El lector de ARN M6 A YTHDF2 controla la inmunidad antitumoral y antiviral de las células NK, parte 6

Modelo de melanoma metastásico y desafío MCMV

Se inyectaron células B16F10 (105) por vía intravenosa en ratones. 14 días después de la inyección, los ratones fueron sacrificados para el análisis post mortem. Los nódulos metastásicos en el pulmón se analizaron macroscópicamente y se contaron. La línea celular B16F10 fue proporcionada por Hua Yu (City of Hope, Los Ángeles, CA). Los ratones Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT se infectaron con una inyección ip de la cepa Smith MCMV (2,5 × 104 PFU), que se adquirió de la American Type Culture Collection (VR-1399). Se obtuvieron muestras de sangre periférica mediante punción submandibular los días 0, 4 y 7 después de la infección.

Los nódulos de metástasis pulmonares se refieren a nódulos formados por células tumorales malignas de otros sitios que migran a los pulmones a través de la sangre o el sistema linfático. Para muchos pacientes, esta es una manifestación común del cáncer de pulmón.

Sin embargo, aunque los nódulos de metástasis pulmonares suponen una amenaza para la salud física de los pacientes, no existe una relación directa entre ellos y la memoria. Por lo tanto, debemos afrontar activamente los desafíos del cáncer de pulmón y los nódulos de metástasis pulmonares, y no permitir que las emociones negativas y la ansiedad afecten nuestra salud física y mental.

Al mismo tiempo, podemos mantener y mejorar la memoria mediante algunos métodos positivos. Por ejemplo, realizar algún entrenamiento de la memoria, como cálculos matemáticos, leer, escuchar música, jugar, etc. Además, seguir buenos hábitos de vida, como hacer ejercicio regularmente, dormir lo suficiente, comer de forma saludable, etc., también puede mejorar nuestra memoria.

Lo más importante es mantener una actitud positiva. No importa las dificultades que enfrentes, debes creer en tu fuerza y ​​la flexibilidad de tu sistema nervioso y, a través de ajustes y respuestas positivas, eventualmente superarás las dificultades con éxito.

En definitiva, aunque los nódulos metastásicos en los pulmones suponen una amenaza para la salud física, no están directamente relacionados con la memoria. Debemos afrontarlo positivamente y mantener y mejorar nuestra memoria ajustando nuestro estilo de vida y manteniendo una buena actitud. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche deserticola también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche deserticola también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Para medir las cargas virales en la sangre periférica, el bazo y el hígado, se aisló el ADN utilizando un kit de sangre y tejidos QIAGEN DNeasy para el análisis de qPCR. Se utilizaron los siguientes cebadores: MCMV-IE1,59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (adelante) y MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (inverso).

Tratamiento in vivo en ratones con IL-15

Para el tratamiento in vivo de ratones con IL-15, a los ratones Ythdf2ΔNK y Ythdf2WT se les inyectaron 2 µg ip de IL-15 humana recombinante (n.º de catálogo 745101; Instituto Nacional del Cáncer) durante 5 días. Luego se sacrificaron los ratones tratados y de control para un análisis de citometría de flujo.

Citometría de flujo

Se prepararon suspensiones unicelulares a partir de MO, sangre, bazo, hígado y pulmón de ratones Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT como se describió anteriormente (Wang et al., 2018b). El análisis de citometría de flujo y la clasificación de células se realizaron en un citómetro de flujo LSRFortessa X-20 y un citómetro de flujo FACSAriaFusion (BD Biosciences), respectivamente.

Los datos se analizaron utilizando el software NovoExpress (Agilent Technologies).

Se utilizaron los siguientes anticuerpos marcados con tinte fluorescente de BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen o Cell Signaling Technology: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7),CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46 }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), granzima B (QA16A02), perforina (S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), anexina V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) y Eomes (WD1928), fosfo-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), fosfo-Akt (Ser473, #5315), proteína ribosómica fosfo-S6 , fosfo-Stat3 (Tyr705, n.° 9145) y fosfo-Stat5 (Tyr694, n.° 9539).

Para la evaluación de la proliferación de células NK, las células se marcaron con CTV 5 µM (Invitrogen) según el protocolo del fabricante antes de transferirlas a ratones receptores. La tinción intracelular de Ki67, Tbet y Eomes se realizó fijando y permeabilizando con el kit de tinción Foxp3/factor de transcripción (eBioscience).

Para la detección de proteínas fosforiladas, las células NK esplénicas purificadas se trataron previamente con IL-15 humana recombinante (50 ng/ml) durante 1 h y luego se fijaron con Phosflow Fix Buffer I, seguido de permeabilización con Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) y tinción con anticuerpos.

Transferencia de células adoptivas

Para evaluar el efecto de la deficiencia de Ythdf2 en la maduración de las células NK, se cotransfirió una mezcla de 5 × 106 células BM en una proporción de 1:1 de ratones CD45.1 o Ythdf2ΔNK CD45.2 a ratones Rag2-/-Il2rg-/-. La reconstitución de los receptores se evaluó mediante citometría de flujo 8 semanas después del trasplante.

Para experimentos de proliferación homeostática inducida por linfopenia, se cotransfirieron números iguales de células NK esplénicas purificadas de ratones CD45.1 o Ythdf2ΔNK CD45.2 a ratones Rag2-/-Il2rg-/- seguido de una evaluación de los porcentajes relativos de células NK WT e Ythdf2ΔNK transferidas en los bazos. de receptores Rag2-/-Il2rg-/- mediante citometría de flujo en los momentos indicados.

Para el modelo de melanoma metastásico, se inyectaron iv 106 células NK expandidas con IL-2 de ratones Ythdf2ΔNK o Ythdf2WT en ratones Rag2-/-Il2rg-/-. 1 día después, se inyectaron células B16F10 (105) por vía intravenosa en ratones. 14 días después de la inyección, los ratones fueron sacrificados para el análisis post mortem. En algunos experimentos, las células se marcaron con CTV (5 µM, Invitrogen) para rastrear la proliferación celular antes de la transferencia.

Ensayo de tráfico in vivo.

Para detectar el tráfico de células NK desde la MO a la sangre periférica, se inyectó 1 µg iv de anticuerpo anti-CD45 marcado con APC en ratones C57BL/6. Dos minutos después de la inyección de anticuerpo, los ratones fueron sacrificados inmediatamente y las células de MO se recogieron para citometría de flujo después de que las células se tiñeron con anticuerpos CD3 y NK1.1. Las células NK parenquimatosas se identificaron por la falta de tinción con CD45, mientras que las células NK sinusoidales se identificaron por la presencia de marcaje con CD45. Por lo tanto, la proporción de células NK en los sinusoides (CD 45+) con respecto a las regiones parenquimatosas (CD45-) indica el tráfico de células NK desde la MO a la sangre periférica en un estado estacionario.

RT-qPCR en tiempo real e inmunotransferencia

El ARN se aisló usando un RNeasy Mini Kit (QIAGEN) y luego se transcribió de manera inversa a ADNc con el kit de reactivos PrimeScript RT con gDNA Eraser (Takara Bio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión de ARNm se analizaron utilizando SYBRGreen PCR Master Mix y un sistema QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR (ambos de Thermo Fisher Scientific). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla S1.

La inmunotransferencia se realizó de acuerdo con procedimientos estándar, como se describió anteriormente (Denget al., 2015; Yu et al., 2006). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: METTL3 (n.º de cat. 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (n.º de cat.26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (n.º de cat. 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (n.º de cat. RN123PW; MBL), YTHDF3 (n.º de cat.25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (n.º de cat. ab195377; Abcam),FTO (n.º de cat. ab124892; Abcam), MDM2 (n.º de cat. 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (n.º de cat. PA5-29949; Invitrogen) y -actin (n.º de cat. {{20 }}Ig; Proteintech).

ensayo de eliminación de ARNip

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90% medido por citometría de flujo. La eficiencia de eliminación genética se determinó mediante qPCR e inmunotransferencia. 3 días después de la transfección, la apoptosis celular y la proliferación se analizaron mediante citometría de flujo como se describió anteriormente.

Ensayo informador de luciferasa

La región promotora Ythdf2 que va desde –2,000 pb a +100 bp del TSS se amplificó a partir de células NK murinas y se clonó en apGL4-Vector indicador de luciferasa básica (Promega) para generar apGL{ {5}}Plásmido informador Ythdf2. Las células HEK293T adquiridas en ATCC se cotransfectaron con los plásmidos indicadores pGL4-Ythdf2, así como con plásmidos de sobreexpresión STAT5a o STAT5b o un vector vacío, junto con un plásmido indicador pRL-TK Renilla (Promega) para la normalización de la eficiencia de la transfección. Las células se recogieron para su lisis 24 h después de la transfección y la actividad de la luciferasa se cuantificó fluorimétricamente con el Dual-Luciferase System (Promega). Las secuencias de cebador para clonar el promotor Ythdf2 y los plásmidos de sobreexpresión STAT5a y STAT5b se enumeran en la Tabla S1.

Ensayos de chip

Los ensayos de ChIP se realizaron utilizando un kit Pierce Magnetic ChIP (n.º de catálogo 26157; Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se usó por separado una cantidad igual de ananti-anti-fosfo-Stat5 (Tyr694, cat. No. 9351; Cell Signaling Technologies) o IgG de conejo normal de control correspondiente para precipitar los complejos ADN-proteína reticulados derivados de 5 x 106 células NK primarias de ratón purificadas que se trataron previamente con IL-15 (50 ng/ml) durante 1 h. Tras la inversión de la reticulación, el ADN inmunoprecipitado por el anticuerpo indicado se analizó mediante qPCR. Las secuencias de todos los cebadores se enumeran en la Tabla S1.

Ensayo de citotoxicidad ex vivo.

La citotoxicidad ex vivo de las células NK se evaluó mediante ensayos estándar de liberación de 51Cr. Las líneas celulares de linfoma de ratón RMA-S (MHC clase Ideficiente) y RMA (MHC clase I suficiente), un obsequio de André'Veillette (Universidad McGill, Montreal, Canadá), se utilizaron como células objetivo. Los ratones se trataron con inyección ip de ácido poliinosínico:policitidílico [poli (I:C); 200 µg/ratones] durante 18 h. Las células NK activadas con poli (I: C) se aislaron del bazo utilizando el kit de aislamiento de células NK EasySepMouse (STEMCELL Technologies). Las células NK purificadas se cocultivaron con células diana en una proporción de 5:1, 2,5:1 y 1,25:1 en presencia de IL-2 (50 U/ml).

m6A-sec

Las células NK esplénicas purificadas se expandieron mediante IL-2 (1,000 U/ml, nº de catálogo Bulk Ro 23-6019; Instituto Nacional del Cáncer) in vitro durante 7 días. El ARN total se aisló mediante el reactivo TRIzol (Thermo FisherScientific) de 50 millones de células NK expandidas con IL-2. El ARN poliadenilado se enriqueció aún más a partir del ARN total utilizando el kit de purificación de ARNm Dynabeads (Invitrogen). Las muestras de ARNm se fragmentaron en 100-fragmentos de nt de longitud con reactivos de fragmentación de ARN (Invitrogen).

Se usó ARNm fragmentado (5 µg de ARN) para la inmunoprecipitación de m6A utilizando un anticuerpo m6A (202003; Synaptic) siguiendo el protocolo estándar del kit Magna MeRIP m6A (Merck Millipore). El ARN se enriqueció mediante RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) para la generación de bibliotecas con un kit KAPA RNA HyperPrep (Roche). La secuenciación se realizó en las instalaciones de genómica de City of Hope en una máquina Illumina HiSeq 2500 con modo de lectura única 50-pb. Las lecturas de secuenciación se asignaron al genoma del ratón utilizando el software HISAT2 v101 (Kim et al., 2015).

Se proporcionaron lecturas mapeadas de inmunoprecipitación y bibliotecas de entrada utilizando el paquete R exomePeak (Meng et al., 2014). Los m6Apeaks se visualizaron utilizando el software Integrative Genomics Viewer (http://www.igv.org). El motivo de unión a m6A fue analizado por MEME (https://meme-suite.org) y HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer/motif). Los picos llamados se anotaron mediante intersección con la arquitectura genética utilizando Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015).

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2(cambio doble)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

Se recogieron 50 millones de células NK expandidas con IL-2 y se lavaron dos veces con PBS frío, y el sedimento celular se lisó con 2 volúmenes de tampón de lisis (Hepes 10 mM, pH 7,6, 150 KCl mM, EDTA 2 mM, NP-40 al 0,5 %, ditiotreitol 0,5 mM, cóctel de inhibidor de proteasa 1:100 [Thermo Fisher Scientific] e inhibidor de ARNasa SUPERasa-In 400 U/ml [Thermo Fisher Scientific]).

El lisado se incubó en hielo durante 5 minutos y se centrifugó durante 15 minutos para aclarar el lisado. Se guardó como entrada una décima parte del volumen de lisado celular. El resto del lisado celular se incubó con 5 µg de anti-YTHDF2 (n.º de catálogo RN123PW; MBL) que se acopló con perlas magnéticas de proteína A (n.º de catálogo 10001D; Invitrogen). a 4 grados durante 2 h con rotación suave. Posteriormente, las perlas se lavaron cinco veces con 1 ml de tampón de lavado enfriado con hielo (HEPES 50 mM, pH 7,6, NaCl 200 mM, EDTA 2 mM, NP-40 al 0,05 %, ditiotreitol 0,5 mM y RNasa 200 U/ml). inhibidor).

Las muestras inmunoprecipitadas se sometieron a digestión con proteinasa K en tampón de lavado suplementado con SDS al 1 % y 2 mg/ml de proteinasa K (ThermoFisher Scientific) incubadas con agitación a 1200 rpm a 55 grados durante 1 h. El ARN total se extrajo del ARN de entrada y del ARN inmunoprecipitado añadiendo 5 volúmenes de reactivo TRIzol seguido de Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research).

La biblioteca de ADNc se generó con un kit KAPA RNA HyperPrep (Roche) y se secuenció en una plataforma Illumina HiSeq 2500. Los resultados máximos de llamadas con inmunoprecipitación y bibliotecas de entrada fueron generados por el paquete R RIPSeeker (Li et al., 2013). HOMER se usó para encontrar motivos de la distribución de datos en regiones de picos. Los picos llamados se anotaron mediante intersección con la arquitectura de genes y transcripciones usando ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010).

ensayo de estabilidad de ARNm

Se cultivaron células NK esplénicas purificadas de ratones Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT con IL-15 (50 ng/ml). 3 días después del cultivo, las células se trataron con actinomicina D (5 µg/ml, nº de catálogo A9415; Sigma) durante el tiempo indicado. Las células sin tratamiento se utilizaron a las 0 h. Las células se recogieron en el momento indicado y se extrajo el ARN total de las células para qPCR. La vida media del ARNm se calculó utilizando el método descrito previamente por Weng et al. (2018). Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla S1.

Análisis de bases de datos en línea.

Utilizamos el recurso en línea BioGPS (http://biogps.org) para analizar la expresión específica de tejido de Ythdf2. Los conjuntos de datos de secuencia de ARN eran de GEO con los números de acceso. GSE106138, GSE113214 y GSE25672. Se exportaron datos normalizados de los análisis de RNA-seq y la puntuación z de expresión génica se visualizó con la función Heatmap.2 dentro de gplots Rlibrary.

Estadísticas

Las pruebas t de Student no apareadas (de dos colas) se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Se realizó ANOVA de una o dos vías cuando se compararon tres o más grupos independientes. Los valores de p se ajustaron para comparaciones múltiples mediante el procedimiento de Holm-Sˇ´ıdak. P < 0.05 se consideró significativo. *, P < {{10}}.05; **, P < 0,01; y ***, P < 0,001.

Material complementario en línea

La figura S1 muestra los niveles de proteína de YTHDF2 en células inmunitarias, incluidas las células NK en respuesta a la estimulación de IL-15, la infección por MCMV y la progresión tumoral; la generación de ratones con deleción específica de Ythdf2 en células NK. La figura S2 muestra los títulos virales en el bazo y el hígado de ratones infectados con MCMV y el porcentaje y el número absoluto de células NK Ly49H+ y/o Ly49D+ en ratones infectados con MCMV. La figura S3 muestra la proliferación, supervivencia, maduración y expresión de receptores activadores e inhibidores de células NK de ratones Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK. La figura S4 muestra la regulación de la expresión de YTHDF2 mediante la señalización IL-15-STAT5 y la expresión de los componentes de los receptores IL-15, la vía PI3K-AKT y la vía MEK-ERK en células NK de Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK. ratones. La figura S5 muestra los ensayos de RNA-seq, m6A-seq y RIP-seq de todo el transcriptoma en células NK. La Tabla S1 enumera los cebadores utilizados en el estudio.

Disponibilidad de datos

Los datos de RNA-seq, m6A-seq y RIP-seq se depositaron en el Centro Nacional de Información Biotecnológica GEO con el número de acceso. GSE174027. Los datos restantes que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a pedido de los autores correspondientes.

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 y CA210087), la Sociedad de Leucemia y Linfoma (1364-19), el Instituto de Medicina Regenerativa de California (DISC2COVID{{ 9}}), y el Premio al Proyecto Excepcional 2021 de Breast Cancer Alliance. Este trabajo también fue apoyado parcialmente por un premio del USDA (USDA/NIFA 2020-67017-30843).

Contribuciones de los autores: S. Ma, J. Yu y MA Caligiuri concibieron y diseñaron el proyecto. S. Ma, J. Yan, J. Zhang y J. Yu realizó experimentos y/o análisis de datos. Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun y J. Chen contribuyeron con reactivos y material de apoyo. S. Ma, J. Yu, J. Chen y MA Caligiuri escribieron, revisaron y/o revisaron el artículo. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Divulgaciones: J. Chen informó "otros" de Genovel BiotechCorp. fuera del trabajo presentado y es fundador científico de Genovel Biotech Corp. y asesor científico de oncología racial. No se informaron otras divulgaciones.

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