Los glucósidos totales de Cistanche Deserticola promueven la recuperación de la función neurológica al inducir la regeneración neurovascular
Mar 29, 2022
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Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* y Yong Jiang1*
Fondo:Se ha informado que la medicina tradicional china Cistanche deserticola es válida para enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares. Sin embargo, sus componentes activos para la protección del accidente cerebrovascular isquémico no están claros. Nuestro objetivo fue explorar los componentes activos de C. deserticola contra el accidente cerebrovascular isquémico, así como sus mecanismos potenciales.
Métodos:Investigamos los efectos protectores del cerebro de extractos de C. deserticola, glucósidos totales (TG), polisacáridos (PS) y oligosacáridos (OS) en un modelo de rata de oclusión-reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R). 2, 3, 5-Se utilizó la tinción con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) para evaluar el volumen del infarto cerebral y se adoptó el ensayo Evansblue para evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB). Luego, las expresiones CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin,Keap-1 y Nrf{{13 }} se analizaron mediante transferencia Western o inmunofluorescencia, y las actividades MDA, SOD, CAT y GSH-Px se analizaron mediante kits.
Resultados:El tratamiento con TG redujo notablemente las puntuaciones de déficit neurológico y los volúmenes de infarto, promovió la angiogénesis y la remodelación neural, y mantuvo de manera efectiva la integridad de la barrera hematoencefálica en comparación con el grupo modelo. Además, los TG redujeron significativamente los niveles de MDA y aumentaron las actividades antioxidantes (SOD, CAT y GSH-Px) en el cerebro. Mientras tanto, los TG redujeron notablemente la expresión de Keep-1 y facilitaron la translocación nuclear de Nrf-2. Por el contrario, no se observaron efectos protectores para los grupos de PS y OS.
Conclusión:Los TG son los principales componentes activos de C. deserticola contra la lesión cerebral inducida por MCAO/R, y la protección se realiza principalmente a través de la vía Nrf-2/Keap-1.
Palabras clave:Cistanche desertica,lesión cerebral, glucósidos totales, polisacáridos, oligosacáridos, vía Nrf-2/Keap-1
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INTRODUCCIÓN
Los accidentes cerebrovasculares se consideran una de las principales causas de muerte y discapacidad en el mundo (Donnan et al., 2008). Casi el 87 por ciento de todos los casos de accidente cerebrovascular son provocados por un accidente cerebrovascular isquémico (Ovbiagele y Nguyen-Huynh, 2011). Actualmente, el agente más eficaz y el único fármaco aprobado por la FDA que se usa para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico es el activador tisular del plasminógeno recombinante. Sin embargo, un gran número de pacientes con accidente cerebrovascular no responden a este fármaco, debido a su estrecha ventana de tiempo terapéutico y al grave riesgo de complicaciones hemorrágicas (Lee et al., 2012; Schellinger y Kohrmann, 2014). Un desafío importante del tratamiento trombolítico es la lesión por isquemia/reperfusión (I/R), que se considera la principal causa de lesión cerebral y destrucción de la función. La reperfusión después de la isquemia cerebral aumenta el riesgo de una hemorragia cerebral al tiempo que conduce a una lesión neurovascular y produce un exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) que dañan la barrera hematoencefálica (Alluri et al., 2015). Varios estudios han confirmado que la interrupción de la BBB es una de las principales causas de la patogénesis del accidente cerebrovascular isquémico (Cao et al., 2016b).
La BBB consiste principalmente en células endoteliales, pericitos, astrocitos, neuronas y membranas basales. Los componentes centrales de la BBB son células endoteliales microvasculares cerebrales que están unidas por uniones estrechas, lo que restringe la entrada de moléculas exógenas en el cerebro. Las alteraciones patológicas de las uniones estrechas, en particular ocludina, claudina-5 y zonulaoccludens-1 (ZO-1), afectan significativamente la función de la BBB durante un accidente cerebrovascular isquémico, especialmente la permeabilidad de la barrera (Liuet al., 2014 ; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). Durante los períodos de I/R, el exceso de ROS es uno de los principales factores que conducen al daño directo de las neuronas cerebrales (Ding et al., 2014). La sobreproducción de ROS conduce a la degradación de ciertas uniones y la interrupción de la BBB, lo que da como resultado que moléculas exógenas ingresen al cerebro a través de la BBB, lo que provoca un agravamiento del daño cerebral (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Por lo tanto, la protección de la BBB por antioxidantes se ha considerado como una forma potencial de prevenir la lesión por reperfusión.
Además de la descomposición de la BBB, la I/R puede provocar lesiones neurovasculares y muerte neuronal (Jung et al., 2010). Durante un accidente cerebrovascular, el estrés oxidativo puede aumentar la muerte de las células neuronales (Chi et al., 2018) han demostrado que las ROS agravan la gravedad del accidente cerebrovascular y el daño neurológico (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Aunque los ensayos clínicos no han obtenido resultados satisfactorios, la neuroprotección sigue siendo una estrategia prometedora para el tratamiento del ictus isquémico agudo (Moretti et al., 2015). Por lo tanto, encontrar fármacos de neuroprotección efectivos para tratar los accidentes cerebrovasculares es un beneficio para los pacientes con accidentes cerebrovasculares.
La medicina tradicional china (MTC) toma medidas para intervenir contra el desequilibrio interno del cuerpo (Gaire, 2018). Debido a la patogénesis compleja de los accidentes cerebrovasculares isquémicos, el efecto multifactorial de la MTC y sus componentes activos juegan un papel fundamental en el tratamiento de los accidentes cerebrovasculares. La Cistanche deserticola YC Ma, extendida en áreas áridas o semiáridas de Mongolia y el noroeste de China, ha sido una hierba de la medicina tradicional china ampliamente utilizada para el tratamiento de diversas enfermedades como el olvido y la depresión durante más de 1,000 años en China. Estudios farmacológicos modernos indicaron que los extractos crudos de C. deserticola mostró múltiples actividades farmacológicas, como mejorar la función de aprendizaje y memoria, neuroprotección, mejorar la inmunidad, efectos antioxidantes, antienvejecimiento y antifatiga (Ko y Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). Análisis químico de C. deserticola mostró que sus principales constituyentes incluyen glucósidos feniletanoides, glucósidos iridoides, polisacáridos y oligosacáridos (Jiang y Tu, 2009). Sin embargo, los componentes activos de C. deserticola para la protección cerebral no están muy claros.
La propiedad neuroprotectora de C. deserticola implica su potencial terapéutico en enfermedades relacionadas con la función cognitiva, como los accidentes cerebrovasculares y la depresión, así como la enfermedad de Alzheimer (Wang et al., 2017). Sin embargo, la investigación sobre el impacto de los ataques de C. deserticola, incluidos sus componentes activos y mecanismos de acción, es muy limitada. En el trabajo actual, exploramos el efecto protector de tres extractos de C. deserticola, glucósidos totales (TG, glucósidos feniletanoides y otros glucósidos), polisacáridos (PS) y oligosacáridos (OS) en lesiones cerebrales por I/R. Nuestros hallazgos pueden contribuir a la aplicación clínica precisa de C. deserticola y proporcionar un agente candidato para la terapia del accidente cerebrovascular isquémico.
Cistanche tiene tpotencial terapéuticoen enfermedades relacionadas con la cognición, como accidentes cerebrovasculares y depresión,así como la enfermedad de Alzheimer.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sustancias químicas y reactivos
Los tallos de Cistanche deserticola se compraron en Alashan, Mongolia Interior, y uno de los autores (P.-F. Tu) los identificó. Los TG, PS y OS se prepararon de acuerdo con nuestro método informado anteriormente (Gao et al., 2015) . El análisis cuantitativo de los TG se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) como se describió anteriormente (Li et al, 2019), y su cromatograma se muestra en la Figura 1. Los componentes principales de los TG son equinacósido, tubulosido A, acteósido, isoactósido y 2'- acetilactósido; sus contenidos son 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g y 12,045 mg/g, respectivamente. Los contenidos de PS y OS son 69,42 por ciento y 65,24 por ciento, respectivamente, según lo determinado por HPLC y el análisis de ácido fenol-sulfúrico, respectivamente (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).
Las referencias estándar de echinacoside (A0282), tubulosideA (A0942), acteoside (A0280), isoacteoside (A0281) y 2'-acetylacteoside (A0943) se adquirieron de Chengdu MustBiotechnology (Sichuan, China). Las purezas de todos los estándares son superiores al 98 por ciento. Los kits de tinción H&E de Nissl se compraron a Boster (Wuhan, China). Edaravone (T0407-1) se compró a TargetMol (Shanghai, China). Rabbit anti-rata MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) y mouse anti-rata CD31 (ab24590) se compraron de Abcam Inc (Cambridge, MA, EE. UU.). Rabbit anti-rata Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) y Occludin (BS72035) se compraron de Bioworld Technology (Nanjing, China). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, EE. UU.) fue la fuente de la sinapsina de conejo anti-rata-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) se adquirió de Proteintech Group, Inc. (Chicago, EE. UU.). Los anticuerpos secundarios fueron suministrados por Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Beijing, China). Hoechst 33258 se obtuvo de Beyotime (Jiangsu, China).
FIGURA 1|Los cromatogramas de HPLC de los TG (A) y las referencias estándar (B).
animales
Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley (macho, con un peso de 250 a 300 g) de Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, China) y se alojaron en una habitación con aire acondicionado en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas ARRIVE de investigación con animales (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín (LA2019123).
Protocolos de Experimentación Animal
Las ratas se sometieron a MCAO/R, como se describió previamente (Wang et al., 2018). Brevemente, se expusieron la arteria carótida común izquierda (CCA), la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ACI), y se insertó una sutura de monofilamento de nailon 3-0 desde la ECA hasta la ACI hasta llegar a la arteria cerebral media ( MCA). Después de 1,5 horas de oclusión de la ACM, se simuló la reperfusión retirando el filamento. Durante el procedimiento quirúrgico, la temperatura corporal de todas las ratas se mantuvo a 37,0 grados.
Administración de Drogas
Las ratas se separaron al azar en seis grupos usando el software SPSS versión 22.0 como se describe (Jiang et al., 2014): grupo normal (NOR); grupo modelo (MOD); grupo de edaeavona (fármaco positivo, 6 ml/kg, EDI); grupo TG (280 mg/kg, TG); grupo de PS (280 mg/kg, PS) y grupo de OS (280 mg/kg, OS). Los TG, PS y OS se administraron ig una vez al día después de MCAO/R durante 14 días. Los grupos NOR y MOD fueron tratados con solución salina normal. Los números de animales se muestran en la Tabla 1.
CUADRO 1|Número de animales para diferentes grupos experimentales y varios parámetros a los 14 d después de la administración.
Medición de Peso y Puntajes de Déficit Neurológico Modificado (mNSS)
El peso corporal se controló el día 14 utilizando una báscula digital ADVENTURE™ (OHAUS, Nueva Jersey, EE. UU.). El NSS se evaluó de acuerdo con el método descrito por FJ Wang (Wang et al., 2018), con revisiones menores.
Tinción con 2, 3, 5-cloruro de trifeniltetrazolio (TTC)
El volumen del infarto se midió como se describió anteriormente (Wanget al., 2015). En resumen, los cerebros se seccionaron en siete bloques coronales igualmente espaciados (2 mm). Estas secciones se tiñeron con TTC al 2 por ciento (Coolaber, Beijing, China) a 37 grados durante 15 min. Volumen de infarto (porcentaje)=(volumen del hemisferio isquémico ipsilateral−volumen del hemisferio isquémico contralateral)/volumen del hemisferio isquémico contralateral × 100.
Tinción Nissl y H&E
Las ratas se anestesiaron profundamente y luego se extrajo rápidamente el cerebro completo del cráneo y se fijó usando paraformaldehído al 4 por ciento y se incrustó en cera de parafina, y se seccionó en rodajas de 7 µm de espesor. Las secciones se tiñeron con Nissl y H&E. En este estudio, se capturaron seis campos aleatorios de 200 × 200 µm en cada muestra de tejido con un microscopio óptico. El número de cuerpos de Nissl se contó con IPPsoftware versión 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, EE. UU.).
Ensayo azul de Evans
A las ratas se les inyectó EB al 2 por ciento (Coolaber Science & Technology Co., LTD) después de MCAO/R. Dos horas más tarde, las ratas fueron anestesiadas y el cerebro completo fue extraído rápidamente y homogeneizado en acetona. Los sobrenadantes se analizaron a 620 nm con un lector de absorbancia 800 TS (BioTek, EE. UU.).
Medición de las actividades de catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD), malondialdehído (MDA) y glutatión peroxidasa (GSH-Px)
Todas las muestras de suero se centrifugaron a 4,000 × rpm durante 15 min a 4 grados y luego se analizaron para detectar las actividades de MDA, CAT, SOD y GSH-Px siguiendo las instrucciones del fabricante (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. , Porcelana).
Análisis de transferencia Western
Los tejidos cerebrales (100 mg) recogidos de cada rata se homogeneizaron y lisaron en tampón de lisis RIPA y luego se analizaron para detectar la concentración de proteína utilizando un kit BCA (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.). Las proteínas totales del tejido se cargaron en geles SDS-PAGE al 10 por ciento y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó usando leche descremada al 5 por ciento, luego se incubó durante la noche con anticuerpos primarios a 4 grados. A continuación, la membrana se incubó con un anticuerpo secundario. El análisis de transferencia Western se analizó utilizando el Sistema de imágenes digitales Kodak (5200 Multi, Tanon, China).
Análisis inmunofluorescente
Se realizaron tinciones de inmunofluorescencia para CD31, a-SMA, ZO-1,claudina5, ocludina, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 y Keap-1. Los anticuerpos primarios contra Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN,PSD95, MAP-2 y Keap-1 se diluyeron para 1:200 y 1:100, respectivamente. Los anticuerpos secundarios de IgG anti-conejo de ratón Alexa Flur 488 y IgG anti-conejo de cabra rodamina (TRITC) se diluyeron ambos a 1:200. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33258. Las imágenes se capturaron con el sistema de imágenes de patología cuantitativa automatizada Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, EE. UU.). La expresión de la proteína se analizó utilizando el software IPP versión 6.0.
Análisis estadístico
Todos los datos se describieron como media ± SD. Se realizó el software SPSS versión 22.0para el análisis estadístico. Se usó ANOVA de una vía al comparar diferentes grupos. Se consideró que P < 0.05="" era="" la="" diferencia="">
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RESULTADOS
Los TG aumentan el peso corporal y reducen los daños cerebrales en ratas MCAO/R
Después de 14 días de curación con TG, PS, Oss y EDI, se evaluaron los pesos corporales, los déficits neurológicos y los volúmenes de infarto de ratas I/R. Los resultados mostraron que los pesos corporales en el grupo MOD se redujeron considerablemente, mientras que los pesos disminuidos en los grupos TG, PS y EDI aumentaron obviamente (Figura 2A). Las puntuaciones de déficit neurológico se redujeron sustancialmente con EDI y TG (Figura 2B). Los cortes de cerebro en las ratas del grupo NOR eran de color rojo oscuro y no había infartos, mientras que las ratas del grupo MOD mostraban un gran infarto cerebral ipsilateral. Después del tratamiento con TG, los volúmenes de infarto se redujeron significativamente (Figuras 2C, D). El tratamiento con PS y OS no mostró ningún efecto obvio sobre los índices anteriores. Los datos anteriores mostraron que los TG podrían aliviar notablemente la lesión cerebral inducida por I/R, pero los PS y los OS no.
FIGURA 2|Los TG reducen el daño cerebral inducido por la isquemia cerebral focal transitoria.
Los TG mejoran el daño histopatológico en ratas MCAO/R
Para determinar algunos de los efectos del tratamiento con TG, PS y OS sobre los daños histopatológicos, se realizó una tinción con H&E para revelar el daño patológico. Las estructuras histomorfológicas de los cerebros del grupo NOR se organizaron regularmente. Los cambios morfológicos en los grupos TG fueron más leves que en el grupo MOD. Sin embargo, los grupos de tratamiento de PS y OS no mostraron una mejora significativa de los cambios morfológicos (Figura 3).
Los TG atenúan la lesión neuronal después de ratas inducidas por I/R
La tinción de Nissl mostró los cambios histopatológicos de las neuronas en la penumbra del área isquémica. Como se muestra en la Figura 4, las neuronas normales tenían un nucléolo claro y una estructura intacta. En el grupo MOD, las neuronas tenían espacios intercelulares agrandados. Los nisslbodies estaban desaparecidos, encogidos y profundamente manchados. Sin embargo, estos cambios rara vez se observaron en los grupos de EDI, TG y PS. Estos resultados ilustraron que los TG y los PS podrían atenuar significativamente la lesión neuronal inducida por isquemia/reperfusión.
Los TG atenúan la interrupción de BBB después de ratas tratadas con I/R
El ensayo azul de Evans es un método clásico para investigar el cambio de la permeabilidad de la BBB. Los resultados del experimento mostraron que se observó un aumento del azul de Evans en el grupo MOD, mientras que hubo una disminución significativa del azul de Evans en las ratas tratadas con TG y EDI. Además, no hubo diferencias significativas entre los grupos de terapia con PS y OS (Figura 5). Estos resultados sugirieron que los TG podrían atenuar significativamente la interrupción de la BBB.
FIGURA 3|Los TG mejoran el daño histopatológico en ratas MCAO/R.
Los TG promueven la angiogénesis en ratas lesionadas por I/R
Estudios más recientes muestran que la angiogénesis juega un papel fundamental en la recuperación funcional neurológica y el resultado pronóstico después de un accidente cerebrovascular isquémico agudo (Yuen et al., 2015). Para evaluar los efectos de los TG, PS y OS sobre la angiogénesis, se utilizaron CD31 y a-SMA para cuantificar el número de capilares. La tinción de inmunofluorescencia mostró que el grupo MOD provocó una disminución notable en las expresiones de CD31 (Figuras 6A, B) y a-SMA (Figuras 6C, D) en la penumbra de áreas isquémicas de ratas I/R, en comparación con las ratas normales. Este resultado ilustró que I/R podría causar daño vascular en la penumbra de la corteza de los hemisferios isquémicos. Sin embargo, el tratamiento con TG y EDI aumentó notablemente la densidad capilar, la angiogénesis y la arteriogénesis, como lo indica el aumento de las expresiones de CD31 y a-SMA. Estos resultados sugieren que los TG podrían promover la angiogénesis en la penumbra isquémica de ratas I/R, pero los PS y los OS no.
Los TG aumentan la expresión de proteínas de unión estrecha en ratas lesionadas por I/R
La interrupción de BBB puede elevar el contenido de agua del cerebro y la inflamación de los tejidos, lo que provoca una lesión cerebral. Las proteínas de unión estrecha son componentes estructurales importantes de la BHE (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Para probar si el tratamiento con TG, PS y OS después de un accidente cerebrovascular podría influir en la integridad de la BBB, se realizaron análisis de inmunofluorescencia de las expresiones de ZO-1, claudina-5 y ocludina. Los resultados indicaron que las expresiones de claudina-5, ocludina y ZO-1 estaban visiblemente disminuidas en el grupo MOD. Sin embargo, aumentaron sustancialmente después de 14 días de la administración de TG. Los grupos de PS y OS no mostraron cambios significativos en estas expresiones de proteínas (Figura 7). Estos datos indicaron que los TG pueden regular las expresiones de la proteína de la unión estrecha y probablemente mantener la integridad de la BBB después de la lesión por I/R.
Los TG aumentan la cobertura de pericito en los capilares en ratas lesionadas por I/R
La cobertura de pericitos en los capilares juega un papel fundamental en el mantenimiento de la integridad de la BBB (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Por lo tanto, probamos si la cobertura de pericitos podría aumentar con el tratamiento de TG, PS y OS. Los resultados del análisis de intensidad de inmunofluorescencia mostraron que las expresiones tanto de PDGFRb como de CD31 disminuyeron drásticamente en el grupo MOD. La administración de TGs a las ratas I/R recuperó significativamente o incluso aumentó las intensidades de expresión de PDGFRb y CD31, pero no se observó ninguna diferencia en los grupos de tratamiento con PS y OS (Figura 8). Por lo tanto, el tratamiento de los TG podría aumentar significativamente la cobertura de pericitos. Estos hallazgos confirmaron además que los TG pueden mantener la integridad de BBB después de I/R.
Los TG promueven la remodelación neural en ratas lesionadas por I/RI
Según numerosos estudios, la neurogénesis tras un ictus puede mejorar significativamente la recuperación funcional (Grefkes and Ward, 2014; Zhang et al., 2019). La sinaptofisina (SYN), las proteínas de densidad postsináptica 95 (PSD-95) y la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP-2) se utilizaron como marcadores para examinar la plasticidad neuronal en la penumbra isquémica de la corteza. Con el fin de evaluar los efectos del tratamiento con TG, PS y OS en la neurogénesis en ratas lesionadas por I/R, se realizaron inmunofluorescencia y western blot para las expresiones SYN, PSD95 y MAP-2. Como se muestra en las Figuras 9 y 10, los niveles de expresión de SYN, PSD95 y MAP-2 en ratas I/R después de 14 días de reperfusión disminuyeron en comparación con las ratas NOR, mientras que la cura de TG y PS pudo aumentar significativamente sus niveles de expresión. . El grupo de OS no tuvo cambios significativos en comparación con el grupo de MOD. Los datos indicaron que la cura de TG y PS fue capaz de promover dramáticamente la remodelación neural después de una lesión por I/R.
Los TG alteran Nrf-2 y mantienen-1 expresiones en ratas lesionadas por I/R
El estrés oxidativo es un mecanismo patogénico principal en la lesión por I/R (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Los estudios verificaron que Nrf-2 es un regulador maestro de las respuestas antioxidantes (Thompson et al., 2015). Para investigar las respuestas oxidativas mediadas por Nrf-2 y Keap-1 después de una lesión por I/R, evaluamos la expresión citoplasmática y la translocación nuclear de Keap-1. Mientras tanto, la expresión de Nrf{{7 }} en tejidos cerebrales de rata lesionados por I/R también se ensayó (Figuras 10 y 11). Según el análisis de inmunofluorescencia, se encontró que Nrf-2 estaba principalmente ubicado en el citoplasma en el grupo NOR. En el grupo de TG, la expresión de Nrf-2 en la localización citoplasmática estaba regulada a la baja, pero aumentaba en el núcleo, y también se observó una expresión disminuida de Keap-1. Los datos mostraron que la protección cerebral de los TG podría estar asociada con la modulación de Nrf-2 y Keap-1.
FIGURA 4|Los TG atenúan la lesión neuronal después de ratas tratadas con I/R.
Los TG atenúan el estrés oxidativo del tejido cerebral en ratas lesionadas por I/R
Para confirmar los efectos antioxidantes de los TG, se evaluaron las actividades de SOD, CAT, GSH-Px y MDA en ratas lesionadas por I/R. En la Figura 12, el contenido de MDA aumentó notablemente en el grupo MOD y, al mismo tiempo, las actividades de SOD, CAT y GSH-Px disminuyeron en comparación con las ratas normales. Por el contrario, el tratamiento con TG provocó una disminución significativa. en el contenido de MDA y un incremento en las actividades de SOD, CAT y GSH-Px. Estos resultados confirmaron aún más la actividad antioxidante de los TG.
DISCUSIÓN
Muchos estudios sugieren que la MTC C. deserticola tiene amplias actividades biológicas, por ejemplo, mejora la capacidad de aprender, la memoria y la inmunidad (Dong et al., 2007; Jiang y Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia et al., 2018). ). Sin embargo, los componentes activos de C. deserticola para la neuroprotección siguen sin estar claros. El trabajo actual tiene como objetivo evaluar los componentes activos de C. deserticola contra el accidente cerebrovascular isquémico en el modelo MCAO/R. Se utilizaron tres extractos de C. deserticola (TG, PS y OS) para evaluar sus efectos en ratas MCAO/R, así como los posibles mecanismos.
El accidente cerebrovascular es una enfermedad cerebrovascular aguda común. Los estudios epidemiológicos muestran que el accidente cerebrovascular es más común en hombres que en mujeres (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik y Bushnell, 2017). Así, en nuestro experimento, se adoptaron ratas macho para las pruebas. Nuestros resultados demostraron que la inducción de I/R aceleró el estrés oxidativo y el volumen del infarto, rompiendo la BBB y provocando lesiones nerviosas y cerebrovasculares. Después de la selección, se encontró que los TG disminuyen el volumen del infarto y promueven la remodelación neural y la angiogénesis. Además, se observó que los TG mantienen la integridad de la BBB después de la lesión por I/R. Por el contrario, los PS y los OS no alivian significativamente el daño de I/R. Por lo tanto, los TG se consideran la principal fracción activa de C. deserticola para la neuroprotección, potencialmente a través de la promoción de la remodelación neural, la angiogénesis y la integridad de BBB mediante la activación de la vía Nrf-2/Keap-1.
FIGURA 5|Los TG atenúan la interrupción de la BBB después de una lesión por I/R.
La creciente evidencia indica que el establecimiento de circulación colateral efectiva es significativamente importante para evitar la formación de infarto y penumbra isquémica, y es un tratamiento crítico en una etapa temprana del accidente cerebrovascular isquémico (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). La proliferación de células endoteliales vasculares y de músculo liso tras un infarto isquémico determina el establecimiento de circulación colateral. Sin embargo, los modelos de isquemia tienen un fenómeno común, es decir, el estrés oxidativo existió ampliamente en la microvasculatura cerebral. Los datos del estudio han mostrado que una gran cantidad de antioxidantes pueden alterar la función de la BHE y las propiedades de la angiogénesis (Mentor y Fisher, 2017). CD31 y a-SMA son los marcadores de las células endoteliales vasculares y de las células del músculo liso, respectivamente (Saboor et al., 2016). Para investigar el efecto sobre la proliferación celular mencionada anteriormente de los extractos de C. deserticola, examinamos las expresiones de CD31 y a-SMA en el homogeneizado de penumbra isquémica cerebral. Nuestros datos mostraron que los TG mejoraron notablemente las expresiones de CD31 y a-SMA. Sin embargo, no hubo diferencias significativas para los grupos de PS y OS. Por lo tanto, deducimos que los TG pueden reducir el daño cerebral al promover la angiogénesis mediante el aumento de las expresiones de CD31 y a-SMA, mientras que los PS y los OS no proporcionaron tal protección contra el daño cerebral. Estos resultados confirmaron además que solo los TG podrían prevenir la lesión por I/R cerebral.
El accidente cerebrovascular isquémico puede pensarse como el resultado de una isquemia cerebral causada por un deterioro en la plasticidad neuronal o por una remodelación de áreas cerebrales. La mayoría de los pacientes con accidente cerebrovascular sufren déficits neurológicos. La activación de la neurogénesis es una estrategia prometedora para que los pacientes con accidente cerebrovascular mejoren sus funciones neurológicas (Cramer y Chopp, 2000). La neurogénesis participa directamente en la recuperación de la función neurológica después de una lesión cerebral I/R (Zhang et al., 2019). Investigaciones anteriores muestran que los TG pueden mejorar la tasa de supervivencia de las células piramidales del hipocampo e inducir la neurogénesis (Lian et al., 2017). El estrés oxidativo provoca la pérdida de neuronas durante muchas enfermedades, como el Parkinson, los accidentes cerebrovasculares, etc. (Duan y Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2transcribe muchos genes relacionados con la neuroprotección en su región promotora, principalmente SOD, MDA, CAT y g glutamil cisteína ligasas, etc. (Satoh et al., 2006). Las proteínas SYN, PSD-95 y MAP-2, que están estrechamente asociadas con la formación sináptica y la neurotransmisión, pueden considerarse como marcadores de investigación de la plasticidad neuronal en la región de la penumbra isquémica. Después de estudiar, descubrimos que la cura con Los TG podrían aumentar significativamente las expresiones de PSD95, SYN y MAP-2, lo que indica que la protección cerebral de los TG se correlacionó con la plasticidad neuronal mejorada durante I/R. Sin embargo, es una pena que no haya una diferencia obvia para PS también. como grupos de SO. Estos resultados indicaron que los TG podrían mejorar la neuroplasticidad después de una lesión por I/R cerebral.
La investigación de imágenes en pacientes con accidente cerebrovascular mostró que la disfunción BBB puede considerarse como un atributo sorprendente del cerebro periisquémico (Bang et al., 2007). Los TJ, que están compuestos por proteínas citoplásmicas, proteínas transmembrana y moléculas de adhesión de unión entre células endoteliales capilares, son muy importantes para mantener la integridad de la BBB (Ye et al., 2019). Entre ellas, ZO-1, claudina-5 y ocludina son las proteínas más importantes en las TJ. La creciente evidencia indica que el aumento de la permeabilidad de la BBB inducida por la isquemia generalmente se correlaciona con las alteraciones de ZO-1, claudina-5 y ocludina (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al. ., 2017; Liu et al., 2018). En este trabajo, los resultados demostraron que aunque los TG podrían aumentar significativamente las expresiones de las proteínas ZO-1, claudina-5 y ocludina en los tejidos cerebrales inducidos por MCAO, ni los PS ni los OS lo hicieron. La BBB consiste en células endoteliales cerebrales y está estrechamente asociada con los pericitos (Nyul-Toth et al., 2016). Los pericitos son vitales para la integridad de la BBB (Bell et al., 2010). El accidente cerebrovascular isquémico desencadena la muerte de los pericitos y el desprendimiento de las células endoteliales del cerebro en la fase aguda, lo que desestabiliza la microvasculatura y altera las propiedades de la BBB (Zechariahet al., 2013). Nuestros datos mostraron que los TG podrían aumentar la cobertura de pericitos en los capilares y aumentar los niveles de expresión de ZO-1, claudina-5 y ocludina. Estos fenómenos demostraron que los TG podían proteger eficazmente la integridad de la BBB después de una lesión por I/R cerebral. En resumen, los TG pueden atenuar la lesión cerebral de múltiples maneras, como promover la angiogénesis, mejorar la plasticidad neuronal y mantener la integridad de la BBB.
Luego investigamos la vía de señalización para explorar el mecanismo subyacente a la protección cerebral de los TG. El proceso de lesión por I/R es multifactorial y, por lo tanto, numerosos mecanismos están involucrados en la patogenia. El estrés oxidativo es un factor de riesgo fundamental que contribuye a la lesión cerebral inducida por I/R (Suda et al., 2013), como el daño de la estructura BBB, la disfunción del endotelio vascular y el agravamiento de la lesión neuronal isquémica (Xiong et al., 2015; Caglayan et al. al., 2019; Priestley et al., 2019). Por lo tanto, el estrés oxidativo se ha convertido en un objetivo terapéutico atractivo en la lesión cerebral inducida por I/R. Las enzimas de fase 2, que están mediadas por el factor nuclear E2-factor relacionado-2 (Nrf-2), tienen ha sido considerado como un medio importante por el cual las neuronas se protegen contra el estrés oxidativo (Suzukiand Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). La creciente evidencia indica que la activación de Nrf-2 durante la I/R es un objetivo terapéutico potencial para la neuroprotección (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, como importante regulador de la defensa antioxidante endógena, media el nivel de hemooxigenasa 1 (HO-1) y otras enzimas antioxidantes, como NAD(P)H quinona oxidorreductasa1 (NQO1), SOD, CAT, GSH y MDA (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). Además, Nrf-2 juega un papel regulador importante en la angiogénesis. El presente estudio muestra que Nrf-2 puede mejorarse y activarse significativamente en el proceso de desarrollo vascular (Wei et al., 2013).
Como se describió anteriormente (Jiang y Tu, 2009), los TG contienen muchos compuestos bioactivos, por ejemplo, equinacósido, tubulosido A, actósido, isoactósido y 2'-acetilactósido, y algunos de ellos mostraron funciones neuroprotectoras después de una lesión por I/R cerebral (Penget al. ., 2016). El echinacósido tiene muchos efectos farmacológicos, como antioxidantes, antisenescencia, neuroprotección, antiinflamación, promoción de la cicatrización, hepatoprotección, promoción de la formación ósea y actividades antitumorales (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). Recientemente, el echinacósido ha sido identificado como un potente antioxidante en el sistema nervioso central (Lu et al., 2016). El equinacósido puede reducir el contenido de MDA y mejorar las actividades de SOD y GSH Px en la lesión cerebral por isquemia, y el análisis de acoplamiento molecular mostró que el equinacósido puede unirse a Keap-1, lo que lleva a la translocación nuclear Nrf-2 (Li et al. , 2018). El estudio de Xia mostró que el acteósido podría disminuir el volumen del infarto y el contenido de agua en el cerebro para mejorar los déficits neurológicos en ratas MCAO/R a través de la mitigación del estrés oxidativo (Xia et al., 2018). Otros estudios han demostrado que el isoactósido podría aumentar las actividades de las enzimas antioxidantes celulares, SOD y CAT en células V79-4 tratadas con H2O2-(Chae et al., 2005). Basándose en los informes anteriores de los compuestos activos contenidos en los TG, es posible deducir que los TG podrían proteger contra el accidente cerebrovascular isquémico a través de las vías de la antioxidante.
Li informó sobre los efectos neuroprotectores de los glucósidos de feniletanoide (PhG) en la apoptosis inducida por H2O2-en células PC12 a través de la vía Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Estos PhG se suprimieron significativamente al desencadenar la translocación nuclear de Nrf2 y aumentar las expresiones de HO-1, NQO1, la subunidad catalítica de glutamato-cisteína ligasa (GCLC) y la subunidad modificadora de glutamato-cisteína ligasa (GCLM) (Li et al., 2018; Gong et al. al., 2019). Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que la vía Nrf-2/ARE juega un papel crucial en los efectos protectores mediados por PhG en las células neuronales. De manera similar, en este estudio, encontramos que los TG podrían disminuir el nivel de MDA y aumentar los niveles de SOD, CAT y GSH-Px en las ratas I/R. Mientras tanto, los TG podrían regular al alza la expresión de Nrf2 en el núcleo, regular a la baja la expresión correspondiente en el citoplasma y disminuye significativamente la expresión de Keap-1. Por lo tanto, la vía Nrf-2/Keap-1 puede estar involucrada en los efectos neuroprotectores mediados por los TG. En el futuro, se realizaría una mayor validación de esta vía en cultivos celulares in vitro con modelos de lesiones por privación de oxígeno-glucosa/reoxigenación. Además, C. Los extractos de deserticola se administraron en nuestro estudio durante 14 días de forma continua. Dado que la neurogénesis adulta afectaría la interpretación de los efectos neuroprotectores durante 14 días de reperfusión, la neurogénesis no se puede excluir en nuestro diseño experimental actual para explorar el efecto neuroprotector de las TC. Esta es la limitación de nuestra investigación.
En conclusión, son los TG de C. deserticola los que pueden mejorar la angiogénesis y la neurogénesis, así como mantener la integridad de la BBB en ratas con lesión I/R, pero no los PS y OS. Los efectos podrían estar mediados por la activación de la vía Nrf-2/Keap-1.
