Mutaciones UMOD en la enfermedad renal crónica en Taiwán

Abstracto:UMODEs el primer gen identificado y más comúnmente mutado que causa la enfermedad autosómica dominante.enfermedad renal tubulointersticial(ADTKD). Estudios recientes han demostrado que ADTKD-UMODes una causa relativamente común deenfermedad renal crónica(ERC). Sin embargo, el estado de ADTKD-UMODen Taiwán sigue siendo desconocido. En este estudio, identificamos tres heterocigotos.UMODvariantes sin sentido, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) y c.817G > T (p.Val273Phe), en un total de 221 familias de ERC seleccionadas (1,36%). Dos de estas variantes sin sentido, p.Cys41Arg y p.Gly60Asp, no se habían informado anteriormente. In vitro, los estudios demostraron que ambas variantes de uromodulina tienen defectos en el tráfico de la membrana celular y la excreción al medio de cultivo. El modelo de estructura predijo la formación de enlaces disulfuro alterados en ambas variantes, pero se predijo que solo p.Gly60Asp causaría la desestabilización de las proteínas. Nuestros hallazgos amplían el espectro de mutaciones e indican que la ADTKD-UMODcontribuyó a una causa pequeña pero significativa de ERC en la población taiwanesa.

Palabras clave: uromodulina;enfermedad renal crónica(ERC); tubulointersticial autosómica dominantenefropatía(ADTKD); insuficiencia renal (KF).

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1. Introducción

ADTKD es una rara enfermedad de herencia dominante causada por mutaciones heterocigotas en UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] y SEC61A1 [5]. UMOD es la primera causa identificada y la más común de ADTKD, y ha sido objeto de una extensa investigación [1,6]. Aunque es poco común, la ADTKD es la tercera enfermedad monogénica más común.nefropatíadespués de ADPKD y nefropatía por colágeno tipo IV, pero la prevalencia de ADTKD-UMOD sigue sin estar clara y estudios recientes muestran que representa hasta el 2% de los pacientes con KF o el 0.3% de todos los individuos con ERC [7, 8]. UMOD codifica uromodulina y es la proteína más abundante en la orina humana [9]. La uromodulina es una proteína específica del riñón producida por las células epiteliales de la rama ascendente gruesa del asa de Henle y la parte inicial del túbulo contorneado distal [10], y se forma como un polímero de alto peso molecular a través de su zona. dominio pelúcido [11]. Además, la uromodulina es una proteína altamente glicosilada, con siete sitios de N-glicosilación y escisión en el extremo del C-terminal por la serina proteasa hepsina, antes de ser excretada en la luz tubular [9,12,13]. La función de la uromodulina incluye protección contra la cristalización de oxalato de calcio [14], defensa contra infecciones en el tracto urinario causadas por bacterias uropatógenas [15-18] y regulación del canal iónico Ca2+-K+ [19]. El efecto de las mutaciones UMOD es un retraso en la maduración, retención en el retículo endoplásmico (RE), expresión reducida en la membrana plasmática y disminución de la excreción urinaria, lo que conduce al estrés del RE y a la respuesta de la proteína desplegada [20-22].

Los fenotipos clínicos de ADTKD-UMOD son inespecíficos e incluyen ERC, gota, hiperuricemia, proteinuria normal a leve, presencia o falta de antecedentes familiares y la mayoría de los individuos afectados que ingresan a KF entre las edades de 30 y 50 años [23]. La histología renal muestra dilatación o atrofia tubular, cancelación o engrosamiento de la membrana basal tubular, fibrosis intersticial y acumulación de uromodulina mutada como materiales polimórficos no estructurados revelados por la tinción PAS [24,25].

Taiwán tiene la mayor incidencia y prevalencia de ERC y KF según las comparaciones internacionales del informe del USRDS [26]. Sin embargo, ningún estudio se ha centrado en el estado de ADTKD-UMOD en la población con ERC en Taiwán. En este estudio, examinamos la prevalencia de mutaciones ADTKD-UMOD en una cohorte seleccionada de ERC en un único centro terciario en Taiwán.

2. Materiales y métodos

2.1. Individuos con ERC y preparación de ADN

Este estudio reclutó a 221 familias con ERC (228 individuos) del Programa de Atención de ERC del Hospital Universitario Médico de Kaohsiung. Los criterios de inclusión incluyeron episodios de gota o hiperuricemia con eGFR inferior a 90 ml/min/1,73 m2 antes de los 40 años. Las muestras de sangre, la información genealógica y el acceso a los resultados del trabajo de laboratorio se obtuvieron de los individuos después de que se otorgara el consentimiento informado. El estudio se realizó siguiendo la Declaración de Helsinki y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de KMUH (KMUHIRB-G(II)-20160024). El ADN de muestras de sangre periférica se extrajo según el método estándar.

2.2. Secuenciación del exoma y análisis bioinformático.

Se utilizó el panel Nextera Flex for Enrichment and Exome (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) para la creación de la biblioteca de exomas. La selección del tamaño, la captura de secuencia, el enriquecimiento y la elución se realizaron según las instrucciones del fabricante. Luego se midió la distribución del tamaño de las bibliotecas de ADN utilizando TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.), seguido de la secuenciación en un Illumina NovaSeq 6000 con lecturas de extremos emparejados de 150 pb. Los datos fastq resultantes se alinearon con la secuencia del genoma humano de referencia (GRCh37/hg19) y realizamos llamadas de variantes de nucleótidos utilizando la plataforma DRAGEN Bio-IT (Illumina). El archivo VCF se analizó en CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.). Las variantes identificadas se etiquetaron como patógena/probablemente patógena, variante de significado incierto (VUS) o benigna, según la clasificación del Colegio Americano de Genética y Genómica Médica (ACMG), utilizando el software VarSome, y comparamos las variantes que existían en ClinVar. , HGMD y bases de datos dbSNP. Las variantes patógenas, probablemente patógenas y VUS detectadas se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. Para la secuenciación de Sanger, los productos de PCR se purificaron mediante tratamiento con fosfatasa alcalina/exonucleasa I de camarón (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.) y luego se sometieron a secuenciación desde ambos extremos mediante secuenciación con termociclador utilizando la secuenciación BigDye® terminator 3.1. kit (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) después del análisis en un analizador de ADN ABI 3730XL (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Se realizó un análisis de segregación si se disponía de ADN de miembros de la familia. Los exones 2, 3, 4 y 5 de UMOD fueron seleccionados mediante secuenciación de Sanger en el probando de 221 familias con ERC, excepto la familia DY5, que recibió secuenciación del exoma. La secuencia NCBI Ref NM_003361.4 se utiliza para UMOD. Se utilizó la nomenclatura estándar recomendada por la Human Genome Variation Society (http//www.hgvs.org/; consultada el 18 de julio de 2022) para numerar nucleótidos y nombrar mutaciones o variantes.

2.3. Cultivo celular y transfección transitoria.

Se cultivaron células HEK293 (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) en la modificación de Kaighn del medio F-12 de Ham (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington , MA, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), 100 unidades/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina (10378016, Gibco, Thermo Fisher Scientific ) y 10 unidades/ml de interferón (IF002, Merck/Millipore Sigma). Las células se mantuvieron a 37 ◦C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

La transfección transitoria de células HEK293 se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Brevemente, se agregaron 2,5 µl de Lipofectamine 2000 directamente a 100 µl de medio óptimo (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadió un total de 1 µg de ADN a la mezcla Lipofectamine 2000-Optimum y se incubó durante otros 20 minutos. La mezcla de ADN se añadió gota a gota a placas de cultivo celular con un medio sin suero al final de la incubación. Para determinar el estado de salud de las células después de la transfección transitoria, utilizamos el contador celular automatizado LUNA-II™ (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Corea) para detectar la viabilidad celular mediante tinción con azul tripano en un momento diferente, y la mayoría las células transfectadas permanecieron vivas tras diferentes sobreexpresión de uromodulina (datos no mostrados).

2.4. Mutagénesis dirigida al sitio

El vector de uromodulina de tipo salvaje marcado con HA se obtuvo del Dr. Rampoldi [27]. Las construcciones de mutación de p.Cys41Arg y p.Gly60Asp se crearon utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II (200523, Agilent) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las mutaciones fueron confirmadas mediante secuenciación de Sanger.

2.5. ELISA y Fraccionamiento

Las construcciones de expresión de vector vacío, uromodulina de tipo salvaje, uromodulina p.Cys41Arg y uromodulina p.Gly60Asp se transfectaron transitoriamente a células HEK293. Después de la transfección transitoria, el medio de cultivo se recogió a las 8, 24 y 32 h y luego se almacenó a -80 ◦C antes de la medición. Para la inmunotransferencia, el medio de cultivo se condensó mediante Centri con (YM3, icono, Merck/Millipore Sigma) antes de la electroforesis en SDS-PAGE. Se utilizó ELISA para realizar mediciones de la uromodulina en el medio de cultivo según las instrucciones del fabricante (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Brevemente, el medio de cultivo y los estándares se diluyeron en un diluyente de ensayo suministrado en el kit y se agregaron a los pocillos por duplicado. Después de 2,5 h de incubación a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron con PBS y se añadió el anticuerpo uromodulina biotinilado. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, los pocillos se volvieron a lavar y se añadió un anticuerpo secundario de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente, los pocillos se volvieron a lavar y se desarrolló el color añadiendo solución de sustrato TMB e incubación en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo añadiendo la solución de parada suministrada en el kit, seguido de una lectura inmediata a OD450 y OD550. La concentración de uromodulina del medio de cultivo se determinó mediante interpolación en la curva estándar.

Después de recoger el medio de cultivo, las células adheridas a la placa de cultivo procedieron al fraccionamiento utilizando un kit de fraccionamiento de proteínas subcelulares (78840, Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. En resumen, recolectamos cantidades iguales de tres tipos diferentes de lisado celular de uromodulina y eliminamos todo el sobrenadante hasta que esté lo más seco posible. Agregamos tampón de extracción citoplasmático helado que contenía inhibidores de proteasa al sedimento celular, lo incubamos a 4 ◦ C durante 10 minutos con una mezcla suave y luego lo centrifugamos a 500 × g durante 5 minutos. Inmediatamente retiramos el sobrenadante (extracto citoplasmático) a un tubo limpio previamente enfriado en hielo y agregamos al sedimento un tampón de extracción de membrana enfriado con hielo que contiene inhibidores de proteasa. La porción de membrana se agitó durante 5 s en la configuración más alta y se incubó a 4 ◦C durante 10 min con mezcla suave. Transferimos el sobrenadante (extracto de membrana) a un tubo limpio previamente enfriado en hielo después de centrifugar a 3000 × g durante 5 minutos. La membrana subcelular y la proteína citoplasmática se analizaron mediante transferencia Western.

2.6. Análisis de inmunotransferencia

Las muestras de proteínas se recogieron de las células con un tampón RIPA (R0278, Merck/Millipore Sigma) o el paso de fraccionamiento. Posteriormente, se determinó la concentración de proteína utilizando un colorante de ensayo de proteínas (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, EE. UU.) y se accedió a una cantidad igual de proteína, luego se separó mediante electroforesis en SDS-PAGE. Después de que las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (1620177, BIO-RAD), la membrana de PVDF se sumergió en leche desnatada al 5 % a 1X TBST, se bloqueó durante 1 h a temperatura ambiente y se lavó tres veces con 1X TBST durante 5 minutos. A continuación, incubamos la membrana de PVDF con el anticuerpo primario a 4 ◦C durante la noche, la lavamos tres veces con 1X TBST durante 5 minutos y la incubamos con el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavó tres veces con TBST 1X durante 5 minutos después de la incubación del anticuerpo secundario, luego agregamos el kit de sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) y detectamos la señal de la proteína usando un procesador de rayos X (MXP{{ 19}}, KODAK, Rochester, NY, EE. UU.) en película de rayos X (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron con leche desnatada al 5 % en 1X TBST y la información detallada es la siguiente: 1:2000 para uromodulina (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, EE. UU.) y 1:20 000 para conejo. Segundo anticuerpo HRP (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, EE. UU.).

2.7. Predicción de la estructura de las proteínas

Se aplicó dinamita para la predicción de la estructura 3D de la uromodulina de tipo salvaje y mutante (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; consultado el 15 de junio de 2022) utilizando la estructura de longitud completa de la uromodulina humana nativa (Protein Banco de datos: 7PFP) [28]. DiANNA se utilizó para la predicción del enlace disulfuro (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; consultado el 16 de junio de 2022) de la uromodulina de tipo salvaje y mutante [29–31].

2.8. Análisis estadístico

El software de análisis ImageJ analizó y cuantificó las bandas de transferencia Western. Los análisis estadísticos y los gráficos se realizaron y prepararon utilizando el software GraphPad Prism8 (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, EE. UU.), y se presentó la media ± SEM. Se aplicó una prueba t no apareada para una comparación de dos grupos. Los resultados estadísticos se marcaron de la siguiente manera: * p < 0.05; **p<0.01; ***p < 0,001. Cada experimento fue repetido al menos tres veces.

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