Mejora de la proteómica de arriba hacia abajo del tejido cerebral con FAIMS Parte 3

Una observación inmediata y aparente es que cuanto mayor es el percentil de abundancia, mayor es la probabilidad de identificación con TDP. En otras palabras, el TDP identifica principalmente proteínas muy abundantes.

A medida que envejecemos, muchas personas descubren que su memoria ha disminuido. Este es un fenómeno común, especialmente después de haber experimentado estrés mental prolongado, falta de sueño y dietas desequilibradas.

¿Pero sabías que una forma de ayudarnos a mejorar nuestra memoria es aumentar la ingesta de proteínas en alta abundancia? La proteína de alta abundancia es rica en aminoácidos, que pueden sintetizar una molécula llamada neurotransmisor en el cerebro y también promover el crecimiento y la actividad de las neuronas. Las neuronas son las unidades más básicas del cerebro y son la clave de nuestras capacidades de aprendizaje y memoria. Por tanto, una gran cantidad de proteínas puede mejorar nuestra memoria potenciando la función de las neuronas.

La investigación también ha demostrado la relación entre las proteínas y la memoria. Por ejemplo, un estudio encontró que, en comparación con una dieta alta en proteínas, una dieta baja en proteínas provocaba una disminución de la función cerebral, incluidas la atención y la memoria.

Así que, si quieres mejorar tu memoria, también puedes añadir a tu dieta algunos alimentos ricos en proteínas, como pollo, pescado, ternera, huevos, tofu, etc. Por supuesto, también debes prestar atención al equilibrio. y diversidad de tu dieta, y no puedes comer sólo un tipo de alimento.

En definitiva, una alta abundancia de proteínas puede ayudar a mejorar nuestra memoria. Si desea tener una mejor memoria, ¡también puede comenzar con su dieta e intentar comer tantos alimentos ricos en proteínas como sea posible! Esto demuestra que necesitamos mejorar nuestra memoria, y Cistanche puede mejorar significativamente la memoria porque también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento, que son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro obtenga suficiente nutrición y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Aproximadamente la mitad de los genes identificados en los conjuntos de datos de arriba hacia abajo (con o sin FAIMS) estaban contenidos dentro del 20% superior de los contenedores de abundancia para el análisis ascendente (Figura 6A). Por el contrario, solo se pudieron encontrar 71 genes en los conjuntos de datos de arriba hacia abajo (contenedor "NA") (Figura 6A).

Estos genes parecían representar proteínas relativamente cortas (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis. 

Por ejemplo, en el contenedor de arriba hacia abajo se incluyeron proteínas histonas como H3C1, H4C1, H1–4 y H2BC12. Como se anticipó, descubrimos que FAIMS podría mejorar las identificaciones en percentiles de menor abundancia que "Sin FAIMS", aumentando la profundidad. del proteoma observable.

Al determinar la proporción de FAIMS a "No FAIMS" en todos los percentiles, se hace evidente un aumento apreciable en las identificaciones por debajo del percentil 40 dentro de los CV en el rango de −40 a −50 (Figura 6B).

Sin embargo, al considerar el número absoluto de genes, la principal contribución de la ventaja de FAIMS es la ampliación del espectro de identificaciones en todos los percentiles de abundancia.

Relación entre FAIMS CV y ​​Transmisión de Proteoformas

Con FAIMS, también notamos una tendencia entre FAIMS CV y ​​el peso molecular del proteoformo (Figura 7). A −50 CV, la masa proteoforme mediana es de ~5 kDa y aumenta a ~15 kDa a −20CV.

Según estas distribuciones de masa (Figura 7), los CV inferiores a −50 V parecen muy adecuados para experimentos proteómicos de arriba hacia abajo o de abajo hacia arriba, mientras que los CV superiores a −50 V pueden beneficiar mejor a los experimentos peptidómicos o ascendentes.

La tendencia observada en el peso molecular presumiblemente se extiende más allá de -20 CV; sin embargo, restringimos nuestra búsqueda a −20 CV en función de la disminución en las identificaciones de genes y proteoformas, lo que condujo a rendimientos decrecientes en la cobertura de la secuencia del proteoma por ejecución.

Debemos tener en cuenta que un trabajo anterior que utilizó FAIMS encontró que +40 CV era el voltaje ideal para transmitir una cadena pesada de mAb del NIST (~51 kDa) y −20 CV era el mejor para la cadena ligera correspondiente (~23 kDa), lo que respalda la idea. que la tendencia que observamos se extiende a CV FAIMS positivos.45

Curiosamente, aunque muchos espectros que identificaban una sola proteoforma se limitaron a encontrarse dentro de un rango de 10 V (3599 de 5165), se observaron siete proteoformas en todo el rango de CV de −50 a −20. Presumiblemente, esto puede atribuirse a su gran abundancia en la muestra, particularmente en el caso de la ubiquitina (UBB), la proteína básica de mielina y la proteína de unión a acilCoA.

Sin embargo, también es probable que los diferentes estados de carga de estas proteoformas adopten varias conformaciones en fase gaseosa dependiendo de su isomerización de protones, impactando sus movilidades.42

Estas siete proteoformas nos permitieron investigar cómo la envolvente del estado de carga se transmite diferencialmente a través de la modulación de CV. Como indicador de la distribución del estado de carga en cada CV, utilizamos el estado de carga medio basado en las coincidencias de espectro de proteoformas (PrSM) identificadas en cada CV y ​​rastreamos cómo este valor cambió en función del CV a partir de −50 CV.

Los escaneos de MS1 en la Figura S3 demuestran cómo el estado de carga medio de PrSM rastrea la distribución del estado de carga de UBB. De estas siete proteoformas, cuatro siguieron una relación inversa, con el estado de carga observado medio aumentando a medida que el CV disminuía (Figura 8).

Vale la pena señalar que esta tendencia generalmente se ha observado con péptidos y proteínas pequeñas.56,62–64 Sorprendentemente, tres proteoformas mostraron la relación opuesta donde la disminución del CV disminuyó los estados de carga medios observados (Figura 8).

Un examen superficial de la masa media de precursores entre los dos grupos sugiere que es más probable que los precursores más grandes favorezcan estados de carga más altos a medida que el CV disminuye.

Para validar aún más estas relaciones, ampliamos este análisis para incluir proteoformas que se identificaron dentro de un rango más modesto, pero aún amplio, de 20 a 30 CV (n=256 proteoformas). Aquí, las proteoformas cuya carga mediana se desplazó más de una carga a través de toda la gama CV se dividió en dos grupos diferentes dependiendo de la dirección de ese cambio.

Aquellos que cambiaron menos de un cargo fueron considerados "neutrales" en cuanto al cambio de CV. De manera similar a los resultados anteriores, los precursores más grandes tenían significativamente más probabilidades de estar asociados con una relación inversa entre los estados de carga observados y el CV (Tabla S2).

Con un CV decreciente, la mayoría de las proteoformas parecían transmitirse en estados de carga más bajos (n=177) en comparación con aquellas que favorecían estados de carga más altos (n=39). El resto (n=40) se consideró "neutral" con respecto a los cambios en el CV.

Las proteoformas agrupadas dentro del grupo neutro demostraron una masa precursora promedio entre los grupos inverso y directo, lo que sugiere una vez más que la masa de la proteoforma está intrínsecamente ligada a este comportamiento.

Sin embargo, otros parámetros primarios basados ​​en secuencias, como la composición de aminoácidos básicos/ácidos y el índice alifático, no se correlacionaron significativamente (Tabla S2).

Aunque las proteínas que se introducen en la fase gaseosa presumiblemente están desnaturalizadas, los factores típicamente asociados con las proteínas nativas, como el momento dipolar o la sección transversal de colisión, pueden tener un mejor valor predictivo de este fenómeno.64–66 Nuestros resultados demuestran cómo se puede utilizar el CV para filtrar proteínas de diferentes masas y cómo la envoltura del estado de carga de una proteína también se puede transmitir diferencialmente a través de FAIMS.

Utilidad de fragmentos de proteínas en experimentos de TDP

Sorprendentemente, un número significativo de proteoformas que identificamos eran fragmentos de proteínas más grandes. Descubrimos que sólo el 25% de las proteoformas únicas identificadas cubrían más de la mitad de la secuencia de la proteína de la que derivaban.

Este 25% tenía una masa media de 11,4 kDa frente al 75% restante que tenía una masa media de 5,7 kDa. Varios factores pueden contribuir a esta observación, algunos de los cuales son independientes del FAIMS.

Por ejemplo, estos fragmentos en sí mismos pueden ser productos de escisión proteolítica producidos en condiciones homeostáticas normales como parte del "degradoma" celular,67 o a pesar de las diversas precauciones tomadas, introducidas durante el intervalo post-mortem y la manipulación de la muestra.

El tejido del sistema nervioso central es una rica fuente de péptidos de señalización conocidos como "neuropéptidos" que comúnmente también se derivan de proteínas precursoras mucho más grandes.68

Al cruzar nuestras identificaciones de proteoformas con una base de datos de neuropéptidos establecida (NeuroPedia),69 pudimos identificar varios de estos neuropéptidos, incluidos vasostatina-1, secretoneurina, colecistoquinina-58 desnonopéptido y neuropéptido y, y muchas variantes de secuencia no canónicas. derivado de los genes productores de neuropéptidos conocidos.

Más allá de los factores biológicos, ciertos parámetros del instrumento también pueden influir en la observación de fragmentos de proteínas. Por ejemplo, normalmente se pueden utilizar voltajes bajos de "fragmentación" en la fuente (entre 10 y 20 V) para eliminar aductos y desolvatar iones de proteínas, mientras que voltajes más altos pueden producir disociación inducida por la fuente.

Sin embargo, la susceptibilidad de los enlaces amida a la disociación puede variar ampliamente y, a medida que aumenta el tamaño de una proteína, también aumenta la probabilidad de que contenga enlaces amida lábiles como el Xaa-Pro.70-73 Como se pueden producir iones b e y sin darse cuenta a través de esta mecanismo, incluso con voltajes de fuente bajos, decidimos evitar aplicar voltaje de fuente para reducir la posibilidad de introducir iones fragmentados en el instrumento.

También es posible que las proteínas sean susceptibles a eventos de fragmentación cuando pasan a través de los campos eléctricos creados en FAIMS. Sin embargo, no se esperaría que estos fragmentos tuvieran la misma movilidad que el ion precursor, con la salvedad de que esto probablemente también dependa del tamaño del fragmento en relación con el ion precursor.

Finalmente, vale la pena señalar algunos factores que pueden sesgar la observación de proteoformas más pequeñas (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74 

Esta propagación de la señal se puede atribuir en gran medida a la envolvente del estado de carga y a las distribuciones isotópicas de cada estado de carga. Específico de nuestra configuración experimental fue el uso de un filtro MWCO de tamaño 3K como paso de filtración final en nuestra preparación de muestras, que en este caso se eligió para garantizar que las proteoformas beta amiloideas más pequeñas pudieran capturarse de manera eficiente si estuvieran presentes.

Los factores instrumentales generales también pueden crear un sesgo hacia proteoformas pequeñas, incluida la sintonización del cuadrupolo, la captura electrodinámica y las colisiones con moléculas de gas residuales en la celda Orbitrap que conducen a una descomposición más rápida del transitorio para moléculas más grandes.75 Independientemente de estos sesgos o del origen exacto de los fragmentos, todavía pueden proporcionar información sobre el proteoma.

Estos fragmentos son particularmente útiles en el contexto de enfermedades neurodegenerativas donde las alteraciones de la proteostasis suelen estar relacionadas con la patología.76,77

De hecho, a menudo se ha descubierto que los fragmentos de tau son neurotóxicos y desempeñan un papel en la progresión de tauopatías como la EA.23-26 Generalmente, los fragmentos que observamos son mucho más grandes que los péptidos trípticos, y en varios casos en los que hay muchos fragmentos para una proteína particular , observamos una cobertura de secuencia considerable.

Esto se ejemplifica examinando los fragmentos que proporcionan cobertura para la cadena tubulinalfa-1B de ~50 kDa (TUBA1B) y la sinapsina-1 de ~70 kDa (SYN1), como se muestra en la Figura 9A, B, ambas grandes. proteínas que de otro modo serían difíciles de observar en su forma completa en el TDP de una muestra compleja.

Identificación de proteoformas relevantes para las enfermedades neurodegenerativas

La utilización de FAIMS con nuestro análisis de arriba hacia abajo permitió la identificación de varias variantes de empalme Swiss-Prot y entradas TrEMBL únicas, con 267 variantes de empalme únicas y 96 entradas TrEMBL (Tabla S3).

En particular, observamos múltiples PrSM que identifican sin ambigüedades una isoforma ORF alternativa (A{{0}}A0D9SF30) para la molécula de adhesión de células neurales 1 (NCAM1). También observamos proteoformas derivadas de genes que tienen funciones conocidas en varias enfermedades neurodegenerativas, en particular -sinucleína y PARK7.

En ambos casos, las proteoformas predominantes contienen la secuencia completa. Curiosamente, se encontró que la mayoría de los PrSM de -sinucleína, sinucleína y (en menor medida) -sinucleína contenían un cambio de masa desconocido de ~177 Da cerca del extremo C (espectro de -sinucleína de longitud completa con modificación desconocida, como se muestra en la Figura S4A). .

Este cambio de masa se ha observado previamente en búsquedas en bases de datos abiertas y generalmente se encuentra en Asp o Gluresidues.78 Una posible explicación que coincide estrechamente con la masa promedio y monoisotópica de la modificación consiste en un oxígeno con tres átomos de hierro, así como la pérdida de siete átomos de hidrógeno ( basado en el acceso a Unimod #1971).

La comparación de los picos isotópicos de un fragmento de ion 242+ de -sinucleína (Figura S4B) con un espectro simulado que contiene los elementos antes mencionados que se cree que pertenecen a la modificación desconocida (Figura S4C) demuestra la similitud entre las dos distribuciones isotópicas. con muchos de los picos teisotópicos alineándose con una diferencia de 2 ppm entre sí.

También se debe señalar que los picos isotópicos más a la izquierda son exclusivos de los isótopos de hierro naturales, y la ausencia de estos picos es fácilmente evidente cuando se simula el espectro sin contener los tres átomos de hierro (Figura S4D), lo que sugiere fuertemente que esta modificación desconocida es muy probable. de los elementos propuestos.

Estudios previos también han descrito la alta afinidad de la -sinucleína por varios iones metálicos, y la región que observamos que contiene esta modificación se superpone con residuos que se sabe están involucrados en la unión, específicamente el motivo 119DPDNEA124 (Figura S5).79–81

Nuestros datos también sugieren que las regiones C-terminales de -sinucleína y -sinucleína tienen funciones similares en la unión de metales, ya que múltiples espectros con el mismo cambio de masa desconocido se emparejaron con secuencias similares dentro de estas proteínas.

Acerca de la proteína mitocondrial PARK7, notamos un cambio de masa de ∼116.0 Da en su único residuo Cys del sitio activo, C106 (Figura S6). Una posible explicación con una succinilación delta massis similar, una modificación que se atribuye al estrés mitocondrial y se forma debido a la adición de fumarato por parte de Michael a un grupo Cys tiol.82

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