Efectos novedosos de la terapia combinada a través de la inhibición de la piroptosis inducida por caspasa-1/gasdermina D en la nefritis lúpica

Para más información:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang y Jin Lin

RESUMEN

Objetivos: La terapia combinada con micofenolato mofetilo, tacrolimus y esteroides es eficaz para lograr la remisión completa ennefritis lúpica(NL). La terapia combinada reguló a la baja de forma única la caspasa-1 en comparación con las monoterapias, que pueden escindir la gasdermina D (GSDMD) y recientemente se identificó como lapiroptosisverdugo. Por lo tanto, investigamos si la terapia de combinación permitió la supresión de la caspasa-1/GSDMD mediada porpiroptosisen LN (nefritis lúpica).

Click to cistanche deserticola ma para nefritis

Métodos: Se detectó la expresión y activación de GSDMD en especímenes de riñón humano y de ratón con NL (nefritis lúpica) mediante tinción inmunohistoquímica e inmunotransferencia. Los podocitos primarios aislados de ratones MRL1pr se incubaron con LPS más ATP y se pretrataron con monoterapia o terapia combinada. Inhibición de caspasa-1/GSDMD inducidapiroptosispor terapia de combinación se evaluó en ratones MRLlpr y especímenes humanos. Me examinaron con un kit FAM caspasa-1 y citometría de flujo. La correlación entrepiroptosisen sangre periférica y se analizó el índice de actividad de la enfermedad del lupus eritematoso sistémico (SLEDAl).

Resultados: Muestras de tejido renal de LN (nefritis lúpica) los pacientes y los ratones exhibieron niveles de expresión y escisión de GSDMD muy aumentados. En podocitos cultivados, el tratamiento combinado suprimió significativamente la activación de NLRP3 y caspasa-1 y redujo los niveles N-terminales de GSDMD. La terapia de combinación reprimió la progresión de la enfermedad a través de la inhibición de la caspasa-1/mediada por GSDMDpiroptosistanto en humanos como en ratones MRL/LPR. El número de células positivas para caspasa-1/PI en sangre periférica se correlacionó positivamente con SLE-DAl. LN (nefritis lúpica) los pacientes con remisión completa y remisión parcial habían reducido notablemente el número de células positivas para caspasa-1/PI en comparación con el valor inicial. Ac-FLTD-CMK, un inhibidor derivado de GSDMD, impidió el desarrollo de LN (nefritis lúpica).

Conclusión: la terapia de combinación suprimió la caspasa-1/mediada por GSDMDpiroptosisin vitro e in vivo y redujo la progresión de la enfermedad.

Palabras clave:nefritis lúpica, piroptosis, caspasa-1, gasdermina D, terapia

Terapia de tratamiento parapiroptosis

INTRODUCCIÓN

Nefritis lúpica(LN) es la inflamación renal que surge como consecuencia de la enfermedad autoinmune lupus eritematoso sistémico (SLE).LN (nefritis lúpica) es una manifestación importante en pacientes que padecen LES. Alrededor del 60 por ciento de los pacientes desarrollan esta afección, y aproximadamente el 20 por ciento progresa a enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) (1). La terapia combinada con micofenolato mofetilo (MMF), inhibidores de la calcineurina (CNI) y esteroides produce efectos complementarios y también minimiza la toxicidad (2). Esta terapia se recomienda como tratamiento inicial para NL (nefritis lúpica) y produce una mejor eficacia y una remisión más completa en comparación con la ciclofosfamida intravenosa (IVCY) y los esteroides (3-5).

Para investigar los mecanismos moleculares y celulares de la terapia de combinación, se empleó un análisis transcriptómico completo en un modelo murino de LN (nefritis lúpica). Los ratones MRL/LPR recibieron solo MMF, tacrolimus o prednisona como monoterapia o combinaciones de tres fármacos. Perfiles de expresión de genes en riñones de ratones con NL (nefritis lúpica)reveló mecanismos potenciales que podrían explicar los efectos aditivos y sinérgicos de la terapia combinada en comparación con las monoterapias. Uno de los 45 genes regulados a la baja que son modulados únicamente por la terapia de combinación es la caspasa-1 (6). Es activado por los inflamasomas, que son oligómeros multiproteicos compuestos por NLRP3, pro-caspasa-1 y proteína tipo mota asociada a la apoptosis (ASC), con un dominio de afinidad de caspasa integrado. El inflamasoma NLRP3/ASC/caspase-1 ha sido reconocido como un contribuyente clave en la patogenia de la LN (nefritis lúpica). El inflamasoma NLRP3 impulsa los trastornos autoinflamatorios al activar la caspasa-1, iniciando la generación de citocinas proinflamatorias, por ejemplo, IL-1, que se sabe que desencadena la disfunción de los podocitos en LN(7-9).

La caspasa activa-1 escinde la gasdermina D (GSDMD) dentro del enlace de sus dominios N- y C-terminal. Luego, el dominio N-terminal facilita la formación de poros en la membrana celular, estimula lapiroptosisy producción de citoquinas IL-1 e IL-18(10). Los estudios emergentes han demostrado que la GSDMD mediada porpiroptosisparticipa en la progresión de enfermedades que incluyen la encefalomielitis autoinmune (11), la esclerosis múltiple (12), la hepatitis alcohólica (13) y la enfermedad inflamatoria intestinal (14). Además, la inhibición genética o farmacológica de la caspasa-1/GSDMD ha Se ha demostrado que protege los riñones de lesiones en modelos murinos de enfermedad renal diabética (15, 16) y también después de una lesión renal aguda (17-19). Sin embargo,piroptosisen LN (nefritis lúpica)todavía está mal definido hasta la fecha(20). Presumimos que la terapia de combinación confería efectos beneficiosos en NL (nefritis lúpica)) inhibiendopiroptosisinducida por caspasa-1/GSDMD.

En el presente estudio, se investigó la activación de caspasa-1 y GSDMD en tejidos renales, así como los efectos de la terapia combinada en caspasa-1/GSDMD dependientepiroptosisinhibición en ratones MRL/LPR y pacientes con LN (nefritis lúpica). Correlaciones potenciales depiroptosiscon el índice de actividad de la enfermedad SLE (SLEDAI) y también se evaluaron las respuestas al tratamiento.

Tratamiento parapiroptosis

MATERIALES Y MÉTODOS

Población de estudio

La cohorte de estudio estuvo compuesta por pacientes diagnosticados por biopsia de NL (lupusnefritis) Menor o igual a 6 meses antes de la inscripción. El rango de edad de los pacientes era de 18-65 años y todos cumplían con los criterios de clasificación del Colegio Americano de Reumatología para LES (2l, 22) y la Sociedad Internacional de Nefrología/Sociedad de Patología Renal (2003). Los pacientes fueron reclutados de la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang y la Escuela de Medicina de la Universidad de Nanjing que tenían proteinuria (mayor o igual a 1,5 g/d) y concentraciones de creatinina sérica menores o iguales a 265,2 umol/L. Los criterios de exclusión incluyeron: un paciente que había sido tratado previamente con altas dosis de metilprednisolona; productos biológicos (dirigidos a moléculas patógenas específicas) o terapia combinada; plasmaféresis actual o tratamiento con globulina intravenosa dentro de las 12 semanas previas a la selección; funciones anormales del hígado; infecciones activas actuales; y un tumor maligno dentro de las 4 semanas del comienzo del estudio. LN (lupusnefritis) los pacientes recibieron terapia en pulsos con metilprednisolona durante 3 días a una dosis de 0,5 g/d. Una vez completada la terapia de pulsos de metilprednisolona, ​​el grupo de combinación con prednisona (0.6 mg/kg/d), MMF (0.5 g, dos dosis/d) y tacrolimus (2 mg, se administraron dos dosis/día durante un total de 4 semanas. Luego, las dosis de prednisona, que seguían combinadas con MMF (0,5 g, dos dosis/d) y tacrolimus (2 mg, dos dosis/d), se redujeron en 5 mg/d cada 2 semanas hasta se logró una dosis de mantenimiento de 10 mg/d(4). Se tomó como remisión completa (RC) una concentración de proteína urinaria de 24-h menor o igual a 0,4 g, la ausencia de sedimentos urinarios activos, una concentración de albúmina sérica mayor o igual a 35 g/L y creatinina normal (23). La remisión parcial (RP) se tomó como una disminución mayor o igual al 50 por ciento en la concentración de proteína urinaria 24-h a menor o igual a 3,5 g, una concentración de albúmina sérica mayor o igual a 30 g/ L, y un aumento normal o menor o igual al 25 por ciento en la concentración de creatinina sérica desde el inicio. Nuestra Junta de Revisión Institucional aprobó el estudio (No. IIT20200410A) y todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito antes de la inscripción.

modelos animales

Los ratones hembra MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) fueron suministrados por SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Shanghai, China), todos los ratones se dividieron al azar con la ayuda de un generador de números aleatorios, 5 ratones en cada grupo y cada jaula . Fueron tratados a las 8 semanas de edad por vía oral, con una combinación de 0.5 mg/kg de tacrolimus (MCE HY-13756), 50 mg/kg de MMF (MCE HY-B0199) y 1 mg/kg de kg de prednisona (MCE HY-B0214) o vehículo diariamente durante un total de 8 semanas como se describió anteriormente (6). Ac-FLTD-CMK fue sintetizado por MCE y se inyectaron 10 mg/kg ip diariamente. Todos los tratamientos fueron cegados a los participantes responsables de la siguiente detección. La proporción de albúmina a creatinina en orina (UACR) se determinó utilizando Albuwell M y Creatinine Companion (Excell, Phil, EE. UU.). Las muestras de riñón se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento antes de la tinción histológica e inmunohistoquímica y se extrajeron las cortezas renales para el análisis de inmunotransferencia. El uso de ratones fue aprobado por nuestro Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Nº2019-883).

Aislamiento de glomérulos de ratones y cultivo de podocitos

Los glomérulos se purificaron a partir de riñones de ratones hembra C57 y MRL/LPR de 12-semanas de edad como se ha descrito anteriormente (24). Los ratones anestesiados se perfundieron con perlas magnéticas precalentadas a 37 grados C. Se extrajeron los riñones y se trituraron en hielo en 1 mm³. Luego, los tejidos renales se digirieron a 37 grados con 1 mg/ml de colagenasa y 100 U/ml de ADNasa I durante 30 minutos, luego se filtraron dos veces con filtros de células Falcon de 100- μm (431752, BD). Después de varios lavados con una solución de HBSS de 4 grados (H1025, Solarbio) y una centrifugación suave a 200 g durante 5 minutos, se recogieron los glomérulos que contenían perlas utilizando el soporte magnético (HY-K0200, MCE) y se lavaron con solución de HBSS tres veces. Los glomérulos aislados se cultivaron en placas de cultivo recubiertas con colágeno tipo I (C3867, Sigma-Aldrich) en CO2 al 5 por ciento, a 37 grados según el método descrito por Jeffrey (25). Se usaron podocitos del paso 2 en el experimento in vitro.piroptosisInducción, citotoxicidad y detección de secreción de IL-1

Los podocitos de ratones MRL/LPR se cebaron con 1 mg/ml de LPS (tell-pb5lps, In InvivoGen) resueltos en Opti-MEM durante 4 h, seguidos de estimulación con ATP 5 mM (tlrlatpl, gen In Vivo). Los podocitos de ratones C57 se cortaron como control normal. Las monoterapias tacrolimus (10 μM), MMF (luM) y prednisona (10 μM) o la terapia combinada se preincubaron con las células durante 1 h antes del cebado con LPS. La citotoxicidad después de la estimulación se determinó utilizando un kit de detección de citotoxicidad (11644793001, Roche) según las instrucciones del fabricante. El sobrenadante después de la estimulación se recogió y midió utilizando el kit ELISA de ratón IL-1 (BMS6002, Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

Anticuerpos y Reactivos

Los niveles de caspasa-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) se evaluaron según las instrucciones del fabricante.piroptosisen sangre periférica se midió utilizando FAM FLICAMCaspase-1 Kit (Bio-Rad, EE. UU.) por citometría de flujo.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (vers. 8.0) y los datos se dan como medias ± DE. Se realizaron comparaciones de dos grupos usando la prueba t de Student y análisis de correlación usando la correlación de Pearson. P de dos colas<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tratamiento parapiroptosis ennefritis lúpica (LN)

RESULTADOS

Mediado por GSDMDpiroptosisSe Activa en Riñones Afectados por NL (lupusnefritis)

Para investigar si GSDMD contribuyó a la patogénesis de LN (lupusnefritis), primero probamos el nivel de expresión de proteína de GSDMD en muestras de riñón tomadas de LN (lupusnefritis) pacientes. El análisis inmunohistoquímico reveló niveles de expresión notablemente aumentados de GSDMD en muestras de biopsia de riñón tomadas de LN (lupusnefritis) pacientes con tipo IV, V, I más V y IV más V, y en comparación con sujetos sanos. GSDMD se expresó universalmente en podocitos glomerulares, células tubulares y células intersticiales infiltradas en LN.lupusnefritis) pacientes. El área con tinción positiva (flechas rojas) y negativa (flechas negras) se amplió (Figura 1A). Luego se estimó el porcentaje de área positiva para GSDMD en el riñón (Figura 1B). Se encontraron resultados similares en los riñones de ratones MRL/LPR y controles de tipo salvaje. El análisis de inmunotransferencia confirmó un gran aumento de la expresión y la escisión de GSDMD en muestras de riñón de ratones MRL/LPR (Figura 1C). La GSDMD en podocitos glomerulares, células tubulares y células intersticiales infiltradas fue elevada en ratones MRL/LPR en comparación con ratones de control (Figura 1D). Estos datos sugirieron que la mediación de GSDMD se activó en el tejido renal afectado por NL (lupusnefritis).

FIGURA 1|GSDMD está fuertemente elevado y escindido en los riñones de pacientes y ratones afectados por LN (nefritis lúpica).

(A) Tinción inmunoquímica de GSDMD en muestras renales tomadas de sujetos sanos y LN (lupusnefritis) pacientes, se ampliaron las tinciones positivas (flechas rojas) y negativas (flechas negras).

(B) La cuantificación de las áreas positivas de GSDMD se muestra en el tipo III más V, IV, IV más V, V LN (lupusnefritis) pacientes y sujetos sanos.

(C) Análisis de inmunotransferencia del dominio N-terminal escindido de longitud completa y el dominio C-terminal GSDMD en la corteza renal de tres pares de ratones de control y MRL/LPR.

(D) Tinción inmunoquímica de GSDMD en muestras de riñón tomadas de controles y ratones MRL/LPR.

*p < {{0}}.05,="" **p="">< 0.01.="" ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; FL, de cuerpo entero; NT, dominio N-terminal; CT, dominio C-terminal.

El tratamiento combinado suprime la GSDMD mediadapiroptosisActivación en Podocitos Primarios In Vitro

Investigar los efectos inhibidores de la terapia combinada enpiroptosis, aplicamos el método de estimulación LPS más ATP para inducirpiroptosisen podocitos de ratones MRL/LPR, tomando podocitos de ratones C57 de tipo salvaje como control normal. Los podocitos de ratones MRLlpr se prepararon durante 4 horas con LPS y posteriormente se trataron durante 4 horas con ATP, un estímulo comúnmente utilizado para la estimulación mediada por GSDMD.piroptosisactivación(26). En comparación con el control normal, los podocitos después exhibieron características morfológicas piroptósicas tales como hinchazón y burbujeo celular. El pretratamiento con terapia combinada mejoró significativamente las características morfológicas y la citotoxicidad piroptótica (Figura 2A). LPS más ATP indujo citotoxicidad en podocitos. De manera comparable, la terapia combinada disminuyó significativamente la citotoxicidad y la secreción de IL-1 en el sobrenadante inducida por la estimulación con LPS más ATP (Figuras 2B, C). Para verificar aún más la activación de GSDMD mediadapiroptosis, analizamos los inflamasomas canónicos y la activación de GSDMD mediante inmunotransferencia. De acuerdo con los cambios morfológicos piroptóticos y la citotoxicidad, LPS más ATP activaron significativamente NLRP3, caspasa-1 y escindieron GSDMD en podocitos (Figura 2D). El tratamiento combinado suprimió notablemente la activación de NLRP3 y caspasa-1 y redujo el nivel de GSDMD N-terminal. En particular, las monoterapias con tacrolimus, MMF o prednisona suprimieron la citotoxicidad celular estimulada por LPS más ATP y la secreción de L-1, pero la terapia combinada mostró un efecto inhibidor más significativo sobre Caspase-1 y GSDMD. Estos resultados proporcionaron evidencia que apoyó la opinión de que el tratamiento combinado mejoró la respuesta mediada por GSDMD.piroptosisal suprimir la activación de NLRP3 y caspasa-1.

FIGURA 2|El tratamiento combinado mejora la piroptosis en podocitos in vitro.

(A) Se exhibieron características piroptósicas en podocitos primarios cultivados después de incubarlos con LPS más ATP y pretratarlos con un tratamiento combinado. Las flechas indicaban células que exhibían características de tipo piroptótico.

(B) Se analizó la muerte celular de los sobrenadantes de las células desafiadas, medida por la secreción de LDH.

(C) Se analizó la liberación de IL-1b en los sobrenadantes de las células desafiadas.

(D) Análisis de inmunotransferencia de la expresión de NLRP3, caspasa-1, GSDMD-NT y ASC después de tacrolimus, MMF, prednisona o tratamiento combinado después de la activación del inflamasoma NLRP3.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0,001;="" ****="" p="">< 0,0001.="" ldh,="" lactato="">

DSMO, dimetilsulfóxido, FK506, tacrolimus; MMF, micofenolato mofetilo; SNP, prednisona; COM, terapia combinada; ASC, proteína tipo mota asociada a la apoptosis.

Tratamiento combinado con caspasa suprimida-1/GSDMD inducidapiroptosisen ratones MRL/LPR

A ratones MRL/LPR de ocho semanas de edad se les administró una combinación de MMF, tacrolimus y prednisona o vehículo de control. De acuerdo con un estudio anterior (6), después del tratamiento durante 8 semanas, no se encontraron diferencias en la mortalidad o el peso corporal entre los grupos de tratamiento con vehículo y combinado. En contraste con el grupo del vehículo, la terapia combinada fue muy efectiva para prevenir la proteinuria, la glomeruloesclerosis y la infiltración de células inmunitarias intersticiales renales (Figura 1 complementaria).

A continuación, examinamos los niveles de expresión de caspasa-1 y GSDMD en grupos de terapia combinada y de control con vehículo. El análisis inmunohistoquímico reveló que la expresión de caspasa-1 intersticial glomerular y renal y GSDMD se redujo notablemente en el grupo de terapia combinada (Figura 3A). El análisis de inmunotransferencia también encontró una disminución de la expresión y división de caspasa-1 y GSDMD en las cortezas renales del grupo de tratamiento combinado (Figura 3B). Además, las células doblemente positivas de caspasa-1/yoduro de propidio (PI) se contaron mediante citometría de flujo y unpiroptosisFAM Caspasa-1kit. Los resultados revelaron una marcada reducción en el número de células sanguíneas periféricas de caspasa-1*/PI' en ratones MRL/LPR que recibieron el tratamiento combinado en comparación con los ratones MRL/LPR tratados con vehículo (Figuras 3C,D). Además, el tratamiento combinado también redujo significativamente la concentración sérica de Ii (Figura 3E). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el tratamiento combinado suprimió la caspasa-1/GSDMD inducida porpiroptosisen los riñones y las células sanguíneas de LN (lupusnefritis) ratones.

FIGURA 3|El tratamiento combinado atenuó la piroptosis mediada por caspasa-1/GSDMD en ratones MRL/LPR.

(A) Tinción inmunoquímica de GSDMD y caspasa-1 en muestras de riñón de ratones MRL/LPR. En comparación con el control del vehículo, la expresión de caspasa-1 y GSDMD se inhibió notablemente en el grupo de tratamiento combinado.

(B) Análisis de inmunotransferencia de GSDMD y caspasa -1 de longitud completa y escindida en muestras de corteza renal de ratones MRL/LPR; comparación de los resultados de los grupos de tratamiento con vehículo y de combinación.

(C) FACS de células doblemente positivas para caspasa-1/PI en sangre periférica de ratones MRL/LPR a los que se administró o no un tratamiento combinado.

(D) Cuantificación de células positivas dobles de caspasa-1/PI en sangre periférica de ratones MRL/LPR que recibieron o no terapia combinada.

(E) Cuantificación de las concentraciones séricas de IL{{0}}b en ratones MRL/LPR que recibieron o no un tratamiento combinado. ####P < 0,0001.="" facs,="" clasificación="" celular="" activada="" por="" fluorescencia;="" tc,="" terapia="">

Caspasa suprimida por terapia combinada-1/GSDMD inducidapiroptosisen LN (lupusnefritis) Pacientes

Entre enero de 2020 y junio de 2020, 47 pacientes con NL (lupusnefritis) se inscribieron y 43 completaron 24-semanas de terapia combinada. La enfermedad de referencia y los datos demográficos de la cohorte inscrita se enumeran en la Tabla complementaria 1. La cuantificación de caspasa-1/yoduro de propidio (se realizaron células doblemente positivas para PI en pacientes con NL (lupusnefritis) tipo III, IV, V, III más V, IV más V y en controles sanos usando unpiroptosisKit FAM Caspase-1 y citometría de flujo. En comparación con los controles sanos, el número de células doblemente positivas para caspasa-1/PI en sangre periférica aumentó (Figuras 4A, B). También examinamos las células doblemente positivas de caspasa-1/PI después de 24-semanas de tratamiento y al inicio del estudio. Después de 24-semanas de terapia de inducción, la incidencia de RC y PR fue del 39,5 % (17/43) y del 32,6 % (14/43), respectivamente. El número de células positivas dobles de caspasa-1/PI en sangre periférica de pacientes con RC y PR se redujo notablemente en comparación con el valor inicial (Figura 4C). También identificamos una correlación entre la caspasa-1 inducidapiroptosisy la SLEDA; los datos mostraron claramente que la proporción positiva de caspasa-1/PI en sangre periférica se correlacionó positivamente con SLEDAI (Figura 4D). Ac-FLTD-CMK, un inhibidor derivado de GSDMD, impidió el desarrollo de LN (lupusnefritis).

FIGURA 4|La terapia combinada atenuó la piroptosis mediada por caspasa-1-en pacientes con NL (nefritis lúpica).

(A) FACS de células doblemente positivas de caspasa-1/PI en sangre periférica de LN (lupusnefritis) pacientes tratados con o sin terapia combinada.

(B) Cuantificación de células doblemente positivas para caspasa-1/PI en sangre periférica de tipo III, IV, V, III más V y IV más V LN (lupusnefritis) pacientes y sujetos sanos.

(C) Cuantificación de células doblemente positivas de caspasa-1/PI en sangre periférica de NL (lupusnefritis) pacientes al inicio, CR, PR y sin remisión después de la terapia de combinación.

(D) Análisis de correlación de las proporciones de células positivas dobles de caspasa-1/PI con SLE-DAI.

** p < 0.01.="" facs,="" clasificación="" celular="" activada="" por="" fluorescencia;="" ln="">lupusnefritis), lupusnefritis; CR, remisión completa; PR, remisión parcial; SLE-DAI, índice de actividad de la enfermedad del lupus eritematoso sistémico.

Un estudio reciente encontró que GSDMDhmice desarrolló un aumento de la deposición renal de C3 e IgG, una lesión renal más grave y una mayor mortalidad en un modelo de LES inducido por imiquimod.17 Para aclarar aún más el papel de GSDMD en NL (lupusnefritis), los ratones MRL/LPR se trataron con Ac-FLTD-CMK21 a partir de las 8-semanas de edad, con el vehículo como control. Después de 8-semanas de tratamiento, no se encontraron diferencias en la mortalidad o el peso corporal entre el vehículo y el grupo tratado con Ac-FLTD-CMK. En comparación con los ratones de control con vehículo, los ratones MRL/LPR tratados con Ac-FLTD-CMK tenían una proporción de albúmina-creatinina en orina más baja (Figura 5A), una concentración de creatinina sérica más baja (Figura 5B), glomeruloesclerosis reducida (Figura 5C) y CD3. , CD4 y CD68 infiltración de células positivas (Figura 5D). Los resultados de la inmunohistoquímica mostraron una expresión reducida de GSDMD (Figura 5D) y una secreción sérica suprimida de IL-1 determinada por ELISA (Figura 5E). Colectivamente, los datos sugirieron que Ac-FLTD-CMK inhibiópiroptosisen riñones afectados por NL (lupusnefritis).

FIGURA 5|Ac-FLTD-CMK, un inhibidor derivado de GSDMD, impidió el desarrollo de NL (nefritis lúpica).

(A) La proporción de albúmina a creatinina en la orina se calculó en ratones MRL/LPR a los que se les administró o no un inhibidor de GSDMD.

(B) Creatinina sérica en ratones MRL/LPR a los que se les administró o no un inhibidor de GSDMD.

(C) Imágenes representativas de especímenes renales teñidos con ácido peryódico de Schiff (PAS) y porcentaje de glomeruloesclerosis de cuantificación.

(D) Tinción inmunoquímica de CD3, CD4, F4/80 y GSDMD. (E) Cuantificación de las concentraciones séricas de IL-1b en ratones MRL/LPR a los que se les administró o no un inhibidor de GSDMD.

Los datos se muestran como la media ± SEM. #p < {{0}}.05,="" ##p=""><>

DISCUSIÓN

La terapia combinada es una estrategia prometedora debido a las tasas más altas de RC y de respuesta general, un tiempo más breve hasta la remisión y menos efectos secundarios. Hasta ahora, no se conocían los mecanismos moleculares subyacentes de la terapia combinada. Recientemente, Fu et al.(6) trataron ratones MRL/LPR con monoterapias o terapia combinada y llevaron a cabo un análisis transcriptómico completo en riñones completos. Curiosamente, descubrieron que la terapia de combinación, pero no las monoterapias, suprimía de manera específica y única la expresión de caspasa-1.

El inflamasoma NLRP3/ASC/caspase-1 ahora se reconoce como un contribuyente clave en la patogenia de la NL (lupusnefritis). Los inflamasomas NLRP3 en los podocitos se activan en ratones propensos a lupus y también en pacientes con LN.lupusnefritis). Cuando los inflamasomas NLRP3 se suprimieron con un inhibidor de caspasa-1, se encontró que la proteinuria, las lesiones histológicas renales y el borramiento del pie de los podocitos mejoraron en ratones propensos al lupus(8). Huang et al. (27) informaron que NLRP3 se expresaba en células tubulares de LN (lupusnefritis) clase IV y que la activación de NLRP3 se correlacionó positivamente con la puntuación del índice de actividad para pacientes con NL. Se ha demostrado que la caspasa-1 desempeña un papel vital en el lupus y la disfunción vascular y, por lo tanto, es un objetivo potencial para nuevas intervenciones terapéuticas(28). Fármacos experimentales emergentes como RIP3(29), antagonistas de los receptores P2X7(30), inhibidores de GSK-3 (31) y un agonista de Nrf2 (32) inhibieron el desarrollo de LN (lupusnefritis) en ratones MRL/LPR al modular la actividad del inflamasoma NLRP3/ASC/caspasa-1, lo que destaca la importancia y la criticidad del inflamasoma NLRP3/ASC/caspasa-1 en LN. Las concentraciones séricas elevadas de IL-18 se correlacionan con la gravedad de la enfermedad y el grado de lesión/compromiso renal en pacientes con LES(33). Hasta donde sabemos, parece que la familia gasdermin podría ser esencial para el desarrollo depiroptosis, pero ha habido escasez de pruebas de la presencia de GSDMD/GSDME en pacientes con LES.

En general, examinamos la activación y expresión de GSDMD en muestras de biopsia de riñón tomadas de LN (lupusnefritis) pacientes y ratones MRL/LPR. GSDMD fue fuertemente inducido y escindido en podocitos glomerulares y células tubulares y células intersticiales infiltradas. Posteriormente, los ratones MRL/LPR recibieron una combinación de MMF, tacrolimus y prednisona o vehículo. En comparación con el grupo de control con vehículo, la activación de caspasa-1 y GSDMD se redujo en el grupo de tratamiento combinado. El grado depiroptosisen sangre periférica también fue mucho menor en NL (lupusnefritis) pacientes después de la administración de la terapia de combinación. Es más,piroptosisen sangre periférica se correlacionó positivamente con SLEDAI, lo que sugirió quepiroptosisen sangre periférica podría actuar como un marcador significativo de la actividad del LES. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la terapia combinada podría conferir efectos beneficiosos en la NL (lupusnefritis) inhibiendopiroptosisinducida por caspasa-1/GSDMD. Los estudios estructurales de cristal previos de caspasa-1 en un complejo con Ac-FLTD-CMK revelaron muchas interacciones enzima-inhibidor que impidieron el reconocimiento de GSDMD por caspasa-1. Sin embargo, encontramos que Ac-FLTD-CMK, que actúa como un inhibidor derivado de GSDMD, inhibiópiroptosisen LN (lupusnefritis), que podría ser inducida por un mecanismo diferente.

Recientemente, en un modelo murino de LES inducido por TLR7-(34), los ratones GSDMD-/- desarrollaron un mayor grado de daño renal y una mayor mortalidad, lo que inicialmente sugirió que la eliminación de GSDMD tendría un efecto protector y estaría asociada con inflamación sistémica y producción de autoanticuerpos con aumento de la mortalidad asociada. Los ratones con deficiencia de GSDMD desarrollan un depósito más prominente de un complejo inmunitario glomerular en muestras de riñón y una proteinuria más alta en comparación con los ratones de tipo salvaje. También se encontró una mayor secreción de HMGB1 extracelular en GSDMD-/linfocitos, lo que sugiere que la necrosis/piroptosisocurrió cuando GSDMD estaba ausente.

Activadores de caspasa-1piroptosispor escisión GSDMD. Por el contrario, en las células deficientes en GSDMD o bajas en GSDMD, la caspasa-1 desencadena la apoptosis y luego la necrosis secundaria dependiente de GSDME ypiroptosis. Cuando la actividad de GSDMD está ausente después de la terapia, GSDME quizás también podría cambiar la apoptosis mediada por caspasa-3-apiroptosis(35,36). Además, la activación de caspasa-8 fue mucho mayor en los macrófagos que eran deficientes en GSDMD. También se encontró una activación significativa de caspasa-8 en LN deficiente en GSDMD inducida por TLR7-(lupusnefritis) ratones(34). Por lo tanto, en ausencia de GSDMD, es probable que la caspasa-1 coopere con la caspasa-8 para causar que la apoptosis mediada por caspasa-3-GSDME cambie apiroptosisen LN (lupusnefritis), una hipótesis que demanda mayor investigación experimental.

Hay varias limitaciones en el estudio actual. Primero, con base en los datos actuales, verificamos que la terapia combinada podría suprimirpiroptosis, pero otros tratamientos como la terapia dual de esteroides y MMF, esteroides y tacrolimus, o el anticuerpo anti-CD20 también podrían tener efectos comparables. En segundo lugar, no se ha explorado bien el mecanismo molecular exacto del efecto de inhibición de la terapia combinada sobre la caspasa-1. Por último, pero no menos importante, observamos la relación de las células doble positivas de caspasa-1/PI en sangre periférica con SLE-DAI y el cambio antes y después del tratamiento de terapia combinada en un NL retrospectivo (lupusnefritis) cohorte de pacientes. El valor predictivo clínico de las células doblemente positivas de caspasa-1/PI para la actividad de enfermedades y la respuesta al tratamiento debe investigarse más a fondo en una cohorte prospectiva más grande.

En general, identificamos que la terapia de combinación confería sus efectos beneficiosos al suprimir la inducida por caspasa-1/GSDMD.piroptosisen LN (lupusnefritis), que proporcionó una nueva visión de los mecanismos celulares involucrados. De hecho, la terapia de combinación suprimió la expresión de caspasa-1 de manera específica y única. La inhibición farmacológica o genética de NLRP3 y caspasa-1 mejoró la función renal y suprimió la autoinmunidad en NL (lupusnefritis). El papel fisiopatológico de la caspasa-1 en LN (lupusnefritis) es digno de estudio adicional, y las terapias dirigidas a GSDMD en pacientes con NL (lupusnefritis) deben evaluarse con mucho cuidado.

Método de tratamiento parapiroptosis

REFERENCIAS

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.LupusNefritis: Actualización actual. Arthritis Res Ther (2011) 13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Terapia de individualización enLupusNefritis. Representante internacional de riñón (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H,Liu ZH, Xie HL, Hu WX,Zhang HT,LiLS. Tratamiento exitoso de clase V más IVLupusNefritisCon Terapia Multiobjetivo. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al. Terapia multiobjetivo para el tratamiento de inducción deLupusNefritis: un ensayo aleatorizado, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10,7326/mes14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C, et al. Terapia multiobjetivo para el tratamiento de mantenimiento deLupusNefritis. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al. El análisis transcriptómico descubre nuevos mecanismos sinérgicos en la terapia combinada paraLupusNefritis. Riñón Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Ummarino D.LupusNefritis: El inflamasoma NLRP3 enciende la disfunción de los podocitos. Nat Rev Rheumatol(2017)13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9