) (Figura 3a). Las células HEK293 se transfectaron con calpain2a-Flag de tipo salvaje (WT), mutantes de truncamiento de calpain2a-Flag o vector TRAF6-HA. Descubrimos que tanto la calpaína2a de longitud completa como tres mutantes de truncamiento podrían interactuar con TRAF6 (Fig. 3c). TRAF6 se compone de un dominio TRAF C-terminal, un dominio en espiral, un dominio de dedos de zinc y un dominio de dedo anular38. Para examinar qué dominio(s) de TRAF6 eran necesarios para su interacción con calpain2a, creamos una serie de mutantes truncados de TRAF6, incluidos TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36 }}) y TRAF6 (400-574). Mientras tanto, creamos los dominios mutantes: TRAF6ΔRing (en el que se elimina el dominio del dedo anular), TRAF6ΔZF (en el que se elimina el dominio de los dedos de zinc), TRAF6ΔCC (en el que se elimina el dominio en espiral) y TRAF6ΔTRAF-C ( en el que se elimina el dominio TRAF C-terminal) (Fig. 3b). calpain2a interactuó con el TRAF6 de longitud completa, así como con truncamientos de TRAF6 que contenían el dominio TRAF C-terminal, un dominio en espiral, un dominio de dedos de zinc (Fig. 3d, f), pero no con el dominio del dedo anular (Fig. 3e). . Los ensayos de luciferasa mostraron que la sobreexpresión de calpaína2a y estos mutantes de truncamiento inhibieron significativamente la actividad informadora de NF-κB e IL-1 en células EPC (Fig. 3h). Además, se investigaron las colocalizaciones subcelulares de calpain2a con TRAF6. Transfectamos células EPC con TRAF6-GFP y un vector vacío o calpain2a-mCherry. El análisis de microscopía confocal demostró que las señales verdes de TRAF6 se superponían con las señales rojas de calpain2a, lo que indicó que calpain2a se co-localiza con TRAF6 en células EPC (Fig. 3i, j). Estos datos indican que la base estructural de múltiples dominios de TRAF6 (dominio TRAF C-terminal, dominio en espiral, dominio de dedos de zinc), pero no el dominio del dedo anular, es determinante para su asociación con calpaína2a (Fig. 3g).

Fig. 2 calpain2a negativa regula la vía de señalización NF-κB inducida por LPS. un ARNm de IL-1, IL-8 e IL-6 en MKC transducido con calpain2a-Flag o vector vacío y tratado con solución salina (0) o expuesto a LPS para varios veces (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n=3 por grupo). b, d Se transfectaron células MKC y células MIC con si-calpain2a #1 y si-calpain2a #2 (100 nM) o si-ctrl (100 nM). A las 48 h posteriores a la transfección, la expresión de calpaína2a se midió mediante qRT PCR (n=3 por grupo). El nivel de proteína calpaína2a se determinó mediante transferencia Western. c, e ARNm de IL-1, IL-8 en MKC y MIC transducidos de manera estable con si-calpain2a #1 o si-ctrl (vector de control) y tratados con solución salina (0) o expuestos a LPS para varios veces (4 h, 8 h) (n=3 por grupo). Se transfectaron células MKC con si-ctrl o si-calpain2a #1. A las 36 h después de la transfección, las células se estimularon con LPS durante 12 h, luego se midió el ensayo de proliferación celular (n=3 por grupo). Barra de escala, 100 μm. Se transfectó g calpain2a-Flag en células MKC que se expusieron a LPS en varios momentos (3 h, 6 h, 9 h). Análisis por inmunotransferencia de lisados ​​celulares con Abs indicados. El nivel relativo de ARNm se normalizó con respecto a la expresión del gen que codifica la actina en cada muestra. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres experimentos independientes. Los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vías (a, c, e, f) o ANOVA de una vía (b, d). *p < 0,05, **p < 0,01.

Fig. 3 La interacción de calpain2a con TRAF6. a, b En este estudio se utilizaron diagramas esquemáticos de la organización de dominios en miiuy corvina calpain2a, TRAF6 y mutantes. "+" representa la interacción con TRAF6 o calpain2a, "-" significa que no hay interacción. c Se transfectaron células HEK293 con mutantes simulados, calpain2a-Flag de tipo salvaje (WT) y calpain2a-Flag truncados, o TRAF6-HA como se indica. A las 24 h después de la transfección, se extrajeron las células transfectadas y los lisados ​​​​celulares se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpo anti-HA seguido de IB usando anticuerpo anti-HA o anti-Flag. Las células d – f HEK293 se transfectaron con mutantes simulados, TRAF6-HA de tipo salvaje (WT) y TRAF6-HA truncados, o calpain2a-Flag, como se indica. A las 24 h después de la transfección, se extrajeron las células transfectadas y los lisados ​​​​celulares se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpo anti-HA d, f o anticuerpo anti-Flag e seguido de IB usando anticuerpo anti-HA o anti-Flag. g El sitio de interacción de TRAF6 y calpain2a. Se transfectaron células h EPC con mutantes truncados TRAF6-HA, calpain2a-Flag o calpain2a-Flag junto con informadores de luciferasa NF-κB e IL-1. Después de 36 h después de la transfección, el valor de la actividad luciferasa se alcanzó frente a la actividad de la luciferasa renilla (n=3 por grupo). Se transfectaron células I j EPC con simulacro, calpain2a-mCherry y TRAF6-GFP. Los núcleos teñidos con DAPI se muestran en azul. calpain2a se detectó con fluorescencia roja y TRAF6 con fluorescencia verde. Barra de escala, 10 μm. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres experimentos independientes. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional (h). **p<0,01.

calpain2a inhibe el nivel de expresión de la proteína TRAF6 mediante actividad proteolítica.

Para explorar el mecanismo regulador de calpaína2a en TRAF6, primero examinamos si calpaína2a tenía un efecto sobre TRAF6 a nivel de proteína. calpain2a-Myc y TRAF6-Flag se cotransfectaron en células EPC, el nivel de proteína de TRAF6 se degradó parcialmente a las 30 h (Fig. 4a). Como se muestra en la Fig. 4b, calpain2a promovió la degradación de TRAF6 de manera dependiente de la dosis. En presencia de calpaína2a, no afectó el nivel de ARNm de TRAF6, lo que indica que calpaína2a solo afecta el nivel de proteína de TRAF6. Mientras tanto, el ensayo del inhibidor cicloheximida (CHX) demostró que la calpaína2a podría acelerar la vida media de la proteína TRAF6 (Fig. 4c). La sobreexpresión de calpaína2a en células MKC resultó en la desestabilización de TRAF6 endógeno (Fig. 4d). Para investigar si la degradación de TRAF6 mediada por calpaína2a dependía de las vías ubiquitina-proteasoma, autofagosoma, lisosomal u otras, se trataron células EPC con reactivos que inhibían estas vías: MG132, 3-MA y NH4Cl. Sin embargo, la desestabilización de TRAF6 mediada por calpaína2a no fue revertida por el inhibidor proteasómico MG132, el inhibidor autofágico 3-MA o el inhibidor lisosomal NH4Cl (Fig. 4e). A continuación, las células EPC se trataron con los reactivos: E-64 (un inhibidor de calpaína que inactiva la actividad de la calpaína hidrolasa) y PMSF (inhibidor de serina proteasa no específico). Descubrimos que el inhibidor de calpaína E -64 evitó la degradación en el nivel de proteína TRAF6 (Fig. 4f). Como se muestra en la Fig. 4g, E-64 también revirtió la degradación de los niveles endógenos de proteína TRAF6 por calpaína2a.

Fig. 4 calpaína2a inhibe la expresión de la proteína TRAF6. a El experimento de gradiente de tiempo de vectores vacíos o plásmidos calpain2a-Myc junto con TRAF6- Flag se realizó en células EPC. Los lisados ​​​​celulares se sometieron a IB con Abs anti-Myc, anti-Flag y anti-Tubulin. El ARN se extrajo de las células y se transcribió de forma inversa, y luego se amplificaron TRAF6 y actina mediante cebadores de PCR. b Se sembraron células EPC en placas de pocillos 12- durante la noche y se cotransfectaron con TRAF6-Flag y calpain2a-Myc (0.3, 0.6 o {{ 18}}.9 ug) durante 48 h. La expresión de las proteínas TRAF6-Flag y calpain2a-Myc se detectó mediante transferencia Western. El ARN se extrajo de las células y se transcribió de forma inversa, luego se amplificaron TRAF6 y actina mediante cebadores de PCR. c calpain2a-Myc o vectores vacíos se cotransfectaron con TRAF6-Flag en células EPC. A las 36 h después de la transfección, las células transfectadas se trataron con cicloheximida (CHX) durante 2 o 4 h. Las células d MKC se transfectaron con calpain2a-Flag o vectores vacíos. A las 48 h después de la transfección, los lisados ​​​​celulares se sometieron a IB con Abs anti-TRAF6, anti-Flag y anti-Tubulin. e, f Se transfectaron células EPC con los plásmidos indicados en presencia o ausencia de MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 o 75 μM), o PMSF durante 6 h antes de realizar el análisis de inmunotransferencia. g Se transfectaron células MKC con calpain2a-Flag en presencia o ausencia de E{{50}} (50 o 75 μM) durante 6 h antes de realizar el análisis de inmunotransferencia. h calpain2a-Flag y calpain2a-ΔCysPc-Flag se cotransfectaron con TRAF6-HA en células EPC. A las 48 h después de la transfección, los lisados ​​​​celulares se sometieron a IB con los Abs indicados. I calpain2a-Flag y calpain2a-ΔCysPc-Flag se cotransfectaron en células MKC. A las 48 h después de la transfección, los lisados ​​​​celulares se sometieron a IB con Abs anti-TRAF6, anti-Flag y anti-Tubulin. j ARNm de IL-1, IL-8 en MKC transducido de forma estable con calpain2a-Flag y calpain2a-ΔCysPc-Flag y tratado con solución salina (0) o expuesto a LPS durante 4 h (n=3 por grupo). El nivel relativo de ARNm se normalizó con respecto a la expresión del gen que codifica la actina en cada muestra. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres experimentos independientes. Los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vías (j). **p<0,01.

Determinar si la degradación de TRAF6 dependía de la actividad hidrolasa de calpaína2a. Aprovechando estudios estructurales y bioquímicos previos de calpaína2a en mamíferos, mutamos los residuos de cisteína, histidina y asparagina de calpaína2a a alanina (calpaína2a C105A, H262A, N286A y 3 A), lo que perdió la coordinación de la tríada catalítica44–46. Observamos que la degradación de TRAF6 no se vio afectada por esta mutación (Figura complementaria 1a). Entonces, mutamos el dominio de proteasa, que es el dominio de cisteína proteasa (CysPc) de la familia Calpain de calpain2a (designado como calpain2a-ΔCysPc). Ni el TRAF6 sobreexpresado ni el TRAF6 endógeno se ven afectados por calpaína2a-ΔCysPc (Fig. 4h, i). Sin embargo, las citoquinas proinflamatorias IL -1 e IL -8 se ven afectadas simultáneamente por calpaína2a de tipo salvaje o mutada tras la estimulación con LPS (Fig. 4j). La calpaína2a mutante que carece de actividad hidrolasa no afecta el nivel de proteína de TRAF6, pero la calpaína2a mutante que carece de actividad hidrolasa aún afecta la expresión de citocinas proinflamatorias posteriores. Esto desencadenó nuestra investigación sobre los mecanismos potenciales mediante los cuales calpain2a regula TRAF6. En conjunto, estos resultados revelan que la calpaína2a regula la señalización de NF-κB al suprimir la expresión de los niveles de proteína TRAF6, a través de su actividad calpaína hidrolasa.

calpain2a inhibe la actividad de la ubiquitina-ligasa TRAF6.

A continuación, exploramos los mecanismos moleculares mediante los cuales la calpaína2a regula negativamente la señalización de NF-κB activada por TRAF6-, y si la interacción de calpaína2a con TRAF6 tras la pérdida de actividad enzimática modula su actividad de ubiquitina ligasa. Tratamos células MKC con LPS y luego inmunoprecipitamos TRAF6. El ensayo de ubiquitinación con proteínas recombinantes purificadas confirmó que calpaína2a y calpaína2a-ΔCysPc disminuyeron la ubiquitinación de TRAF6 (Fig. 5a). Como se muestra en la Fig. 5b, c, tanto calpain2a como calpain2a-ΔCysPc redujeron significativamente las proteínas ubiquitinadas WT y K63 de TRAF6. Los gradientes de concentración de calpaína2a y calpaína2a-ΔCysPc redujeron las proteínas ubiquitinadas WT y K63 de TRAF6 de una manera dependiente de la dosis. calpain2a-ΔCysPc aún evitó la agregación de la cadena de ubiquitina K63 de TRAF6 sin afectar el nivel de proteína TRAF6 (Fig. 5d, e). Luego, transfectamos células MKC para expresar TRAF6 etiquetado con Myc en presencia o ausencia de calpaína2a-ΔCysPc marcada con Flag, luego realizamos experimentos de inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-Myc y los analizamos mediante inmunotransferencia con anti-UB. Dicha ubiquitinación de TRAF6 fue sustancialmente atenuada por calpain2a-ΔCysPc (Fig. 5f). Estimulado por LPS, TRAF6 entrega la cadena de ubiquitina unida a K63-a TAK1, lo que estimula la autofosforilación de TAK1 y activa NF-κB18. Las proteínas de ubiquitina WT y K63 de TAK1 mejoraron significativamente en presencia de TRAF6, mientras que la ubiquitinación ligada a TAK 1- se inhibió en presencia de calpaína2a-ΔCysPc (Fig. 5g, h). Estos datos respaldan que la calpaina2a mutante que carece de actividad hidrolasa inhibe de manera similar la actividad de la ubiquitina ligasa TRAF6 sin afectar los niveles de proteína TRAF6.

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calpain2a inhibe la homooligomerización de TRAF6.

La cadena de ubiquitina Lys63 sintetizada por TRAF6 juega un papel clave en la transducción de señales. Se ha informado que la dimerización de TRAF6 es esencial para la síntesis de su cadena de ubiquitina16. El modelo de dimerización está estrechamente relacionado con la combinación de Ubc13 para producir la ubiquitinación de K6316,30. Para verificar si los peces TRAF6 podían formar dímeros, utilizamos plásmidos TRAF6 con diferentes etiquetas: TRAF6 etiquetado con Myc y TRAF6 etiquetado con HA para experimentos co-IP. El ensayo de IP se realizó utilizando un anticuerpo anti-HA, HATRAF6 interactuó con Myc-TRAF6 (Fig. 6a). Para explorar el efecto inhibidor de la calpaína2a en la interacción del dímero TRAF6-, se expresaron transitoriamente calpaína2a marcada con Flag, TRAF6 marcada con HA y TRAF6 marcada con Myc en células HEK293. Como se esperaba, la interacción del dímero TRAF6- disminuyó en presencia de calpaína2a (Fig. 6b). Al mismo tiempo, para evitar la presencia de la degradación de TRAF6 por calpaína2a. Transfectamos calpaína2a-ΔCysPc marcada con Flag y descubrimos que la interacción del dímero TRAF6- disminuyó gradualmente en presencia de calpaína2a-ΔCysPc (Fig. 6c). Como se muestra en la Fig. 6d, e, encontramos ubiquitinación WT y K63 mejorada por HA-TRAF6 de Myc-TRAF6. Si bien las células HEK293 se cotransfectaron con calpaína2a y calpaína2a-ΔCysPc, se suprimiría la ubiquitinación mejorada. Estos resultados sugieren que tanto la calpaína2a de tipo salvaje como la calpaína2a mutante que carece de actividad hidrolasa inhiben la homooligomerización y la autoubiquitinación de TRAF6.

calpain2a inhibe la entrega de la ubiquitinación de TRAF6 a ECSIT y BECN1.

Como se muestra en la Fig. 5d, encontramos que calpain2a interfirió con el proceso de ubiquitilación de TRAF6 a TAK1. Se ha informado que ECSIT actuó como una proteína adaptadora de TAK1 y TRAF6 para promover la señalización de NF-κB mediante estimulación con LPS37. Para verificar si ECSIT tenía las funciones mencionadas en peces teleósteos, realizamos múltiples alineamientos de secuencias de proteínas ECSIT en humanos, ratones y corvinas (Figura complementaria 1b). Transfectamos células EPC con indicador de luciferasa NF-κB, ECSIT mejoró significativamente la actividad indicadora de NF-κB después de la estimulación con LPS (Figura complementaria 1c). La sobreexpresión de ECSIT en células MKC condujo a una regulación positiva del nivel de ARNm de TNF- (Figura complementaria 1d). Después de transfectar peces ECSIT y TRAF6 en células HEK293, encontramos que TRAF6 interactuaba con ECIST (Fig. 7a). De manera similar, ECSIT y TAK1 se cotransfectaron y las dos proteínas también mantuvieron la interacción (Fig. 7b). Posteriormente, para verificar si calpaína2a-ΔCysPc inhibe la formación del complejo TRAF6-ECSIT, transfectamos los tres plásmidos en células HEK293 y descubrimos que calpaína2a-ΔCysPc previno el complejo TRAF6-ECSIT (Fig. 7c ). Verificar el proceso de transmisión de la cadena de ubiquitina en la señalización de NF-κB. Como se muestra en la Fig. 7d, TRAF6 podría promover la ubiquitinación de ECSIT; Como se esperaba, calpain2a-ΔCysPc inhibió el proceso mediante el cual TRAF6 transmitió la cadena de ubiquitina a ECSIT. BECN1 es una proteína importante en la autofagia inducida por LPS. Se ha confirmado que la ubiquitinación de K63 podría modificar y activar BECN1. La enzima desubiquitinante A20 elimina la ubiquitinación de BECN1 e inhibe la autofagia causada por LPS, y TRAF6 es la ligasa E3 responsable de la ubiquitinación de BECN1 en esta señal47. Como se muestra en la Fig. 7e, TRAF6 interactuó con BECN1 y promovió la ubiquitinación de BECN1. Luego transfectamos BECN1, TRAF6, calpain2a y calpain2a-ΔCysPc en células HEK293, TRAF6 promovió la ubiquitinación de BECN1. calpain2a-ΔCysPc inhibió el proceso mediante el cual TRAF6 transmitió la cadena de ubiquitina a BECN1 (Fig. 7f). Estos resultados sugieren que la calpaína2a de tipo salvaje y la calpaína2a mutante que carece de actividad hidrolasa inhiben la capacidad de ubiquitinación de TRAF6 en la autofagia inducida por LPS y la señalización de NF-κB.

Regulación negativa de la respuesta antiviral por calpaína2a.

En la vía RLR, TRAF6 actúa como una ligasa E3 reclutada por MAVS para activar NF-κB, la producción de IFN y citocinas. A continuación, examinamos si calpain2a desempeñaba un papel en la prevención de TRAF6 en el proceso antiviral mediado por IFN. En células EPC, se expresaron indicadores de luciferasa impulsados ​​por el promotor IFN-1, ISRE e IRF3. Descubrimos que calpain2a redujo sustancialmente estas actividades de luciferasa impulsadas por el promotor de una manera dependiente de la dosis tras la estimulación con Ploy (I: C) y Siniperca engaña a la infección por rabdovirus (SCRV) (Fig. 8a, b). La eliminación de calpain2a mejoró significativamente la expresión de genes desencadenados por Ploy (I: C) y SCRV, incluidos Viperin, Mx1 e ISG15 (Fig. 8c, d). La eliminación de calpaína2a dio como resultado una mayor expresión de la viabilidad celular tras la infección por SCRV en células MKC (Fig. 8e). Como se muestra en la Fig. 8f, los ensayos de proliferación celular revelaron que la eliminación de calpaína2a mejoraba la proliferación celular tras la infección por SCRV. La sobreexpresión de calpaína2a promovió drásticamente la propagación del virus, como lo refleja la replicación viral después de la infección por SCRV (Fig. 8g). calpain2a y calpain2a-ΔCysPc redujeron sustancialmente los indicadores de luciferasa impulsados ​​por el promotor IFN-1, ISRE e IRF3 tras la estimulación con Ploy (I: C) y la infección por SCRV (Figuras complementarias 2a, b). Estos resultados sugieren que calpain2a puede regular negativamente la vía de señalización RLR mediante la inhibición de TRAF6, inhibiendo así la activación de IFN.

Fig. 5 calpaina2a inhibe la actividad de ubiquitina-ligasa TRAF6. a Ubiquitinación de TRAF6 endógeno en células MKC transducidas con calpain2a-Flag y calpain2a-ΔCysPc-Flag y no desafiadas (-) o desafiadas con LPS (+), evaluadas mediante análisis de inmunotransferencia con antiubiquitina después de inmunoprecipitación con anti-TRAF6 y análisis de inmunotransferencia de entrada con Abs indicados. b, c Se cotransfectaron células HEK293 con TRAF6-HA y WT-ubiquitina-His o ubiquitina-His K63O (en las que solo se conserva la lisina 63) junto con calpaína2a-Flag, calpaína2a-ΔCysPc-Flag o vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y purificaron con agarosa Ni-NTA. d, e Las células HEK293 se cotransfectaron con TRAF{{30}}HA y WT-ubiquitina-His o K63O-ubiquitina-His (en las que solo se mantiene la lisina 63) junto con calpaína2a-Flag ({{45 }}.5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) o vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y purificaron con agarosa Ni-NTA. f Ubiquitinación de TRAF6 sobreexpresado en células MKC transducidas con calpaína2a-ΔCysPc-Flag, evaluada mediante análisis de inmunotransferencia con antiubiquitina después de inmunoprecipitación con anti-Myc y análisis de inmunotransferencia de entrada con Abs indicado. Las células g, h HEK293 se cotransfectaron con TAK1-Myc, TRAF6-HA y WT-ubiquitina-His o K63O-ubiquitina-His (en las que solo se conserva la lisina 63) junto con calpaína2a-Flag. , calpain2a-ΔCysPc-Flag o vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y purificaron con agarosa Ni-NTA. Todos los inmunoprecipitados y análisis de inmunotransferencia de entrada con Abs anti-Myc, anti-Flag, anti-HA y anti-Tubulin. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres experimentos independientes.

calpain2a suprime la ubiquitinación de IRF3 e IRF7 de TRAF6.

Se informa que en la señal antiviral desencadenada por el complejo MAVS-TRAF3/6, la actividad de TRAF6 es necesaria para la activación de IRF3 y NF-κB48. Como se muestra en la Fig. 9a, b, TRAF6 promueve la ubiquitinación ligada a WT y K 63- de IRF3, y esta mejora es inhibida por la expresión de calpaína2a-ΔCysPc. Mientras tanto, cuando el virus desencadena una señal de señalización dependiente de TLR, TRAF6 está estrechamente relacionado con IRF7 y promueve la ubiquitinación de IRF7 junto con factores antivirales activados22,49,50. TRAF6 promueve la ubiquitinación ligada a WT y K 63- de IRF7, y esta mejora es inhibida por la expresión de calpaína2a-ΔCysPc (Fig. 9c, d). Estos datos sugieren que la calpaína2a de tipo salvaje y la calpaína2a mutante que carece de actividad hidrolasa inhiben la ubiquitinación mediada por TRAF6-de IRF3 e IRF7.

Discusión

TRAF6 es uno de los siete miembros de la familia de factores asociados al receptor (TRAF) del factor de necrosis tumoral (TNF), que ha sido identificado como un adaptador de señal y ejerce transducción de señales51,52. La familia TRAF contiene el dominio Ring Finger, que posee la actividad ligasa E3. Las ligasas E3 con el dominio HECT promueven la poliubiquitinación del sustrato, y las E3 con el dominio Ring requieren E2~ub para transmitir la poliubiquitinación53,54. Se ha confirmado que la enzima de unión al dímero Ub Ubc13/Uev1A está implicada en la agregación de la poliubiquitinación de TRAF616. Mientras que K124 de TRAF6 de ratón está desactivado, TRAF6 perderá la actividad de autoubiquitinación de K63 y la mutación en este sitio elimina la ubiquitinación de NEMO mediada por TRAF6- y la activación de TAK1, IKK y NF-κB55. . Es preciso porque PRDX1 se une al dominio Ring Finger de TRAF6 contenido en K124 y elimina la ubiquitinación de TRAF638. Se ha informado que la ubiquitinación de TRAF6 está estrechamente relacionada con la dimerización de su dominio N-terminal (dominio del dedo anular y del dedo ZF). Se mutaron múltiples sitios de interacción N-terminal con Ubc13, y Ubc13 no pudo transmitir poli~ub a TRAF616. La interacción entre calpaína2a y los mutantes TRAF6 mostró que la mayoría de los dominios de TRAF6 interactuaban con calpaína2a, excepto el dominio del dedo anular. Debido a la interacción entre calpain2a y el dominio de dedos ZF de TRAF6, especulamos que calpain2a podría inhibir la autoubiquitinación al bloquear la dimerización de TRAF6. Posteriormente, verificamos la interacción de diferentes etiquetas de TRAF6. A medida que aumentó la expresión de calpaina2a mutante que carecía de actividad hidrolasa, la interacción de diferentes etiquetas de TRAF6 se debilitó. TRAF6 etiquetado con HA promueve la ubiquitinación de TRAF6 etiquetado con Myc, y la calpaina2a mutante inhibe la ubiquitinación mejorada por TRAF6 etiquetado con HA. Como intermediario en el proceso de transmisión de la señal TRAF6-TAK1, ECSIT se une al dominio C-terminal de TRAF6 (dominio CC y dominio TRAF-C) y se confirma que participa en la señalización de NF-κB37. La expresión de citoquinas proinflamatorias disminuyó en las células ECSITKD THP-1. Sin embargo, después de la sobreexpresión de ECSIT en células ECSITKD THP-1, genes como IRF7, IL-1 y CD44 aumentaron significativamente37. PRDX1 se une al dominio del dedo anular de TRAF6 e inhibe la ubiquitinación de ECSIT y BECN1 en NF-κB y señales de autofagia al inhibir la formación de poliubiquitinación de TRAF638. En peces teleósteos, confirmamos que la vía de señalización NF-κB activada por ECSIT, interactuó con TRAF6 y TAK1 respectivamente y transmitimos la cadena de poliubiquitina producida por TRAF6. calpain2a se unió al dominio ZF, al dominio CC y al dominio TRAF-C de TRAF6, lo que inhibió la interacción de TRAF6-ECSIT. Confirmamos que la calpaina2a mutante que carecía de actividad hidrolasa impidió que la cadena de poliubiquitina pasara de TRAF6 a ECSIT y BECN1.

La figura 6 calpain2a atenúa la autoubiquitinación de TRAF6. Se transfectaron células HEK293 con TRAF6-Myc, TRAF6-HA o un vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y se analizaron IP con anticuerpo HA. b Las células HEK293 se transfectaron con TRAF6-Myc, TRAF6-HA, vector vacío o calpain2a-Flag. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y se analizaron IP con anticuerpo HA. c Se transfectaron células HEK293 con TRAF6-Myc, TRAF6-HA, vector vacío o diferentes concentraciones de calpaína2a-ΔCysPc-Flag. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y se analizaron IP con anticuerpo HA. d, e Las células HEK293 se cotransfectaron con TRAF6-Myc, TRAF6-HA y WT-ubiquitina-His o K63O-ubiquitina-His (en las que solo se mantiene la lisina 63) junto con calpaína2a-Flag. , calpain2a-ΔCysPc-Flag o vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y purificaron con agarosa Ni-NTA. Los inmunoprecipitados y el análisis de inmunotransferencia de entrada con Abs anti-Myc, anti-Flag, anti-HA y anti-Tubulin. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres experimentos independientes.

Fig. 7 calpain2a inhibe la ubiquitinación mediada por TRAF6-de ECSIT y BECN1. Se transfectaron células HEK293 con ECSIT-Myc, TRAF6-Flag o un vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y se analizaron IP con anticuerpo Flag. b Las células HEK293 se transfectaron con TAK1-Flag, ECSIT-Myc o un vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y se analizaron IP con anticuerpo Myc. c Se transfectaron células HEK293 con TRAF6-Myc, ECSIT-HA, vector vacío o diferentes concentraciones de calpaína2a-ΔCysPc-Flag. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y se analizaron IP con anticuerpo Myc. d Las células HEK293 se cotransfectaron con ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitina-His junto con calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag o un vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y purificaron con agarosa Ni-NTA. Las células HEK293 se transfectaron con BECN1-Flag, TRAF6-Myc o un vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y se analizaron IP con anticuerpo Myc. f Las células HEK293 se cotransfectaron con BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitina-His junto con calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag o un vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y purificaron con agarosa Ni-NTA. Los inmunoprecipitados y aportes con Abs anti-Myc, anti-Flag, anti-HA y anti-Tubulin. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres experimentos independientes.

Observamos que calpain2a tiene actividad hidrolasa como una de la familia de proteasas dependientes de calcio. La m-calpaína (calpaína-2) desempeña un papel regulador positivo en la vía de señalización NF-κB de las células hepáticas HepG2. Independientemente del enfoque del proteosoma 26 s, la calpaína2a hidroliza IkB para liberar el factor de transcripción NF-κB. El inhibidor específico de la proteína calpaína previene la degradación de IkB 56. Sin embargo, para la calpaína, existen pocos estudios sobre la respuesta inmune innata de los peces. En las células MKC, la sobreexpresión de calpaína2a inhibió las citoquinas proinflamatorias posteriores de NF-κB inducidas por LPS. Este fenómeno fue contrario a los resultados en las células hepáticas HepG2. Podría ser que la especificidad de especie de la familia de proteínas calpaína causara efectos diferentes. De manera similar, utilizamos el inhibidor específico de la proteína calpaína E-64 para evitar que calpaína2a hidrolice TRAF6. La calpaina2a mutante que carece de actividad hidrolasa inhibe la actividad de la ubiquitina ligasa TRAF6 sin afectar sus niveles de proteína. No encontramos sitios activos enzimáticos para calpaína2a. Según estudios previos en mamíferos, los tres sitios: son residuos de cisteína (C105A), histidina (H262A) y asparagina (N286A). Sin embargo, nuestros experimentos confirman que los tres sitios activos de la calpaína2a de corvina miiuy no afectan la expresión de los niveles de proteína TRAF6, pero la calpaína2a mutante que carece del dominio hidrolasa sí lo hace. Por lo tanto, optamos por mutar todo el dominio estructural activador de enzimas. Aunque la proteína calpaína2a está relativamente conservada en mamíferos y vertebrados inferiores, los sitios de actividad enzimática específicos merecen una mayor investigación.

planta cistanche que aumenta el sistema inmunológico

En resumen, identificamos calpaína2a como un regulador negativo de la señalización de NF-κB inducida por LPS y de la activación de IFN inducida por virus (Fig. 9e). En espectrometría de masas, calpain2a puede interactuar con TRAF6 y demostramos este fenómeno mediante un experimento de coinmunoprecipitación endógena. Descubrimos que calpain2a participa en la regulación de la vía de señalización de NF-κB inducida por LPS. Además, TRAF6 también desempeña un papel importante en las vías de señalización antiviral. Utilizamos SCRV y Ploy (I: C) para estimular la vía de señalización de IFN y descubrimos que calpaína2a también puede inhibir la señalización de IFN al regular el nivel de proteína y la autoubiquitinación de TRAF6. Ya que TLR3 puede reconocer la estructura del ARN bicatenario (ARNds) producida por infecciones virales. Estamos más interesados ​​en dilucidar la regulación de calpaína2a de la vía de señalización de IFN mediada por TRAF6-, pero no excluimos una posible relación entre la vía de señalización de calpaína2a y TLR3. calpain2a promovió la degradación de TRAF6 de manera hidrolítica e interactuó con TRAF6 para inhibir la formación de dímeros y la autoubiquitinación. Esta inhibición impidió la interacción de TRAF6 y ECSIT y el proceso de transferencia de ubiquitinación de TRAF6 a ECSIT, BECN1, IRF3 e IRF7. Nuestros resultados actuales contribuirán a la comprensión de los mecanismos de regulación negativa al apuntar a TRAF6 en las respuestas inmunes innatas. Además, esta investigación indica el papel clave de la homooligomerización y autoubiquitinación de TRAF6 en el proceso de la respuesta inmune innata de los peces. Al mismo tiempo, la calpaína2a se propone como una proteína con mecanismo regulador para inhibir la respuesta inmune de TRAF6 e impedir las vías de señales normales y ordenadas. Los conocimientos son útiles para comprender la inmunología de los vertebrados y la evolución del sistema inmunológico de los vertebrados.

Fig. 8 calpaína2a inhibe la activación de IFN inducida por SCRV o Poli(I:C). Las células ab EPC se transfectaron con diferentes concentraciones de calpain2a-Flag o vector vacío junto con los informadores IFN-1, ISRE e IRF3-pro luciferasa. A las 24 h después de la transfección, las células se infectaron de forma simulada o se infectaron con SCRV o Poly (I: C) durante 12 h (n=3 por grupo). Se utilizó análisis de transferencia Western para medir la expresión de calpain2a-Flag transfectada transitoriamente. La expresión de tubulina se utilizó como control de carga. c, d ARNm de Viperin, Mx1, ISG15 en MKC transducido de manera estable con si-calpain2a #1 o si-ctrl (vector de control) y tratado con solución salina (0) o desafiado con SCRV o Poly(I: C) para 24h. El nivel relativo de ARNm se normalizó con respecto a la expresión del gen que codifica la actina en cada muestra (n=3 por grupo). Las células e, f MKC se transfectaron con si-ctrl o si-calpain2a #1. A las 24 h después de la transfección, las células se estimularon con SCRV durante 24 h, luego se midieron el ensayo de viabilidad celular y el ensayo de proliferación celular (n=3 por grupo). Barra de escala, 100 μm. g Se transfectaron células MKC con calpain2a-Flag o pcDNA3.1 y luego se infectaron con SCRV durante 24 h (n=3 por grupo). El análisis qRT-PCR se realizó para la expresión de ARN SCRV intracelular y sobrenadante. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres experimentos independientes. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional (a, b), ANOVA bidireccional (c, d, e, f) o prueba t de Student de dos colas (g). *p < 0,05, **p < 0,01.

Métodos

Cultivo de células.

Las líneas celulares de riñón embrionario humano (HEK) 293 y las líneas celulares de Epitelioma papulosum cyprini (EPC) se adquirieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo y se mantuvieron en nuestro laboratorio. Se cultivaron líneas celulares de riñón de corvina Miiuy (M. miiuy) (MKC) y líneas celulares de intestino de corvina Miiuy (MIC) a partir de tejidos de riñón e intestino de corvina Miiuy57,58. Las líneas celulares de riñón de corvina Miiuy y las líneas celulares de intestino de corvina Miiuy se cultivaron a 26 grados en una incubadora humidificada que contenía 0.5% de CO2 en medio L-15 (HyClone, EE. UU.) suplementado con 15% de FBS (Gibco , EE. UU.), 100 U/ml de penicilina (Gibco, EE. UU.), 100 ug/ml de estreptomicina (Gibco, EE. UU.) y 20 U/ml de heparina (Solarbio, China). Se cultivaron células de epitelioma papulosum cyprini a 26 grados en una incubadora humidificada que contenía 5% de CO2 en medio 199 (Hyclone) suplementado con 10% de FBS, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/ml. Se cultivaron células 293 de riñón embrionario humano a 37 grados en una incubadora humidificada que contenía 5% de CO2 en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 mg. /ml de estreptomicina.

Fig. 9 calpain2a inhibe la ubiquitinación mediada por TRAF6-de IRF7 e IRF3. b Las células HEK293 se cotransfectaron con IRF3-Myc, TRAF6-HA y WTubiquitin-His o K63O-ubiquitin-His (en las que solo se conserva la lisina 63) junto con calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc. -Bandera o vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y purificaron con agarosa Ni-NTA. c, d Las células HEK293 se cotransfectaron con IRF7-Myc, TRAF6-HA y WT-ubiquitinaHis o K63O-ubiquitina-His (en las que solo se conserva la lisina 63) junto con calpaína2a-Flag, calpaína2a. -ΔCysPc-Flag o vector vacío. Después de 24 h después de la transfección, las células se lisaron y purificaron con agarosa Ni-NTA. Todos los inmunoprecipitados y aportes con Abs anti-Myc, anti-Flag, anti-HA y anti Tubulina. Todos los experimentos se realizaron en al menos tres experimentos independientes. e Modelo que detalla las funciones de calpain2a en las vías de señalización mediadas por TRAF6-. Tras LPS y virus, se podría activar TRAF6, homooligomerización y autoubiquitinación. BECN1, ECSIT, IRF7 e IRF3 están ubiquitinados por TRAF6 y desencadenan la activación de señales descendentes. calpain2a como regulador negativo apunta a TRAF6 para inhibir las vías de señalización mediadas por TRAF6-.

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