Abstracto:UsandoDesérticola de CistancheParasitando dos plantas huésped (haloxylon ammodendron y Atriplex canescens) Como materiales de prueba, este estudio determinó el contenido de polisacárido en C. deserticola de diferentes huéspedes utilizando el método de ácido fenol-sulfúrico. Secuenciación y análisis del transcriptoma de haloxylon-cistanche yAsociaciones de Atriplex-Cistanchese realizaron utilizando la plataforma de secuenciación Illumina NovaseQ 6000. La investigación se centró en investigar las diferencias de transcriptoma en C. deserticola de diferentes huéspedes, detectar genes enzimáticos clave involucrados en el metabolismo del polisacárido y validar los genes seleccionados a través de la verificación QRT-PCR. Este estudio tiene como objetivo proporcionar una base teórica para explorar nuevas plantas huéspedes y la mejora genética de C. deserticola. El resultado mostró que el contenido de polisacárido encontrado en Atriplex Quadriptera-C.Deserticola fue superior al presente en el haloxylon ammodendron-C. Deserticola. A través del análisis comparativo del transcriptoma, se seleccionaron 14089 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) de los tallos carnosos de Atriplex Quadriptera-C. Deserticola y Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola. Los resultados del análisis de enriquecimiento de KEGG revelaron que estos DEG se enriquecieron más prominentemente en las vías relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos, el metabolismo de la galactosa, el metabolismo de los aminoácidos y el metabolismo de los ácidos grasos. Además, se obtuvieron un total de 26 degs de cuatro vías relacionadas con el metabolismo de polisacárido, entre los cuales los niveles de expresión del gen de la fructosidasa y el gen -galactosidasa en el ammodendrón de haloxilón -C. El deserticola fue significativamente más alto que los de Atriplex Quadriptera-C. Deserticola. Los niveles de expresión del gen UDP-glucosa deshidrogenasa y el gen de la transferasa de guanilato fosfato de Mannose -1- en Atriplex Quadriptera-C. La deserticola fue significativamente más alta que las de Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola, que puede ser los genes enzimáticos clave para regular la diferencia del metabolismo del polisacárido en C. deserticola.

Palabras clave Desérticola de Cistanche; secuenciación del transcriptoma; anfitriones; Diferencia del metabolismo del polisacárido

Desérticola de Cistanche

 

Cistanche deserticola yc ma, principalmente distribuido enGansu, Xinjiang, Ningxia y Mongolia interior, es una hierba medicinal tradicional china recientemente incluida en el"Medicinal y alimentos homólogos"catalogar. Tiene varios beneficios para la salud, comoTonificar el riñón yang, la esencia nutritiva y la sangre, y promover los movimientos intestinales, haciéndolo ampliamente aplicado enmedicina, atención médica y la industria alimentaria[1]. Debido a sunaturaleza heterotrófica, Desérticola de Cistancheparasitar diferentes plantas anfitrionas, conHaloxylon ammodendroy el recién introducidoarbusto semi-EvergreenAtriplex canescens(Pursh) Nutt.siendo sus principales anfitriones.

Los polisacáridos son las sustancias activas clave para evaluarDesérticola de Cistanchecalidad. En diferentes condiciones de host, elacumulación y composición metabólicadeCistancheLos polisacáridos varían significativamente [2]. La investigación médica ha demostrado queCistancheposeer los polisacáridosantioxidante, neuroprotector, inmune-regulador y mejora de la memoriaefectos farmacológicos, aliviando efectivamenteLa enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la deficiencia de bazo inducida por la depresión hepática[3]. Con avances en modernosTécnicas de extracción y tecnologías de análisis múltiple, elcontenido, composición y características estructuralesdeCistancheLos polisacáridos se están dilucidando gradualmente, expandiendo sus aplicaciones.

En términos deInvestigación de biología molecularenCistancheespecies, los estudios de secuenciación del transcriptoma se han centrado principalmente enCistanche tubulosayHaloxylon-Cistanchesistemas complejos.Por ejemplo,Hou et al.[4] realizadosecuenciación del transcriptoma de longitud completa y perfiles de expresión génicadeCistanche tubulosausandoPacBio y BGiseq -500 Tecnologías RNA-seq, identificando237,772 transcripciones únicasy cribado genes enzimáticos clave involucrados enbiosíntesis de glucósidos feniletanoides. Similarmente,Feng et al.[5] realizadoanálisis transcriptómicos y metabolómicosde la haustoria y los tejidos adyacentes deRaíces de haloxylon yCistanchetallos carnosos, revelando el papel del huésped en la acumulación deCistanchemetabolitos. Su estudio enfatizó que elLa planta huésped no solo afecta el rendimiento deCistanchepero también su calidad. Sin embargo, investigación sobreCistancheLa parasitización de diferentes plantas huésped sigue siendo limitada.

Atriplex canescens, a planta profundamente arraigada y altamente resistente al estrés, difiere del tradicionalHost haloxylony se origina en elmesetas semiáridas del centro de los Estados Unidos. En los últimos años, ha sido introducido y promovido como unNuevo anfitrión paraDesérticola de CistanchecultivoenNoroeste de China. Un Qing et al.[6] analizado y comparado elacumulación de polisacárido deCistancheParasitando haloxylon y atriplex canescensen la misma área de producción, encontrardiferencias significativas en el contenido de polisacáridoentre las dos condiciones del host.

Por lo tanto, este estudio apunta asecuencia los tallos carnosos deDesérticola de CistancheParasitando haloxylon y atriplex canescens, analizando elExpresión diferencial de genes enzimáticos clave involucrados en la biosíntesis de polisacáridos. Los hallazgos proporcionarán unfundación teórica para futuras investigaciones sobreCistancheMecanismos de biosíntesis de polisacárido, enriquecidos estudios transcriptómicos sobre atriplex-Cistanchesistemas y promover la innovación en alta calidadCistancheRecursos de germoplasma.

 

Materiales y métodos

1.1 Materiales experimentales

Desérticola de Cistanchemuestras parasitarHaloxylon ammodendroyAtriplex canescensfueron recolectados delCistanchebase de cultivo enTown Xiquan, condado de Jingtai, provincia de Gansu(latitud36 grados 5 'n, longitud103 grados 42 'e). AmbosHaloxilónyAtriplex canescensfueron cultivados en el mismo entorno. Las muestras se clasificaron comoHaloxylon-Cistanche(Muestra a)yAtriplex-Cistanche(Muestra h),con tres réplicas para cada categoría (cinco plantas por réplica). El muestreo se realizó enAbril de 2024, y las muestras se identificaron comoDesérticola de Cistanchebombillas carnosas porProfesor Guo YehongdesdeColegio de Agricultura, Universidad Agrícola Gansu.

Siguiendo elPautas de muestreo de Shanghai OE Biotech Co., Ltd., elCistancheLos tallos carnosos se enjuagaron con agua ultrapura, y el exceso de humedad se eliminó con papel de filtro. Se tomaron rebanadas delgadas delsuperior, medio e inferiorde cada tallo, mezclado completamente y colocado en viales criogénicos. Las muestras fueronrápidamente congelado en nitrógeno líquidopara2 horasantes de ser transferido a un-80 congelador de gradoPara el almacenamiento [7].

1.2 Métodos experimentales

1.2.1 Establecimiento de la curva estándar y la determinación del contenido de polisacárido

A 10 mgmuestra deEstándar D-glucosafue pesado y disuelto con precisión en unFrasco volumétrico de 100 mlcon agua destilada para preparar un100 ug · ml⁻¹ solución madre. Soluciones de calibración de{{{0}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 7, 0. 8 y 0.9 mlde la solución madre se transfirieron a10 ml de tubos de ensayo tapados, diluido con agua para1. 0 ml, y luego mezclado con1. 0 ml de 6% de solución de fenoly5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Después de vórtice, las soluciones se calentaron en un baño de agua hirviendo para20 minutos, luego se enfrió en un baño de agua de hielo para10 minutos. A control en blancofue preparado usando1. 0 ml de agua destiladaen lugar de la solución de glucosa. La absorbancia se midió en482 nmusando unEspectrofotómetro UV-vis, y uncurva estándarfue generado conconcentración (x) como el eje horizontalyabsorbancia (y) como el eje vertical.

Después de un enfoque modificado desdeLi Jie et al. [8], 0. 2 g de secadoCistanchepolvofue pesado con precisión y colocado en unTubo de ensayo de 20 ml de tapón. 10 ml de 80% de etanolse agregó y la mezcla fue sometida aExtracción ultrasónica a 80 grados (100 W, 40 kHz) durante 30 minutos. El extracto se filtró mientras estaba caliente y el procedimiento se repitió una vez. Después de secar el residuo,10 ml de agua destiladase agregó y la extracción ultrasónica se repitió dos veces. Los filtrados se combinaron y se diluyeron para20 mlcon agua destilada.1. 0 ml de esta soluciónse diluyó más a10 mlcon agua destilada.

A 1. 0 ml alícuotade lo preparadoCistancheLa solución de muestra se analizó utilizando el mismo procedimiento que el estándar de glucosa. La absorbancia en482 nmse midió y el contenido de polisacárido deCistanchese calculó de diferentes plantas huésped.

1.2.2 Extracción de ARN, construcción de la biblioteca de ADNc y secuenciación

Se extrajo el ARN total deDesérticola de Cistanchemuestras parasitarHaloxylon ammodendroyAtriplex canescensusando elKit de ARN Tiangen DP441 (China), siguiendo elProtocolo de reactivo Trizol. La pureza de ARN se evaluó con unEspectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, EE. UU.), mientras que la concentración de ARN y la integridad se evaluaron utilizando unAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, EE. UU.).

Las bibliotecas de transcriptoma se construyeron utilizando elKit de preparación de la biblioteca de V6 V6 V6 V6. Después de control de calidad con elAgilent 2100 Bioanalyzer, las bibliotecas fueron secuenciadas en elPlataforma Illumina Novaseq 6000, generandoLecturas de extremo emparejado de 150 pb.

1.3 Análisis de datos

1.3.1 ensamblaje del transcriptoma y anotación funcional

Lecturas crudas enFormato FASTQfueron procesados ​​utilizandoTrimmomáticopara eliminarLecturas de Tloy-N y lecturas de baja calidad, Resultando enLecturas limpias. Se eliminaron secuencias adaptadoras y regiones de baja calidad, y las lecturas limpias se ensamblaron encontigs(etiquetas de secuencia expresadas) usandoSoftware de Trinity. La transcripción más larga de cada clúster se seleccionó como ununigenoPara un análisis posterior.

La anotación funcional de unigenes se realizó comparándolos con elBase de datos de proteínas no redundante (NR) NCBI, Swiss-Prot, y la genealogía evolutiva de los genes: base de datos ortólogas no supervisadas (huevo de huevo).usandoSoftware de diamante (valor electrónico <1e -5). Anotación de grupos ortólogos eucariotas (KOG)se realizó para identificar genes homólogos. Además, los unigenes fueron mapeados paraKyoto Enciclopedia de rutas de genes y genomas (KEGG)para la anotación de la vía metabólica.Clasificación de ontología genética (GO) y anotación funcionalse realizaron utilizando asignaciones de la base de datos Swiss-Prot.

1.3.2 Análisis e identificación de la expresión génica de unigenes (DEG) expresados ​​diferencialmente

Los niveles de expresión génica se cuantificaron usandoPajarita2para alinear las lecturas limpias con unigenes. Los valores de expresión se calcularon comoFragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas (FPKM)usandosoftware expreso. El análisis de expresión diferencial se realizó usandoSoftware DESEQ2, conPruebas de distribución binomial negativa (NB)utilizado para pruebas de significación. Los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) se definieron como aquellos conQ-Value <0. 05yCambio de pliegue (FC)> 2.

1.3.3 Validación de QRT-PCR de genes expresados ​​diferencialmente

Genes enzimáticos clave involucrados enbiosíntesis de polisacáridoconexpresión diferencial significativafueron seleccionados paraValidación cuantitativa de PCR en tiempo real (QRT-PCR). Las muestras de ARN se verificaron de calidad y los valores de OD se midieron antes de la transcripción inversa. La síntesis de ADNc se realizó utilizando elSupermix de síntesis de ADNc de primera cadena transscript para el kit QPCR. El ADNc sintetizado se diluyó10- pliegue, y QRT-PCR se realizó utilizando unsistema fluorescente QPCRbajo diferentes condiciones de ciclismo.ACTB (beta-actina) se utilizó como un gen de referencia internoy los niveles relativos de expresión génica se calcularon utilizando elMétodo 2⁻ΔΔCt.

 

Tabla 1 secuencias de imprimación

Identificación génica	Nombre del gen	Primer delantero (5 '-3')	Primer inverso (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ I 1_2	GMPP	Gatagtggctaacatccactt	Cctcctcttcgtcgtaggattc
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ I 17_2	PFP	Tatatgggaccatggaaccaa	Gaccataggcgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ I 4_1	UGDH	Aaagatcttccagttcgtaagc	AccAattcgttgatgctacc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ I 6_1	lacz	Gtctccttgttattcgtgaggat	Gtcgatggtggtgaagcagat
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ I 1_1	saca	Ttacgaggatagtgaggtgcta	Aatggaagatgaggaggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ I 4_2	lacz	Ggcacagtcaaggagtacgatg	Cactggcatcgacgaggaaag
-	ActB	Caatggatgatgatatcgccgcgt	Cactggcatcgacgaggaaag

 

 

1.4 Análisis de datos

Análisis de agrupación jerárquica degenes expresados ​​diferencialmente (DEG)se realizó usandoR (v3.2.0)Para visualizar los patrones de expresión génica en grupos y muestras. Análisis de enriquecimiento de GO (Gene Ontology)Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG (Kyoto Enciclopedia de genes y genomas)se realizaron utilizandoR, basado en eldistribución hipergeométrica. Los términos funcionales significativamente enriquecidos se mostraron utilizandoGráficos de barras, parcelas de burbujas y parcelas de círculo de enriquecimiento.

2 resultados y análisis

2.1 Resultados de la determinación del contenido de polisacárido

La ecuación de regresión lineal obtenida de las mediciones de absorbancia fue:

y {{{0}}. 0 154x - 0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154X - 0. 1636 \ quadr (R^2=0. 9963) y =0. 0154X - 0.1636 (r 2=0. 9963)

con un rango lineal de20–90 ug · ml⁻¹. La precisión, la repetibilidad, la estabilidad y la tasa de recuperación de la muestra fueron{{{0}}. 38%, 0. 86%, 0.53%y 99.67%, respectivamente.

El medidacontenido de polisacáridoenDesérticola de CistancheLas muestras de diferentes plantas huésped fueron:

Haloxylon-Cistanche: 6.51%

Atriplex-Cistanche: 11.83%

2.2 Secuenciación del transcriptoma y ensamblaje de datos

Secuenciación del transcriptoma deseis muestrasgeneró un total de41.77 g de datos limpios. Los datos válidos por muestra variaron desde6.89 g a 7.04 g, conPorcentajes base Q30 entre 95.38% y 95.91%, y unContenido promedio de GC de 45.13%.

Un total de61,423 unigenesfueron ensamblados, con una longitud total de65,962,858 BPy unLongitud promedio de 1.073.91 BP.

2.3 Anotación funcional de genes

Un total de61,423 unígenesse obtuvieron de la secuenciación deDesérticola de Cistanchemuestras parasitando dos plantas huésped diferentes. Los resultados de la anotación son los siguientes:

30,689 unigenes (49.96%)fueron anotados en elBase de datos de proteínas NR (no redundante).

18,698 unígenes (30.44%)fueron anotados en elBase de datos Swiss-Prot.

3.998 unigenes (6.51%)fueron anotados en elBase de datos KEGG.

17,188 unigenes (27.98%)fueron anotados en elBase de datos Kog (Grupos ortólogos eucariotas).

25,280 unígenes (41.16%)fueron anotados en elPada de huevo (Genealogía evolutiva de genes: base de datos no supervisada de grupos ortólogos).

16,210 unigenes (26.39%)fueron anotados en elBase de datos GO (Gene Ontology).

16,153 unigenes (26.30%)fueron anotados en elBase de datos PFAM (Familias de proteínas).

Entre estos,21,650 unígenesfueron más largos que1 kb.

Análisis de homología basado en elBase de datos NRreveló que las tres especies más relacionadas más relacionadas fueron:

Paulownia Fortunei (30.23%)

Phtheirospermum japonicum (14.15%)

Chenopodium quinua (7.1%)

 

 

Tabla 2 Información de anotación deDesérticola de CistancheFunción génica

Base de datos	Número de gen de anotación	Proporción (%)
Nr	30,689	49.96
Protuberancia suiza	18,698	30.44
Kegg	3,998	6.51
Kog	17,188	27.98
ponche de huevo	25,280	41.16
IR	16,210	26.39

 

 

2.4 anotación funcional y clasificación de KEG y KEGG

ElBase de datos GO (Gene Ontology)se usó para anotar más a fondo los unigenes identificados en elBase de datos NR, resultando en un total de16,210 unigenes. Estos unigenes se clasificaron enTres grupos funcionales principales:

Proceso biológico (BP)

Función molecular (MF)

Componente celular (CC)

En elCategoría de proceso biológico (BP), los grupos unigene más abundantes fueron:

"Proceso celular" (11,023 unígenes)

"Proceso metabólico" (9,117 unigenes)

Para elCategoría de componente celular (CC), 17 subcategoríasfueron identificados, con cada subcategoría que contiene al menos30 unígenes. Los grupos más grandes fueron:

"Celúla" (13,947 unígenes)

"Parte celular" (13,918 unígenes)

En elCategoría de función molecular (MF), los grupos funcionales más enriquecidos fueron:

"Vinculante" (10,039 unigenes)

"Actividad catalítica" (8.490 unigenes)

Fig.2 Anotación funcional y clasificación de unigenes

 

Anotación funcional de KEGG y clasificación

Durantesecuenciación del transcriptoma, un total de3.998 unigenesfueron anotados en elBase de datos KEGG (Kyoto Enciclopedia de genes y genomas). Estos unigenes se clasificaron enSeis categorías principales, con sus respectivos conteos y proporciones unigene de la siguiente manera:

Procesos celulares: 326 unigenes (8.15%)

Procesamiento de información ambiental: 299 unigenes (7.47%)

Procesamiento de información genética: 1.771 unigenes (44.30%)

Enfermedades humanas: 14 unigenes (0.35%)

Metabolismo: 1.465 unigenes (36.64%)

Sistemas organismales: 123 unigenes (3.07%)

Estas seis categorías principales se dividieron aún más en20 niveles de clasificación secundaria. Entre ellos,Procesamiento de información genéticatuvo la mayor proporción, seguido deMetabolismo. Dentro delMetabolismoCategoría, las vías más abundantes fueron:

Metabolismo de carbohidratos

Metabolismo de los ácidos grasos

Metabolismo flavonoide

Fig.3 Anotación de la vía metabólica Kegg de unigenes

 

2.5 Expresión génica diferencial y análisis de enriquecimiento deDesérticola de Cistanchede diferentes anfitriones

Los datos de secuenciación del transcriptoma se filtraron utilizando elCriterios de selección de expresión diferencial predeterminada, resultando en la identificación de14.089 genes expresados ​​diferencialmente (DEG):

6.576 genes estaban al alza

7.513 genes fueron regulados negativamente

A trama de volcánse generó para visualizar la distribución general de los DEG.

En elTop 30 GO enriquecimiento de clasificaciones funcionalesde los degs, se observó que:

En comparación conProceso biológico (BP)yComponente celular (CC)categorías,Función molecular (MF)exhibió un enriquecimiento de DEG más significativo.

Los degs enriquecidos más notablemente se asociaron conMetabolismo del ácido nucleico, metabolismo de proteínas y enzimas clave en el metabolismo de la galactosa.

Además, los DEG se enriquecieron significativamente enTérminos GO relacionados con el metabolismo del polisacárido, incluido:

Proceso metabólico de almidón

Proceso biosintético de glucógeno

Proceso catabólico de sacarosa

Actividad de glucosidasa

Actividad de UDP-L-Rhamnose sintasa

Actividad de polisacárido hidrolasa

Fig.4 Mapa volcánico de genes expresados ​​diferencialmente

 

Análisis de enriquecimiento de la vía de Kegg de DEG enDesérticola de Cistanchede diferentes anfitriones

Para investigar más a fondo elgenes expresados ​​diferencialmente (DEG)enDesérticola de Cistanchede diferentes plantas anfitrionas,Análisis de enriquecimiento de la ruta Keggfue realizado. El análisis reveló que:

Los degs se mapearon a 117 vías metabólicas.

ElTop 20 caminospresentadoEnriquecimiento significativo del DEG, con las vías más enriquecidas que incluyen:

Metabolismo de los ácidos grasos

-Lafonsolismo del ácido lineolénico

Metabolismo de la galactosa

Degradación de lisina

Un análisis de enriquecimiento adicional delTop 20 categorías metabólicas con los valores Q más pequeñosindicó que los DEG se enriquecieron significativamente en:

Sistemas organismales

Metabolismo

Procesamiento de información genética

Entre estas categorías,"Metabolismo"tenía el mayor número de DEG enriquecidos y mostró el enriquecimiento más significativo. Además, en las vías metabólicas enriquecidas, laLa proporción de unigenes regulados al alza y regulados hacia abajo era casi igual.

Estos hallazgos sugieren queLas vías metabólicas juegan un papel crucialen la expresión génica diferencial deDesérticola de Cistanchede diferentes plantas anfitrionas, particularmente enMetabolismo de lípidos, carbohidratos y aminoácidos.