Efectos protectores del equinacósido en la nefropatía diabética

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Efectos protectores del equinacósido de la cistanche sobre la función renal, el tejido renal y el daño de las células mesangiales en ratas con nefropatía diabética

He Qin, Liu Fan, Wang Hongli, Li Jianping, Duan Jun (Departamento de Atención Médica de Cuadros, Distrito de Caotang, Academia de Ciencias Médicas de Sichuan, Hospital Popular Provincial de Sichuan, Chengdu, Sichuan)

Palabras llave: Cistanche; equinacósido;extracto de cistanche,nefropatía diabética; fibrosis intersticial renal; apoptosis; rata

Diabéticonefropatía(DN) es un comúndiabéticocomplicación microvascular, que no solo puede causar daño renal sino también afectar a otros órganos. La fibrosis tubulointersticial renal es la principal característica patológica en la clínica [1]. La patogenia denefropatía diabéticaes complicado. Estudios previos [2-3] creían que la enfermedad era causada principalmente por hiperglucemia endiabéticopacientes, lo que provocó cambios hemodinámicos renales y metabolismo anormal. Las manifestaciones clínicas fueron proteinuria y disminución del filtrado glomerular. Esperar. En la actualidad, los pacientes connefropatía diabéticatodavía carecen de métodos de tratamiento clínico efectivos y encontrar nuevos medicamentos efectivos es la clave para el tratamiento denefropatía diabética.

equinacósido(ECH) es uno de los extractos deCistanchetubulosa, que tiene el efecto de nutrir el riñón y fortalecer el yang [4]. La investigación farmacológica moderna [5] muestra queechinacósidodecistanchetiene efectos antioxidantes, antiapoptosis, antiinflamatorios y farmacológicos, como mejorar el flujo sanguíneo y la microcirculación.Echinacosidedecistanchetambién puede regular el metabolismo de la glucosa del cuerpo y mejorar la tolerancia a la glucosa. En los últimos años, estudios [6] han demostrado queechinacósidodecistanchepuede inhibir la fibrosis renal denefropatía diabéticaratas inhibiendo la vía de señalización del factor de crecimiento transformante (TGF- ) y protegiendo el tejido renal de rata. Sin embargo, existen pocos informes en la literatura sobre el tratamiento denefropatía diabéticaconCistancheechinacósidoy su mecanismo específico para protegernefropatía diabéticaen ratas aún no está claro. Por lo tanto, este estudio exploró más a fondo los efectos y los posibles mecanismos deechinacósidodeCistanchesobre la fibrosis renal y la apoptosis de las células del tejido renal ennefropatía diabéticaratas y tuvo como objetivo proporcionar una base teórica para la aplicación clínica deechinacósidodeCistanche.

equinacósido de Cistancheprotegernefropatía diabética

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1 Material y Métodos

1.1 Animales

60 ratas SD, macho, grado SPF, 8 semanas de edad, peso corporal 240-280 g, proporcionado por Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd., número de licencia de animales: SCXK (Beijing) 2015-0001, animales Número de certificado de calidad: 11400700106210, criado en el laboratorio del centro de animales del hospital, manteniendo la temperatura ambiente constante a 25 grados, simulando el día y la noche, cambiando las condiciones de luz una vez cada 12 horas y los animales pueden comer y beber libremente.

1.2 Medicamentos y reactivos

equinacósido, Instituto de Investigación de Control de Drogas y Alimentos de China, número de lote: 111670-201706; Losartan Potassium, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., Norma Nacional de Medicina: H20030654; estreptozotocina, American Sigma Company, número de lote: 040103; Kit de prueba de contenido de proteína en orina, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd. Science And Technology Co., Ltd., número de lote: 20170612; kit de detección TUNEL, Amictech Technology Co., Ltd., número de lote: 20180406; kit de extracción de ARN, kit de transcripción inversa, Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd., número de lote: 20180705, 20180904; Kit de detección de ácido hialurónico (HA) sérico, inhibidor de la metaloproteinasa tisular-1 (TIMP-1) ​​y laminina (Laminin, LN), Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., los números de lote son: 20180612, 20180624, 20180706; Molécula de adhesión de células vasculares 1 (molécula de adhesión de células vasculares- 1, VCAM- 1), factor de crecimiento transformante (factor de crecimiento transformante, TGF- ) y anticuerpos de actina de músculo liso (-SMA), Santa Cruz Company, EE. UU., números de lote: sc13160, sc130348, sc-324317; Enzima de peróxido de rábano picante (peroxidasa de rábano picante, HRP) marcada con IgG anti-conejo de cabra, empresa DAKO de Dinamarca, número de lote: P0447.

1.3 Modelo de aparato

7600 analizador bioquímico automático, empresa japonesa HITACHI; medidor de glucosa en sangre portátil, Beijing Yicheng Bioelectronics Technology Co., Ltd.; Microscopio óptico BX60, empresa japonesa OLYMPUS; analizador de radioinmunoensayo SN-695B, Shanghai Rihuan Instruments Shenbei Co., Ltd.; instrumento de PCR cuantitativa fluorescente IQTM5, American Bio-Rad Company; Instrumento de electroforesis DYY-6C, fábrica de instrumentos Liuyi de Beijing; Sistema de análisis de imágenes en gel AlphaImager HP, American Alpha Innotech Company.

1.4 Métodos de agrupación, replicación de modelos y administración

Se prealimentaron 60 ratas durante 1 semana y se dividieron aleatoriamente en grupo de control, grupo modelo,echinacósidogrupos de dosis alta, media y baja, y grupo de Losartán potásico, 10 ratas en cada grupo. El grupo modelo,echinacósidoy el grupo de losartán potásico fueron tratados con una dieta alta en grasas y azúcar combinada con dosis bajas de estreptozotocina para inducir un modelo de rata denefropatía diabética[6]. Antes de replicar el modelo, las ratas ayunaron con agua durante 12 h. Las ratas en el grupo de control fueron alimentadas con alimento ordinario, y los otros grupos fueron alimentados con alimento alto en grasas y azúcar. Después de 4 semanas de alimentación continua, las ratas del grupo de control recibieron una inyección intraperitoneal única de un volumen igual de tampón de citrato, y los grupos restantes recibieron una inyección intraperitoneal única de estreptozotocina Bacteriocina (40 mg·kg-1) para replicar el modelo de rata denefropatía diabética. 72 horas después de que se inyectó estreptozotocina a las ratas, la glucosa en sangre fue mayor o igual a 16,7 mmol·L-1, y la tasa de excreción de proteínas en orina de 24-horas después de 3 semanas fue mayor que la de las grupo de control, y la cuantificación de proteína en orina 24-hora fue superior al 50 por ciento antes de que se replicara el modelo, lo que indica que el modelo La copia fue exitosa. Cuatro semanas después de la inyección de estreptozotocina, la dosis baja, media y altaechinacósidogrupos recibieron 20 mg·kg-1, 50 mg·kg-1 y 100 mg·kg-1echinacósido( Disolver en solución salina normal a 37 grados de acuerdo con el estándar de 5 mL·kg-1 para el peso corporal de las ratas. A las ratas del grupo de losartán potásico se les administra por vía oral 16 mg·kg de losartán potásico-1 El grupo modelo y el grupo de control reciben el mismo volumen La solución salina normal se administró una vez al día durante 2 semanas.

1.5 Recogida de muestras

Después de la última administración, las ratas ayunaron sin comida ni agua, y se registró la cantidad de agua consumida por las ratas durante 24 horas, y se recogió la orina durante 24 horas. A primera hora de la mañana del segundo día, se pesaron las ratas. Después de recolectar la orina, inyección intraperitoneal de una solución de pentobarbital sódico al 2 por ciento, 2 mL·kg-1 para anestesia, separación de la sangre de la aorta abdominal de la rata, centrifugación (3 500 r·min-1, 15 min) y se recogió el suero. Guarde temporalmente en un refrigerador a -20 grados; separe el tejido de riñón de rata y divídalo en dos partes, una parte se fija en paraformaldehído al 4 por ciento, la otra parte se prepara como homogeneizado al 10 por ciento y se coloca en un refrigerador de -80 grados para su uso posterior.

1.6 Determinación del metabolismo de glucosa y lípidos en ratas

Tome suero de cada grupo de ratas, use un medidor de glucosa en sangre para medir la glucosa en sangre en ayunas y un analizador bioquímico automático para detectar niveles de triglicéridos éster, colesterol y lipoproteínas de baja densidad.

1.7 24 Se tomaron indicadores relacionados con la proteína en la orina, la función renal y la fibrosis renal.

En la orina de 24 h de cada grupo de ratas, se determinó el contenido de microproteínas en la orina de 24- h mediante radioinmunoensayo y la operación se llevó a cabo estrictamente según las instrucciones. Se recolectó el suero de cada grupo de ratas y se detectó el contenido de creatinina y nitrógeno ureico en sangre mediante un analizador bioquímico automático, el nivel sérico de TIMP-1 se detectó mediante ELISA, y los niveles de HA y LN se detectaron mediante radioinmunoensayo. La operación se llevó a cabo estrictamente por las instrucciones.

1.8 Tinción HE para observar los cambios patológicos del tejido renal y tinción TUNEL

Observe la apoptosis de las células del tejido renal. Tome los tejidos renales fijos de cada grupo, inclúyalos en parafina y seccionarlos. Una sección se utiliza para la tinción HE para observar los cambios morfológicos de los túbulos renales, los glomérulos y el intersticio renal bajo un microscopio óptico; la otra sección se usa para la tinción TUNEL, operando de acuerdo con las instrucciones del kit, y observando el número y la positividad de las células del tejido renal bajo el microscopio El número de células, la relación entre el número de células positivas y el número de células del tejido renal es calculado, que es la tasa de apoptosis.

2 resultados

1. Método Western Blot para determinar la expresión de proteínas VCAM-1, TGF- y -SMA en tejido renal

Tome aproximadamente 50 mg de homogeneizado de tejido de riñón de rata, disuélvalo con lisado celular que contenga inhibidores de proteasa y extraiga la proteína total con lisado celular, utilizando el método BCA para la cuantificación de proteínas. La muestra de proteína total extraída por 50 μmol·L-1 se transfirió a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se selló con leche descremada al 5 por ciento, y luego se agregaron el anticuerpo primario (1∶1000) y la proteína actina respectivamente. Anticuerpo monoclonal (1:300), incubar durante la noche a 4 grados. Finalmente, agregue el anticuerpo secundario e incube durante 2 horas a 37 grados y controle por electroquimioluminiscencia. Utilice el software de análisis de imágenes de Photoshop para analizar el valor gris de las bandas de proteínas.

2 Los resultados muestran el efecto del equinacósido sobre el metabolismo de la glucosa y los lípidos en ratas con nefropatía diabética.

En comparación con el grupo de control, la glucosa en sangre en ayunas de las ratas del grupo modelo aumentó significativamente y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). En comparación con el grupo modelo, la glucosa en sangre en ayunas de las ratas en los grupos de dosis media y alta deechinacósidoy el grupo de losartán potásico se redujo significativamente, y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" were="" reduced,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

3 Los efectos del equinacósido en 24- horas la proteína en orina y la función renal de ratas con nefropatía diabética.

En comparación con el grupo de control, los niveles de microalbúmina, nitrógeno ureico y creatinina en la orina del grupo modelo aumentaron significativamente y las diferencias fueron estadísticamente significativas (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">echinacósidoLos niveles de microalbúmina urinaria, nitrógeno ureico y creatinina de ratas en el grupo de potasio y losartán potásico se redujeron significativamente, y las diferencias fueron estadísticamente significativas (P<>

4 Los efectos del equinacósido sobre la fibrosis renal en ratas con nefropatía diabética.

En comparación con el grupo de control, los niveles séricos de HA, TIMP-1 y LN en el grupo modelo aumentaron significativamente y las diferencias fueron estadísticamente significativas (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1,="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

Tinción con 5 HE para observar los cambios patológicos del tejido renal en ratas con nefropatía diabética.

La estructura celular del tejido renal estaba completa y no se observaron cambios patológicos evidentes. La tinción HE de ratas en el grupo modelo y la dosis bajaechinacósidoEl grupo mostró: glomérulo hinchado y aumentado de volumen, células epiteliales tubulares renales hinchadas o desprendidas, intersticio renal acompañado de infiltración de células inflamatorias, y también eran visibles algo de hiperplasia mesangial y proliferación intersticial. Fibrosis. Tinción HE de ratas en dosis medias y altas deechinacósidoy el grupo de losartán potásico mostró que las lesiones del tejido renal se redujeron significativamente, con una pequeña cantidad de infiltración de células inflamatorias, la hiperplasia mesangial y la fibrosis intersticial también fueron más ligeras que el grupo modelo.

6 El efecto del equinacósido en la apoptosis del tejido renal en ratas con nefropatía diabética.

La tinción de TUNEL mostró que, en comparación con el grupo de control, la tasa de apoptosis de las ratas en el grupo modelo aumentó significativamente y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); la="" tasa="" de="" apoptosis="" de="" las="" ratas="" en="" el="" grupo="" de="" potasio="" bronceado="" se="" redujo="" significativamente="" y="" las="" diferencias="" fueron="" estadísticamente="" significativas=""><>

7 Los efectos del equinacósido en la expresión de genes relacionados con la apoptosis en tejidos renales de ratas con nefropatía diabética.

Los resultados de la RT-PCR mostraron que, en comparación con el grupo de control, la expresión de ARNm de Bax y Caspase-3 en el grupo modelo estaba significativamente regulada al alza, y la expresión de ARNm de Bcl-2 estaba significativamente regulada a la baja , y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">echinacósidoy el grupo de losartán potásico, y la expresión de ARNm de Bcl-2 se reguló significativamente, y las diferencias fueron estadísticamente significativas (P<>

8 Los efectos del equinacósido en la expresión de las proteínas VCAM-1, TGF- y -SMA en ratas con nefropatía diabética.

En comparación con el grupo de control, la expresión de las proteínas VCAM-1, TGF- y -SMA en el grupo modelo se reguló significativamente y la diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05); the="" expressions="" of="" vcam-1,="" tgf-β,="" and="" α-sma="" proteins="" in="" rats="" in="" the="" dose="" group="" and="" the="" losartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" down-regulated,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

3 Discusión

El comienzo denefropatía diabéticaestá oculto, y la patogenia es compleja y diversa. Una vez formado, es difícil de curar. Es una enfermedad crónica con gran daño y una causa importante de enfermedad renal terminal [8]. Pacientes connefropatía diabéticaa menudo se tratan con inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y antagonistas de los receptores de angiotensina, pero el efecto del tratamiento clínico no es muy satisfactorio [9]. El losartán potásico es un antagonista del receptor de la angiotensina Ⅱ, que se puede utilizar para tratar la hipertensión esencial. Algunos estudios [10-11] muestran que losartán potásico también puede inhibir el intersticio renal de ratas connefropatía diabéticaFibrosis, protege la función renal. Por lo tanto, este estudio eligió Losartán potásico como control positivo para comparar los efectos protectores deechinacósidoen el tejido renal de ratas connefropatía diabética.Los estudios clínicos [12-13] han demostrado que el contenido deechinacósidoen las cápsulas de Changui Yishen es de aproximadamente 3,104 mg · kg-1. Después de la conversión basada en la dosis de administración humana y de ratón, la dosis más baja de Cápsulas de Changui Yishen paranefropatía diabéticaratas es 0.648 g·kg-1, y la dosis convertida enechinacósidoes de aproximadamente 2 mg·kg-1. Dado que hay pocos informes clínicos sobre el tratamiento deechinacósidopara la diabetes o la nefropatía, este estudio elige 10 veces la dosis clínica más baja, es decir, 20 mg·kg-1 de equinacósido como dosis baja, y aumenta en secuencia. 50 mg·kg-1echinacósidoes una dosis media, y 100 mg·kg-1echinacósidoes una dosis alta.

El equinacósido de la cistanche trata la nefropatía diabética

En este estudio, dosis bajasechinacósidono tiene ningún efecto evidente sobre el tejido renal denefropatía diabéticaratas, mientras que dosis medias y altas deechinacósidopuede mejorar significativamente los cambios patológicos del tejido renal y mejorar el daño del tejido renal ennefropatía diabéticaratas , sugiriendo que dosis medias y altas deechinacósidopuede proteger el daño del tejido renal denefropatía diabéticaratas de una manera dependiente de la concentración, y se espera que se use en el tratamiento denefropatía diabética. En este estudio, dosis medias y altas deechinacósidopuede aumentar significativamente la masa corporal de las ratas connefropatía diabéticay reducir la ingesta de agua, la diuresis y la glucemia en ayunas. Los estudios clínicos [14] han demostrado que la insulina en pacientes connefropatía diabéticaestá en deficiencia absoluta o relativa, y los niveles de glucosa en sangre están elevados. La concentración excesiva de glucosa en sangre excederá la capacidad de reabsorción glomerular, se excreta con la orina, aumenta la frecuencia de la micción y aumenta el agua potable. La disminución de la masa corporal es consistente con los resultados de este estudio, lo que sugiere queechinacósidopuede aumentar la masa corporal denefropatía diabéticaratas al reducir el azúcar en la sangre y reducir su consumo de alcohol y orina.

En este estudio, dosis medias y altas deechinacósidopuede reducir significativamente la microalbúmina, la creatinina y el nitrógeno ureico en la orina en ratas connefropatía diabética. La creatinina y el nitrógeno ureico se excretan principalmente del cuerpo a través de la filtración glomerular, que puede reflejar con mayor precisión la función renal. Cuando la disfunción renal, la tasa de filtración glomerular disminuye, la concentración de creatinina en sangre y nitrógeno ureico aumentará significativamente [15]. El nivel de proteína en orina es uno de los indicadores más utilizados para reflejar el grado de daño glomerular, que puede dañar directamente las células mesangiales y también puede agravar el daño renal y la disfunción renal [16]. Investigación de Zhang Yun et al. [17] mostró que la hiperglucemia en ratas connefropatía diabéticapuede causar una disminución en la tasa de filtración glomerular, lo que lleva a un aumento en los niveles de creatinina en sangre, nitrógeno ureico y microalbúmina en orina. Los resultados de este estudio sugieren queechinacósidopuede reducir el azúcar en sangre, mejorar la función renal, reducir los niveles de creatinina en sangre, nitrógeno ureico y microalbúmina en orina, y mejorar el daño de las células del tejido renal.

En este estudio, dosis medias y altas deechinacósidopuede regular significativamente a la baja la expresión de ARNm de Bax y Caspase-3 ennefropatía diabéticaratas, regula al alza la expresión de ARNm de Bcl-2 e inhibe la apoptosis de las células del tejido renal. El gen Bax es un miembro proapoptótico de la familia Bcl-2. En condiciones fisiológicas, Bax y Bcl-2 forman un heterodímero que reduce la permeabilidad de la membrana celular y la liberación de citocromo C. Una vez que la expresión de Bcl-2 está regulada a la baja, provocará el aumento de la permeabilidad celular, la liberación de citocromo C, activará la cascada de caspasas aguas abajo e inducirá la apoptosis celular [18]. La caspasa-3 es una molécula ejecutiva de la apoptosis, que puede degradar una variedad de proteínas importantes en las células y participar en la apoptosis celular [19]. El estudio de Dong et al. [20] demostró queechinacósidopuede inhibir la apoptosis de una variedad de células, lo cual es consistente con los resultados de este estudio, lo que sugiere queechinacósidopuede inhibir la apoptosis de las células del tejido renal, protegiendo así el daño del tejido renal. En este estudio, dosis medias y altas deechinacósidopuede regular significativamente a la baja la expresión de la proteína VCAM-1 ennefropatía diabéticaratas VCAM-1 es una importante molécula de adhesión de células vasculares, que está estrechamente relacionada con la aparición y el desarrollo denefropatía diabéticay puede utilizarse para la evaluación clínica de pacientes connefropatía diabética[21]. El estudio de Zhang et al. [22] mostró que VCAM-1 puede inducir la apoptosis neuronal después de una hemorragia intracerebral en ratas. Los resultados de este estudio sugieren que dosis medias y altas deechinacósidopuede inhibir la expresión de VCAM-1 e inhibir la apoptosis de las células renales en ratas con nefropatía diabética.

En este estudio, dosis medias y altas deechinacósidopuede reducir significativamente los niveles de HA, TIMP-1 y LN en ratas connefropatía diabética.HA es el componente principal de la matriz extracelular, y LN es una glicoproteína estructural importante, que es un indicador clínico de uso común de fibrosis tisular [23]. TIMP-1 es un inhibidor de las metaloproteinasas de matriz (MMP), que puede inhibir la expresión de MMP, inhibir la degradación de la matriz extracelular y promover la fibrosis del tejido renal [24]. El estudio de Bieniaa et al. [25] demostraron que TIMP-1 puede inhibir la expresión de MMP, promover la expresión de HA y LN y promover la aparición y el desarrollo de fibrosis tisular renal. Esto es consistente con los resultados de este estudio, lo que sugiere queechinacósidopuede inhibir los niveles de HA, TIMP-1 y LN, inhibir la aparición y el desarrollo de fibrosis renal. En este estudio, dosis medias y altas deechinacósidopuede regular significativamente a la baja la expresión de las proteínas TGF- y -SMA ennefropatía diabéticaratas Un gran número de estudios [26-27] han demostrado que la vía de señalización TGF-/Smad juega un papel importante en la aparición y el desarrollo de la fibrosis intersticial renal. Cuando el TGF- se une a su receptor en la membrana celular, puede fosforilar Smad2 y Smad3, y el Smad activado forma un trímero, que se transfiere al núcleo para regular la expresión de moléculas efectoras aguas abajo como -SMA y metaloproteinasas de matriz. Inducir la producción de fibrosis intersticial renal [28]. -SMA es un signo de la transformación de fibroblastos en miofibroblastos, que pueden promover la secreción y el depósito de matriz extracelular y promover la aparición de fibrosis intersticial renal. La desventaja es que el tamaño de la muestra es pequeño, lo que puede causar ciertos errores estadísticos en los resultados, pero puede proporcionar cierta base teórica para la selección de dosis y la aplicación clínica deechinacósido.

referencias:

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