El ejercicio en cinta rodante previene la disminución del aprendizaje espacial y la memoria en ratones 3 × Tg-AD mediante la mejora de la plasticidad sináptica estructural del hipocampo y la corteza prefrontal, parte 2

2.5. Transferencia occidental

Los ratones fueron anestesiados mediante inhalación de isoflurano y decapitados. Los tejidos del hipocampo o la corteza prefrontal se lisaron en un tampón de lisis RIPA frío (Thermo ScientificPierce, Waltham, MA, EE. UU.) complementado con un cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (Roche, Indianápolis, IN, EE. UU.).

Los tampones de lisis permiten a los investigadores de los laboratorios biológicos controlar mejor las condiciones experimentales, estudiando mejor el crecimiento y los cambios de las células, lo que desempeña un papel importante en la investigación académica y médica.

Además de ser útiles para la investigación, los tampones de lisis también pueden tener un impacto positivo en la mejora de la memoria humana. Según las últimas investigaciones, los componentes químicos ricos en tampones de lisis pueden ayudar a promover el crecimiento y desarrollo de las células nerviosas, mejorando así la memoria del cerebro.

Un estudio encontró que ciertos componentes de los amortiguadores de lisis pueden promover la transmisión de señales entre ciertas células nerviosas, mejorando así las capacidades de aprendizaje y memoria del cerebro. Además, estos componentes pueden estimular el crecimiento de las células nerviosas y ayudar al cerebro a adaptarse mejor a nuevos entornos y nuevos aprendizajes. El resultado de estos efectos es que las personas pueden captar mejor los nuevos conocimientos y recordarlos durante más tiempo.

Por supuesto, los buffers de lisis por sí solos no pueden resolver mágicamente todos los problemas de memoria. Los científicos aún necesitan realizar más investigaciones sobre cómo utilizar estos hallazgos para mejorar la memoria humana. Sin embargo, el significado positivo de este descubrimiento ya está muy claro: los tampones de lisis pueden ser un buen comienzo para mejorar la memoria humana y ofrecer más posibilidades para futuros trabajos de investigación científica. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche es un material medicinal tradicional chino con muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. El efecto de Cistanche proviene de los diversos ingredientes activos que contiene, incluidos ácido tánico, polisacáridos, glucósidos flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro de varias maneras.

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La proteína total se midió utilizando el ensayo BCA (Thermo Scientific Pierce, EE. UU.). Las muestras se calentaron a 100 ◦C durante 15 min. Para Westernblot, se cargaron cantidades iguales de proteína (20 ug/pocillo) en un gel al 12%. Después de la electroforesis y la transferencia a membranas de PVDF (Millipore, IPVH00010, Burlington, MA, EE. UU.), se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con un tampón de bloqueo (tampón BSA al 5%).

Las membranas de PVDF se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario (GAPDH, 1:10,000, Abcam, Boston, MA, EE. UU.; PSD95, 1:500, Abcam, EE. UU.; Syn, 1:500, Abcam, EE. UU.) .

Luego se lavaron con un tampón TBST tres veces a intervalos de 5 minutos y se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con HRP o anti-ratón de cabra conjugado con HRP (1:15, 000, Proteintech Group, Rosemont , IL, EE. UU.), seguido de lavados TBST a intervalos de 5 minutos.

Los niveles de proteína se detectaron con reactivos quimioluminiscentes (ThermoScientific Pierce, Waltham, MA, EE. UU.) y las bandas se midieron utilizando el software Image J.

2.6. Microscopía electrónica

Los ratones se anestesiaron profundamente con hidrato de cloral y se perfundieron transcardialmente con PBS, seguido de una solución de paraformaldehído al 4% y de glutaraldehído al 2,5% en tampón fosfato 0.1 M durante 20 minutos.

Se extrajo el cerebro y se sumergió en el mismo fijador durante la noche. El hipocampo y la corteza prefrontal se tiñeron con tetróxido de osmio al 1% y luego se deshidrataron en una serie graduada de acetona.

Los tejidos se cortaron en secciones ultrafinas, se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron con un microscopio electrónico Hitachi H-7100. Se tomaron fotografías de posiciones aleatorias de estas muestras con un aumento de ×30,000 (22 µm2).

Se supuso que las sinapsis con vesículas redondas, sinapsis asimétricas y un único contacto sináptico grande eran sinapsis excitadoras, mientras que se suponía que las terminales presinápticas con vesículas aplanadas pleomórficas y sinapsis simétricas eran sinapsis inhibidoras [48].

Analizamos el número de presuntos sinapsis excitadoras (22 µm2/cada campo de imagen, Figura 2) en el hipocampo y la corteza prefrontal de cada ratón, y luego promediamos el número de sinapsis de seis campos de imagen del mismo grupo (6 campos de imagen de 4 ratones en cada grupo).

Se cuantificaron y compararon la longitud de la zona activa sináptica, el ancho de la hendidura sináptica, la curvatura de la interfaz sináptica y el espesor de la densidad postsináptica de 12 a 15 sinapsis seleccionadas al azar en 4 ratones por grupo (Figura 3).

La longitud de la zona activa y el espesor de la densidad postsináptica se midieron según Güldner [49]. La hendidura sináptica se definió como la región más brillante entre las membranas pre y postsinápticas [50].

La curvatura sináptica se determinó mediante la fórmula: R=a/2 + b2/8a, donde b es la línea que une los dos extremos del engrosamiento postsináptico y a es la distancia perpendicular desde la membrana postsináptica a b [51 ,52](ver Figura 3A).

Figura 2. El ejercicio en cinta rodante aumenta el número de sinapsis del hipocampo y la corteza prefrontal en ratones 3×Tg-AD. (A) Imágenes representativas de microscopio electrónico del hipocampo y la corteza prefrontal en ratones con control sin Tg, ejercicio sin Tg, control 3 × Tg-AD y ejercicio 3 × Tg-AD.

Las puntas de flecha azules marcan las sinapsis. El cuadro rojo representa una sinapsis ampliada. En el cuadro cuadrado rojo de la parte inferior se muestra una vista ampliada y con gran aumento de las sinapsis en la corteza prefrontal. (B, C) El número de sinapsis del hipocampo (B) y la corteza prefrontal (C) disminuyó significativamente en el grupo de control 3×Tg-AD en comparación con el grupo de control sin Tg (*** p < 0 .001,n=6 secciones de imagen), y esta disminución fue bloqueada por el pretratamiento con ejercicio en cinta rodante tanto en el hipocampo (B) como en la corteza prefrontal (C) (*** p < 0,001, n {{ 9}} secciones de imágenes).

El pretratamiento con ejercicio en cinta rodante aumentó el número de sinapsis del hipocampo (B) y la corteza prefrontal (C) en ratones no Tg (** p < 0.01, n=6 secciones de imagen). Cada conjunto de datos se obtuvo de 4 ratones.

Figura 3. El ejercicio en cinta rodante mejora los parámetros estructurales sinápticos del hipocampo y la corteza prefrontal en ratones 3×Tg-AD. (A) Una medición representativa de los parámetros estructurales sinápticos.

Para determinar la curvatura sináptica se utilizó la fórmula R=a/2 + b2/8a, donde b es la línea que une los dos extremos del engrosamiento postsináptico y a es la distancia perpendicular desde la membrana postsináptica a b.

(B, C) La longitud de la zona activa sináptica del hipocampo (B) y la corteza prefrontal (C) disminuyó significativamente en el grupo de control 3×Tg-AD en comparación con el grupo de control sin Tg (*** p < {{ 3}}.001, n=12–15 sinapsis), y esta disminución fue bloqueada por el pretratamiento con ejercicio en cinta rodante tanto en el hipocampo como en la corteza prefrontal (*** p < { {18}}.001, n=12–15). (D, E) El ancho de la hendidura sináptica del hipocampo (D) y la corteza prefrontal (E) aumentó significativamente en el grupo de control 3×Tg-AD en comparación con el grupo de control sin Tg (*** p < {{ 30}}.001, n=12–15 sinapsis), y este aumento fue bloqueado por el pretratamiento con ejercicio en cinta rodante tanto en el hipocampo (D;** * p < 0.001, n=12–15 sinapsis) y corteza prefrontal (E; ** p < 0,01, n=12–15). (F, G) La curvatura sináptica del hipocampo (F; *** p < 0,001, n=12–15) y la corteza prefrontal (G; ** p < 0,01, n=12–15 ) disminuyó significativamente en el grupo de control 3×Tg-AD en comparación con el grupo de control sin Tg, y esta disminución fue bloqueada por el pretratamiento con ejercicio en cinta rodante tanto en el hipocampo (F; ** p < 0,01, n=12– 15) y corteza prefrontal (G; *** p < 0,001, n=12–15). (H, I) El grosor de la densidad postsináptica del hipocampo (H) y la corteza prefrontal (I) disminuyó significativamente en el grupo de control 3×Tg-AD en comparación con el grupo de control sin Tg (*** p < 0,001, n {{ 50}}–15), y esta disminución fue bloqueada por el pretratamiento con ejercicio en cinta rodante tanto en el hipocampo (H; ** p < 0,01, n=12–15) como en la corteza prefrontal (I; *** p < 0,001, norte=12–15).

Cada conjunto de datos constaba de 12 y 15 sinapsis de 4 ratones en cada grupo.

2.7. Estadística

El análisis de los datos fue ciego a los genotipos y al historial de tratamiento de los ratones. Los datos se presentan como la media ± SEM. Los conjuntos de datos se compararon con ANOVA de dos factores seguido del análisis post hoc de Tukey. Los análisis post hoc se realizaron sólo cuando ANOVA arrojó un efecto principal significativo o una interacción significativa entre los dos factores. Los resultados se consideraron significativos en p < 0.05.

3. Resultados

3.1. El ejercicio en cinta rodante evitó la disminución del aprendizaje espacial y la memoria en ratones 3 × Tg-AD

Primero intentamos determinar si los ratones 3×Tg-AD de seis meses de edad presentaban deterioro del aprendizaje espacial y la memoria y si el tratamiento previo con ejercicio en cinta rodante prevenía la disminución del aprendizaje espacial y la memoria en ratones 3×Tg-AD de seis meses de edad.

Los ratones control sin Tg y los ratones 3×Tg-AD recibieron 12 semanas de ejercicio en cinta rodante o tratamiento de control sin ejercicio comenzando a los tres meses de edad (diseño factorial 2 × 2: genotipo versus ejercicio).

Después de la 12-semana de entrenamiento, se utilizó la prueba del laberinto radial de ocho brazos para investigar el aprendizaje espacial y la memoria de los ratones. Se midieron tanto la memoria de trabajo (la capacidad de recordar durante un período relativamente breve) como la memoria de referencia (memoria de información que se mantiene constante a lo largo del tiempo) (la diferencia entre la memoria de trabajo y la de referencia se describe en la Sección 2, Figura 1A).

El ANOVA de dos vías mostró que el genotipo y el ejercicio en cinta rodante tuvieron efectos significativos sobre el porcentaje de errores de la memoria de trabajo en el día 5 (genotipo: F1,39=8.6, p=0.006; ejercicio en cinta rodante: F1,{{ 8}}.5, p=0.024; interacción genotipo × ejercicio en cinta rodante: F1,39=4.2, p=0.047) y día 6 (genotipo:F1; ,39=6.1, p=0.019; ejercicio en cinta rodante: F1,39=6.4, p=0.016; }}.6, p=0.039; Figura 1B) de la sesión de adquisición.

Las pruebas post hoc de Tukey indicaron que el porcentaje de errores de la memoria de trabajo aumentó significativamente en el grupo de control 3×Tg-AD en comparación con el grupo de control sin Tg (tanto el día 5 como el día 6: p < 0.01; Figura 1B ).

El aumento en el porcentaje de errores de la memoria de trabajo se evitó mediante tratamientos previos con ejercicios en cinta rodante (tanto el día 5 como el día 6: p < 0.01; Figura 1B). Sin embargo, un ANOVA de dos vías encontró que el genotipo y el ejercicio en cinta rodante no tuvieron efectos significativos sobre el porcentaje de errores de memoria de referencia (p. ej., día 10, genotipo: F1,39=0.2, p=0.6; cinta rodante). ejercicio: F1,39=0.04, p=0.8; interacción genotipo × ejercicio en cinta rodante: F1,39=0.873,p=0.4; los 10 días de la sesión de adquisición.

En conjunto, estos resultados sugieren que los ratones 3×Tg-AD de seis meses de edad exhibieron una memoria de trabajo espacial deteriorada pero no la memoria de referencia, y el ejercicio en cinta rodante previene una disminución en la memoria de trabajo espacial en los ratones 3×Tg-AD.

3.2. El ejercicio en cinta rodante aumentó el número de sinapsis y mejoró los parámetros estructurales sinápticos del hipocampo y la corteza prefrontal en ratones 3 × Tg-AD

Para investigar si la reducción inducida por el ejercicio en cinta rodante en el aprendizaje espacial y la memoria se asoció con la plasticidad sináptica estructural, cuantificamos el número de sinapsis y los parámetros estructurales sinápticos del hipocampo y la corteza prefrontal que son críticos para transmitir información relacionada con el aprendizaje y la memoria (Figura 2A).

El ANOVA bidireccional reveló que el genotipo y el ejercicio en cinta rodante tuvieron efectos significativos en el número de sinapsis en ambos hipocampos (genotipo: F1,23=59.3, p < 0.0{{9} }1; ejercicio en cinta rodante: F1,23=51.{{20}}, p < 0.001; interacción genotipo × ejercicio en cinta rodante: F1,23=5.7, p=0.027; Figura 2B) y corteza prefrontal (genotipo: F1,23=48.6, p < 0,001; ejercicio en cinta rodante: F1,23=59.8, p < 0,001; genotipo × interacción con el ejercicio en cinta rodante: F1,23=8.5,p=0.009; Las pruebas post hoc de Tukey indicaron que los números de sinapsis del hipocampo y la corteza prefrontal disminuyeron significativamente en el grupo de control 3×Tg-AD en comparación con el grupo de control sin Tg (p <0,001; Figura 2B, C).

El pretratamiento con ejercicio en cinta rodante bloqueó una disminución en el número de sinapsis tanto en el hipocampo como en la corteza prefrontal en ratones 3×Tg-AD (p < 0.001; Figura 2B, C).

Mientras tanto, el ejercicio en cinta rodante aumentó el número de sinapsis en el hipocampo y la corteza prefrontal en ratones no Tg (p < 0.01; Figura 2B, C).

Para evaluar más a fondo la eficiencia de la transmisión sináptica, medimos y analizamos los parámetros ultraestructurales mediante microscopía electrónica (EM), incluida la longitud de la zona activa sináptica, el ancho de la hendidura sináptica, la curvatura sináptica y el espesor de la densidad postsináptica en el hipocampo y corteza prefrontal (Figura 3A).

Estudios anteriores han descubierto que la zona activa sináptica más grande es más efectiva para excitar las neuronas postsinápticas, y el acortamiento de la zona activa puede reflejar una condición de eficiencia deficiente de la transmisión sináptica [36].

El ANOVA de dos vías mostró que el genotipo y el ejercicio en cinta rodante tuvieron efectos significativos sobre la longitud de la zona sináptica activa en ambos hipocampos (genotipo: F1,53=10.6, p=0.0{{ 20}}2; ejercicio en cinta rodante: F1,53=5.0, p=0.03; interacción genotipo × ejercicio en cinta rodante: F1,53=9.2, p { {14}}.004; Figura 3B) y corteza prefrontal (genotipo: F1,56=17.4, p < 0,001; ejercicio en cinta rodante: F1,56=5.0, p=0. 03;interacción genotipo × ejercicio en cinta rodante: F1,56=6.8, p=0.012;

Las pruebas post hoc de Tukey indicaron que la longitud de la zona activa sináptica del hipocampo y la corteza prefrontal disminuyó significativamente en el grupo de control 3×Tg-AD en comparación con el grupo de control sin Tg (p < 0.001; Figura 3B, DO).

El pretratamiento con ejercicio en cinta rodante mejoró la longitud de la zona activa sináptica tanto en el hipocampo (p < 0.001; Figura 3B) como en la corteza prefrontal (p=0.001; Figura 3C) en ratones 3×Tg-AD La hendidura sináptica es un espacio estrecho de ~20 nm entre el terminal del axón de la neurona presináptica y la membrana de la neurona postsináptica.

El acortamiento óptimo de la hendidura sináptica puede tener una función adaptativa de optimizar la fuerza sináptica al mejorar la concentración efectiva de neurotransmisores liberados y disminuir la resistencia efectiva a la hendidura [37,38].

El ANOVA de dos vías mostró que el genotipo y el ejercicio en cinta rodante tuvieron efectos significativos sobre el ancho de la hendidura sináptica en ambos hipocampos (genotipo:F1,55=21.5, p < 0.0{ {24}}1; ejercicio en cinta rodante: F1,55=15.1, p < 0,001; interacción genotipo × ejercicio en cinta rodante: F1,55=5.4, p=0.025; y corteza prefrontal (genotipo:F1,53=10.6, p=0.002; ejercicio en cinta rodante: F1,53=5.0, p=0.03; genotipo × cinta rodante interacción de ejercicio: F1,53=9.2, p=0.004;

Las pruebas post hoc de Tukey indicaron que el ancho de la hendidura sináptica del hipocampo y la corteza prefrontal aumentó significativamente en el grupo de control 3×Tg-AD en comparación con el grupo de control sin Tg (p < 0.001; Figura 3D, MI).

El pretratamiento con ejercicio en cinta rodante disminuyó el ancho de la hendidura sináptica tanto en el hipocampo (p < 0.001; Figura 3D) como en la corteza prefrontal (p=0.001; Figura 3E) en ratones 3×Tg-AD.

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