Efecto terapéutico del cistanósido A sobre el metabolismo óseo de ratones ovariectomizados

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Resumen

El cistanósido A (Cis A), es un glucósido feniletanoide activo aislado deCistanche deserticola YC Maha llamado nuestra atención debido a su posible papel en el tratamiento deosteoporosis. En el presente estudio, evaluamos los efectos de Cis A en un modelo de ratones ovariectomizados (OVX) e investigamos sus mecanismos de acción moleculares subyacentes. Después de 12 semanas de intervención administrada por vía oral, Cis A (20, 40 y 80 mg/kg de peso corporal/día) mostró efectos antiosteoporóticos significativos en ratones OVX, evidenciados por una mayor resistencia ósea, densidad mineral ósea y microarquitectura ósea trabecular mejorada. Mientras tanto, las actividades de los marcadores de resorción ósea, incluida la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP), la desoxipiridinolina (DPD) y la catepsina K, se redujeron y la bioactividad del marcador de formación ósea fosfatasa alcalina (ALP) aumentó. Mecánicamente, Cis A inhibió la expresión del factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6), una molécula aguas arriba que es compartida tanto por el potenciador de la cadena ligera kappa del factor nuclear de las células B activadas (NF-κB) como por la fosfatidilinositol 3-quinasa ( PI3K)/Akt y posteriormente suprimió los niveles de los activadores del receptor del ligando del factor nuclear kappaB (RANKL), reguló a la baja la expresión de NF-κB y reguló al alza la osteoprotegerina (OPG), PI3K y Akt, lo que significa que Cis A poseía actividad antiosteoporótica en ratones ovariectomizados a través de la inactivación de NF-kappaB mediada por TRAF6-y la activación de PI3K/Akt. En conjunto, presentamos nuevos hallazgos de que Cis A, al regular a la baja TRAF6, coordina la inhibición de NF-κB y la estimulación de las vías PI3K/Akt para promover la formación ósea y prevenir la resorción ósea. Estos datos demostraron el potencial de Cis A como un agente prometedor para el tratamiento deosteoporosisenfermedad.

Palabras clave: citanósido A; ratones ovariectomizados; antiosteoporótico; TRAF6; RANGO

Introducción

Osteoporosis, un "asesino silencioso" esquelético sistémico, se ha convertido en un importante peligro para la salud que afecta a más de 2000 millones de personas en todo el mundo en los últimos años [1]. Se caracteriza por una baja densidad de masa ósea (DMO) y deterioro de la microarquitectura, que derivan de un exceso de reabsorción ósea sobre la formación ósea y, finalmente, resultan en una fractura osteoporótica [2,3]. Hoy en día, la identificación de agentes para bloquear la diferenciación y reabsorción osteoclástica son las estrategias comunes y exitosas para el desarrollo de fármacos terapéuticos paraosteoporosis[4], y de hecho hay muchos agentes sintéticos, incluidos el valerato de estradiol y el alendronato de sodio, que podrían prevenir y tratarosteoporosis. Sin embargo, los medicamentos para las enfermedades están lejos de ser ideales; algunos de estos fármacos podrían aumentar el riesgo de cáncer de endometrio y de mama y también tener un grado de efectos secundarios, como hipercalcemia, hipercalciuria, etc. [5], que limitan sus aplicaciones clínicas. Por lo tanto, durante más de un milenio, las medicinas tradicionales chinas (MTC), especialmente la MTC comestible con los compuestos y fracciones bioactivos aislados, se han utilizado ampliamente de forma segura y eficaz en los países asiáticos para prevenir y tratar diversas enfermedades, entre ellasosteoporosis[6,7].

Osteoporosisse caracteriza por una mayor resorción ósea debido al aumento de la osteoclastogénesis, y este proceso implica el compromiso de los monocitos hematopoyéticos en precursores de osteoclastos, que se fusionan para formar osteoclastos multinucleados que se dirigen a los sitios óseos que se someten a remodelación [4]. El activador del receptor del ligando del factor nuclear κB (RANKL), un factor clave secretado por los osteoblastos, estimula la diferenciación de los monocitos en osteoclastos [8,9]. La interacción de RANKL con su receptor RANK da como resultado una cascada de eventos intracelulares, que incluyen NF-κB, PI3K/Akt, cinasa dependiente de calcio/calmodulina al reclutar el factor asociado al receptor TNF de la proteína de señal adaptadora (TRAF6). Como resultado, varios genes marcadores relacionados con los osteoclastos, incluidos TRAP, catepsina K y DPD, se regulan positivamente y se acelera el proceso de reabsorción ósea.

Los glucósidos feniletanoides se caracterizan por fracciones de ácido cinámico e hidroxifeniletilo que se unen a una -glucopiranosa (apiosa, galactosa, ramnosa, xilosa, etc.) a través de un enlace glucosídico, que se distribuyen ampliamente en las plantas medicinales [10]. El cistanósido A (Cis A) es un glucósido feniletanoide activo enCistanche deserticola YC Ma. Según el registro de la farmacopea china, C. deserticola se usaba tradicionalmente para tratar la deficiencia de yin renal, la debilidad muscular, la debilidad lumbar, etc., y los glucósidos feniletanoides son los principales componentes bioactivos de esta hierba [11]. Según la teoría del "riñón" de la MTC, el riñón podría gobernar el sistema óseo, lo que significa que el desarrollo y las funciones de los huesos dependen de la esencia del riñón, y esta esencia del riñón puede transformarse en la médula ósea para nutrir los huesos. promover el crecimiento y la reparación del esqueleto y fortalecer el esqueleto [12]. Como C. deserticola podría fortalecer el riñón, supusimos que Cis A podría prevenir y tratarosteoporosis. Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para validar el potencial de Cis A en la prevenciónosteoporosismediante el uso de un modelo de ratones ovariectomizados, se determinaron los marcadores de formación y resorción ósea, así como los posibles mecanismos relacionados, para estimar la bioactividad antiosteoporótica de este agente.

Resultados

Efectos de Cis A en la prueba de flexión de tres puntos del hueso

Para analizar si el tratamiento con Cis A fortalece el hueso, sometimos fémures a la prueba de flexión de tres puntos. Como se muestra en la Figura 1, la carga máxima aplicada cuando el hueso se rompe fue del 21,5 por ciento y del 22,0 por ciento más alta en los animales tratados con 20 mg/kg y 80 mg/ kg Cis A, respectivamente, en comparación con los animales del grupo ovariectomizado (OVX) (p < 0.05).="" mientras="" tanto,="" el="" tratamiento="" con="" cis="" a="" también="" mejoró="" la="" rigidez="" ósea;="" todos="" los="" ratones="" tratados="" con="" cis="" a="" mostraron="" un="" aumento="" significativo="" de="" la="" rigidez="" con="" datos="" de="" 121.0="" ±="" 12,1="" (p="">< 0,05),="" 124,1="" ±="" 16,2="" (p="">< 0,05)="" y="" 127,7="" ±="" 9,6="" (p="">< 0,01),="" respectivamente="" ,="" en="" comparación="" con="" 102,2="" ±="" 10,7="" de="" los="" ratones="" ovx.="" los="" resultados="" indican="" que="" el="" aumento="" de="" la="" resistencia="" ósea="" en="" los="" ratones="" ovx="" tratados="" con="" cis="" a="" se="" debió="" a="" una="" mayor="" cantidad="" de="" hueso="" y="" una="" mejora="" de="" la="" calidad="">

Efectos de Cis A en la microarquitectura ósea

La microarquitectura tridimensional del hueso trabecular de ratones medida por micro-CT (Figura 2 y Tabla 1) muestra intuitivamente que los ratones del grupo OVX presentaron una reducción notable en el área trabecular y el número trabecular en comparación con el grupo simulado, lo que indica que la ovariectomía podría inducir una disminución notable en la densidad de masa ósea (BMD, −46 por ciento), contenido mineral óseo (BMC, −66 por ciento), contenido mineral tisular (TMC, −85 por ciento), fracción de volumen óseo (BVF, −82 por ciento), número trabecular (Tb. N, −76 por ciento) y un aumento en la separación trabecular (Tb. Sp, más 80 por ciento) sin ninguna modificación en la densidad mineral tisular total (TMD) y el espesor trabecular (Tb. Th) después de la operación de 12 semanas.

Sin embargo, los ratones OVX tratados con Cis A dieron como resultado un aumento dependiente de la dosis de DMO (más 43 por ciento ~57 por ciento), BMC (más 65 por ciento ~73 por ciento), TMC (más 83 por ciento ~90 por ciento), BVF (más 80 por ciento ~88 por ciento), mayor reducción en Tb. Sp (-79 por ciento ~88 por ciento) y Tb mejorada aún más. N (más 73 por ciento ~82 por ciento) en comparación con el grupo OVX. La DTM no pareció estar influenciada por la ovariectomía, pero aumentó significativamente con el tratamiento con valerato de estradiol (EV).

Efectos de Cis A tanto en la formación ósea como en los marcadores de reabsorción

Los efectos de Cis A en los marcadores de resorción ósea, incluidos TRAP, DPD, catepsina K y el índice de formación ósea ALP y la proteína Gla ósea (BGP), se muestran en la Figura 3. Después de 12 semanas de la operación de ovariectomía, las actividades de TRAP, DPD , y la catepsina K en el grupo OVX aumentaron significativamente, especialmente DPD, que aumentó en casi un 55,6 por ciento; TRAP y la catepsina K mejoraron en un 43,5 % y un 38,1 %, respectivamente, en comparación con el grupo simulado. Cis A, administrado por vía oral durante 12 semanas, demostró un notable potencial en la prevención de todos los marcadores de resorción ósea mencionados anteriormente, especialmente la dosis alta (80 mg/kg) que mostró un efecto significativo en la supresión de las actividades de DPD en 45.0 por ciento, TRAP en 49.0 por ciento y catepsina K en 44.0 por ciento, respectivamente (p < 0.01),="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" ovx="" (figura="" 3).="" aunque="" se="" demostró="" una="" tendencia="" creciente="" de="" las="" actividades="" de="" alp="" y="" bgp="" en="" el="" grupo="" ovx,="" no="" se="" observaron="" cambios="" estadísticamente="" significativos.="" sin="" embargo,="" se="" observó="" una="" mejora="" significativa="" de="" la="" actividad="" de="" alp="" en="" los="" grupos="" tratados="" con="" cis="" a="" bajo="" y="" alto="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" simulado="" (p=""><>

Efectos de Cis A en los niveles de expresión de proteínas de TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG y RANKL

El análisis de transferencia Western reveló que, en comparación con el grupo simulado, los niveles de proteína de TRAF6, NF-κB y RANKL en el grupo OVX aumentaron significativamente (p < 0.05),="" mientras="" que="" opg,="" pi3k="" y="" akt="" se="" redujeron="" significativamente="" (figura="" 4).="" cis="" a="" (20="" mg/kg="" o="" 80="" mg/kg)="" disminuyó="" significativamente="" la="" expresión="" de="" traf6="" (p="">< 0.05),="" seguida="" de="" la="" expresión="" de="" rankl="" siendo="" disminuyó="" y="" opg="" aumentó,="" lo="" que="" significa="" que="" la="" relación="" opg/rankl="" se="" reguló="" al="" alza.="" en="" consecuencia,="" las="" cascadas="" de="" señalización="" de="" nf-κb="" se="" regularon="" a="" la="" baja="" y="" pi3k/akt="" se="" regularon="" al="" alza="" mediante="" el="" tratamiento="" con="" cis="" a="" (p="">< 0,05).="" moléculas="" 2017,="" 22,="" 197="" 5="" de="" 11="" 2.1.4.="" efectos="" de="" cis="" a="" en="" los="" niveles="" de="" expresión="" de="" proteínas="" de="" traf6,="" nf-κb="" pi3k,="" akt,="" opg="" y="" rankl="" el="" análisis="" de="" transferencia="" western="" reveló="" que,="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" simulado,="" los="" niveles="" de="" proteínas="" de="" traf6,="" nf-κb="" y="" rankl="" en="" el="" grupo="" ovx="" fueron="" aumentó="" significativamente="" (p="">< 0,05),="" mientras="" que="" opg,="" pi3k="" y="" akt="" disminuyeron="" significativamente="" (figura="" 4).="" cis="" a="" (20="" mg/kg="" o="" 80="" mg/kg)="" redujo="" significativamente="" la="" expresión="" de="" traf6="" (p="">< 0,05),="" seguido="" de="" una="" disminución="" de="" la="" expresión="" de="" rankl="" y="" un="" aumento="" de="" opg,="" lo="" que="" significa="" que="" la="" relación="" opg/rankl="" aumentó.="" en="" consecuencia,="" las="" cascadas="" de="" señalización="" de="" nf-κb="" estaban="" reguladas="" a="" la="" baja="" y="" las="" de="" pi3k/akt="" estaban="" reguladas="" al="" alza="" por="" el="" tratamiento="" con="" cis="" a="" (p=""><>

Discusión

Dadas las limitaciones de las opciones terapéuticas actuales paraosteoporosisenfermedad, existe la necesidad de alternativas a partir de alimentos o plantas medicinales comestibles naturales. Como parte de nuestro esfuerzo continuo por descubrir agentes antiosteoporóticos efectivos de la MTC, encontramos una serie de extractos, fracciones y compuestos que poseen el efecto de las propiedades antiosteoporóticas [13,14].Cistanche deserticaes un importante TCM clásico, que se encontró que posee un perfil de seguridad favorable [15] y amplias funciones medicinales para el tratamiento de la deficiencia renal, etc. [16]. De acuerdo con la teoría de la medicina tradicional china, la medicina tradicional china que posee el efecto de vigorizar los riñones generalmente se usaba para tratarosteoporosis; Los glucósidos feniletanoides son los principales constituyentes bioactivos de esta hierba, lo que implica que los glucósidos feniletanoides contenidos en C. deserticola pueden poseer una propiedad antiosteoporótica. Se demostró que el extracto de C. deserticola podría inhibir significativamente la reducción de la DMO y prevenir el deterioro de la microarquitectura trabecular causado por OVX [17]. En el experimento in vitro, también aumentó significativamente la ALP, la proteína morfogenética ósea-2 y el ARNm de la osteopontina, así como la mineralización ósea de los osteoblastos cultivados [18]. El echinacósido, un componente bioactivo principal en C. deserticola registrado oficialmente en la farmacopea china [11], exhibió actividad antiosteoporótica con una dosis alta de 30~270 mg/kg de peso corporal/día [19], y otros resultados in vitro mostraron que podría promover la regeneración ósea al aumentar la relación OPG/RANKL en las células MC3T3-E1 Subclone 14 [20]. Cis A fue uno de los glucósidos feniletanoides aislados de C. deserticola, y varios informes revelaron que este compuesto poseía actividad antioxidante [21] y propiedades antiinflamatorias [22,23]. Un artículo publicado recientemente descubrió que Cis A exhibió actividades protectoras tanto en CCl4 como en hepatotoxicidad inducida por alcohol en ratones, y también mostró una propiedad protectora sobre el daño inducido por etanol en hepatocitos de ratón de cultivo primario in vitro [24]. En nuestro presente estudio, los resultados mostraron que Cis A poseía actividad antiosteoporótica a una dosis baja (20~80 mg/kg de peso corporal/día) mediante el uso de un modelo de ratones ovariectomizados, y esta bioactividad se ejercía al regular a la baja el nivel de TRAF6, suprimiendo la expresión de RANKL y NF-κB y la estimulación de OPG, PI3K y Akt, lo que significa que el efecto terapéutico de Cis A en ratones OVX fue a través del mecanismo de inactivación de NF-kappaB mediada por TRAF6- y activación de PI3K/Akt.

Es bien sabido que la ovariectomía puede causarosteoporosiscon una disminución evidente de la DMO, la fuerza biomecánica, la calidad ósea y la microarquitectura del hueso trabecular, y los cambios anteriores se deben en parte a la deficiencia de estrógenos [25]. Ahora, en el presente experimento in vivo, nuestro estudio demuestra que la ovariectomía inducidaosteoporosisresultó en una reducción significativa en la resistencia biomecánica y los parámetros estructurales trabeculares, incluidos BMD, BMC, TMC y Tb. N, y aumentando Tb. esp; y el tratamiento de Cis A mejoró significativamente las propiedades mecánicas óseas, incluida la carga máxima y la rigidez, mejoró la DMO y mejoró la mayoría de los parámetros estructurales de la microarquitectura trabecular ósea en comparación con los ratones del grupo OVX, lo que indica que Cis A fue eficaz para mejorar la calidad ósea y microarquitectura trabecular en ratones OVX.

Además de la DMO total, la prueba de flexión de tres puntos y la medición de la microarquitectura ósea trabecular podrían diagnosticar directamenteosteoporosis, los marcadores de formación ósea, incluidos ALP y BGP, y el índice de resorción ósea, incluidos TRAP, DPD y catepsina K, también se emplearon para dilucidar los mecanismos antiosteoporóticos relacionados de Cis A. En nuestro estudio, la actividad ALP en los ratones del grupo OVX demostró una tendencia creciente no significativa, lo que indica una mayor tasa de recambio óseo [26,27] en mujeres posmenopáusicas.osteoporosis; la dosis alta (80 mg/kg de peso corporal/día) y la dosis baja (20 mg/kg de peso corporal/día) de los tratamientos con Cis A mostraron una mejora significativa en la actividad de ALP en comparación con el grupo simulado, mientras que la actividad de BGP no pareció estar influenciada por la ovariectomía en todos los grupos tratados; TRAP, DPD y catepsina K aumentaron significativamente en el grupo OVX, y la administración de Cis A disminuyó notablemente los tres marcadores de resorción ósea. Los datos anteriores implicaban que Cis A poseía actividad antiosteoporótica potencial, y este efecto se ejercía mediante la regulación del metabolismo óseo, incluida la supresión de la reabsorción ósea y el aumento de la formación ósea.

La coordinación entre osteoblastos y osteoclastos es un factor crítico en el mantenimiento de la integridad esquelética. Los osteoclastos, que expresan TRAP, se adhieren a la superficie del hueso a través de la formación de zonas de sellado unidas a actina, dentro de las cuales se liberan enzimas proteolíticas, como la catepsina K, lo que conduce a la formación de pozos de reabsorción. La modulación de la osteoclastogénesis por células inmaduras del linaje osteoblástico está mediada por RANKL y OPG [28]. La OPG es un receptor señuelo que inhibe la activación de la osteoclastogénesis por RANKL, lo que disminuye la resorción ósea. RANKL, que proporciona una señal importante a los progenitores de osteoclastos, es una molécula unida a la membrana de la familia de ligandos del factor de necrosis tumoral que promueve la formación de osteoclastos. Se cree que la proporción de expresión de OPG/RANKL es un parámetro clave de la actividad osteoclastogénica, y las cascadas de señalización activadas por RANKL incluyen las vías NF-κB y PI3K [29]. La importancia de la vía de NF-κB para la osteoclastogénesis se demuestra por el hecho de que la eliminación de NF-κB en ratones resultó en la ausencia de osteoclastos maduros [30]. Se demostró que TRAF6 es un objetivo prometedor para nuevos fármacos antiosteoporóticos. Los ratones deficientes en TRAF6- que presentaban osteoclastogénesis defectuosa y osteopetrosis grave demostraron así la importancia de TRAF6 en el metabolismo óseo. La evidencia emergente apunta a una función reguladora crítica para TRAF6 en las cascadas de señalización mediadas por RANKL/RANK [4,31]. Los datos del estudio actual indicaron que el tratamiento con Cis A en los ratones OVX resultó en la regulación a la baja de los niveles de expresión de la proteína TRAF6, disminuyó RANKL y aumentó las expresiones de OPG y, por lo tanto, evitó la activación de RANKL de NF-κB corriente abajo y la activación de las vías de señal PI3K/Akt. , lo que sugiere que Cis A inhibe la diferenciación de osteoclastos mediante la inactivación de NF-kappaB mediada por TRAF6-y la activación de PI3K/Akt y el aumento de la relación OPG/RANKL, inhibiendo posteriormente la osteoclastogénesis y promoviendo la formación ósea.

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