Perturbaciones del viroma urinario en el trasplante renal

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Tara K. Sigdel y otros

El microbioma humano es importante para la salud y juega un papel en funciones metabólicas esenciales y en la protección contra ciertos patógenos. Por el contrario, la disbiosis del microbioma se observa en el contexto de diversas enfermedades. Estudios recientes han destacado que una comunidad microbiana compleja que contiene cientos de bacterias coloniza el tracto urinario sano, pero se sabe poco sobre los virus urinarios humanos en la salud y la enfermedad. Evaluar el viroma urinario humano en el contexto deriñóntrasplante (tx), se evaluaron las variaciones en la composición del viroma urinario en muestras de orina de voluntarios sanos normales así como de pacientes conriñónenfermedaddespués de haber sido sometidos a tx renal. El análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas se llevó a cabo en una cohorte seleccionada de 142riñonespacientes tx y controles sanos normales, de un biobanco más grande de 770riñónbiopsia de muestras de orina coincidentes. Además del análisis de orina de control sana normal, la cohorte deriñónLos pacientes tx tenían una clasificación fenotípica confirmada por biopsia, coincidente con la muestra de orina analizada, de injertos estables (STA), rechazo agudo, nefritis por virus BK y nefropatía crónica por aloinjerto. Identificamos 37 virus únicos, 29 de los cuales se identifican por primera vez en muestras de orina humana. La composición del viroma urinario humano difiere en la salud y la lesión renal, y la distribución de proteínas virales en el tracto urinario puede verse afectada aún más por la exposición a IS, la dieta y la exposición ambiental, dietética o cutánea a varios insecticidas y pesticidas.

Palabras clave: riñóntrasplante, viroma, orina, proteómica, biomarcadores

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INTRODUCCIÓN

El microbioma humano se ha estudiado ampliamente en varios biofluidos, como sangre (1), orina (2–4), saliva (5, 6), líquido cefalorraquídeo (7) y lavado broncoalveolar (8, 9), por su influencia sobre la salud y las enfermedades humanas (10). Se han publicado varios informes sobre la evaluación de microbiomas en diferentes regiones del cuerpo humano, incluidos los pulmones y el intestino (11–15). Sin embargo, se sabe poco sobre el microbioma urinario y sus cambios en el contexto de la lesión renal posterior al trasplante renal (tx) (16, 17). La mayoría de los estudios del microbioma humano han mapeado el ARNr 16S para el perfil bacteriano (18), y solo hay una pequeña cantidad de datos que examinan el viroma de la orina (19, 20), y un solo estudio publicado ha utilizado la secuenciación de próxima generación para mapear los componentes genómicos virales en la orina de pacientes trasplantados de riñón (19).

La disbiosis del microbioma se asocia con múltiples enfermedades, como la enfermedad inflamatoria intestinal, el cáncer de colon, la obesidad y la enfermedad pulmonar (21–25), pero se sabe poco sobre las alteraciones del viroma en los fluidos corporales humanos, como la saliva, el lavado broncoalveolar, y orina Se reconoce que varios componentes del microbioma realizan funciones esenciales, incluida la biosíntesis de cofactores y vitaminas, el metabolismo de compuestos esenciales y la protección de barrera contra patógenos (26–28). También se pueden atribuir funciones disbióticas y protectoras similares al viroma de la orina; por lo tanto, es importante determinar la composición del viroma humano en la salud y la enfermedad. Para los propósitos de este estudio, elegimos realizar estos estudios en orina en condiciones de salud y en el contexto de la exposición a IS después de un tratamiento renal, durante una función renal estable y en el contexto de una lesión renal. El enfoque del estudio fue evaluar el repertorio de virus determinado por los péptidos presentes en la orina humana y sus perturbaciones después de la exposición a IS y diversas causas de lesión renal aguda, crónica e infecciosa.

El microbioma cambia con el tiempo y se correlaciona con la diversidad de organismos. El análisis del microbioma se puede segregar en análisis estructural basado en unidades taxonómicas operativas basadas en la filogenia de secuencias y análisis funcional basado en secuenciación metagenómica y proteómica (29, 30). La microbiota identificada en diferentes enfermedades puede estudiarse más a fondo mediante cultivo, metagenómica funcional, inmunofluorescencia multiplexada e hibridación in situ. El proyecto de microbioma humano de NIH ha publicado el microbioma humano en 15 sitios del cuerpo de 300 individuos (31).

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MATERIALES Y MÉTODOS

Se evaluaron un total de 142 muestras únicas de un biodepósito que contenía 2016 recolectadas mediante consentimiento informado aprobado por el IRB de muestras pediátricas y de adultos de los programas de tratamiento renal de la Universidad de Stanford y la Universidad de California en San Francisco, entre las muestras de orina, de las cuales 770 estaban acompañadas de muestras renales compatibles. cuadro de tx con lecturas histológicas de patología centralizadas y puntajes de compartimento utilizando el esquema de Banff estandarizado (32) para calificar tx de riñón por lesión (Figura 1). El estudio fue aprobado por el Programa de Protección de la Investigación Humana de la Universidad de California, San Francisco. Las muestras de orina se fenotiparon en función de la patología de BX renal coincidente en cinco grupos: control sano (HC; n=9), injerto estable (STA; n=40), rechazo agudo (AR; n {{ 7}}), nefropatía crónica por aloinjerto (CAN; n=39) ​​y nefritis por virus BK (BKVN; n=17). La orina se centrifugó 2,000 ×g a 4 grados durante 20 min para eliminar los sedimentos de orina. El sobrenadante se pasó a través de un filtro de membrana de 10 kDa para eliminar los péptidos nativos de las proteínas intactas de tamaño superior a 10 kDa. A continuación, la proteína total se digirió con tripsina y los péptidos trípticos resultantes se analizaron mediante la plataforma LC-MS (Orbitrap Velos MS). Los métodos detallados de preparación y análisis de proteínas se informan en otra parte (33).

El algoritmo personalizado MSGF plus generado por nuestro grupo (https://omics.pnl.gov/software/ms-gf) se utilizó para buscar espectros MS/MS en la base de datos de secuencias de proteínas humanas combinadas y la base de datos viral NCBI. Los péptidos se identificaron inicialmente a partir de la búsqueda en la base de datos aplicando los siguientes criterios: valor E del espectro MSGF (un valor de probabilidad del péptido para que el espectro MS/MS coincida con el valor más bajo, la mayor probabilidad de que sea una coincidencia correcta) para ser<10-10, peptide="" level="" q-value="" (false="" discovery="" rate="" estimated="" by="" targeted-decoy="" database="" search)="" to="" be=""><0.01, and="" mass="" measurement="" error=""><10 ppm="" (±5="" ppm).="" the="" decoy="" database="" searching="" methodology="" was="" used="" to="" confirm="" the="" final="" false="" discovery="" rate="" at="" the="" unique="" peptide="" level="" to="" be=""><1%. due="" to="" the="" anticipated="" higher="" false="" discovery="" rate="" for="" peptides="" from="" viral="" proteins,="" more="" stringent="" filtering="" criteria="" with="" msgf="" spectrum="" e="" value="" to="" be=""><1e-13 was="" applied.="" the="" false="" discovery="" rate="" was="" estimated="" to="" be="" nearly="" 0%="" based="" on="" the="" well-accepted="" target="" decoy="" searching="" strategy="" because="" no="" decoy="" hits="" were="" observed="" following="" this="" stringent="" cutoff.="" data="" are="" shown="" as="" percentages="" and="" mean="" ±="" sd.="" comparisons="" of="" different="" categories="" are="" done="" using="" anova="" and="" p="" values="" of=""><0.05 are="" considered="">

RESULTADOS

Nuestro grupo ha publicado previamente un análisis detallado de proteínas humanas biológicamente relevantes en estas muestras de orina recolectadas de receptores de trasplante de riñón con diferentes fenotipos de lesión del injerto, según lo confirmado por la histopatología del trasplante de riñón coincidente en la biopsia, recolectada al mismo tiempo que la muestra de orina; estos datos se han depositado en el depósito proteómico MassIVE (acceso MSV000079262) y en el depósito ProteomeXchange (acceso PXD002761) (33). En este estudio, solo nos enfocamos en la identificación y el análisis de proteínas virales en la misma cohorte de pacientes con trasplante de riñón, con la inclusión también de muestras de orina humana de control sano emparejadas por edad y género para evaluar las proteínas virales tanto en la salud como en la lesión renal. . Es importante señalar que del total de proteínas humanas y virales analizadas en la orina, las proteínas virales por sí solas constituyen<0.2% of="" the="" total="" identified="" proteins,="" highlighting="" the="" very="" low="" abundance="" of="" rather="" rare="" viral="" proteins="" in="" human="" urine,="" irrespective="" of="" the="" type="" of="" kidney="" injury,="" and="" irrespective="" of="" baseline="" immunosuppression="">

Los resultados presentados en este artículo provienen del mapeo de péptidos virales, a diferencia de la secuenciación genómica de componentes virales como se informó en publicaciones anteriores (19). Como análisis inicial, nos enfocamos en la prevalencia de proteínas virales urinarias específicas para cada fenotipo de trasplante renal de STA, AR, CAN y BKVN, y las variaciones observadas sobre el viroma de orina de control saludable. Los datos de proteína viral urinaria para cada muestra se evaluaron en cuanto a la abundancia de la muestra en relación con el nivel medio de ese virus en toda la población muestreada. Descubrimos que, en promedio, en el 22 % (rango 4–67 %) de los pacientes con trasplante de riñón se detectaron diferentes proteínas virales en la orina, excluyendo a los pacientes con BKVN, donde es de esperar la detección del virus BK en la orina, ya que estos pacientes tienen una infección por el virus BK en sus vías urinarias y en el trasplante de riñón. La distribución de diferentes proteínas virales en diferentes estados de lesión tx y salud normal se muestra en el mapa de calor de prevalencia (Figura 2). En general, se identificaron un total de 57 proteínas virales de 37 virus únicos, muchas de las cuales fueron inesperadas y no se describieron previamente como "comensales" en la orina humana. De estos virus únicos, 8 virus eran virus de ARN de cadena sencilla, 1 virus era un virus de ARN-RT de cadena sencilla y 28 virus eran virus de ADN de cadena doble (Tabla 1). De los 142 pacientes, todos tenían al menos una proteína viral en la orina, con un promedio de 10,23 ± 4,57 proteínas virales/muestra.

Prevalencia de proteínas virales en orina humana

El grupo de control sano examinado tenía 20 proteínas virales únicas con un promedio de grupo de 13,67 ± 1,32 proteínas virales. Los pacientes con tratamiento renal con IS de mantenimiento y función renal estable tuvieron un número estadísticamente significativo más bajo de virus únicos en el grupo (8,08 ± 2,78; p=7e-10) en comparación con la cohorte sana (con riñón normal). funcional y un sistema inmunitario normal), sin ninguna exposición a SI. En cambio, se detectan nueve proteínas virales nuevas en la cohorte STA en comparación con los controles sanos, pertenecientes a los siguientes virus: virus Junin, bracovirus Cotesia congregata, nucleopoliedrovirus Agrotis segetum, herpesvirus 1 de Psittacid, virus Pseudocowpow, nucleopoliedrovirus múltiples de Spodoptera frugiperda, virus del mosaico del ñame japonés, Virus del moteado del caupí y nucleopoliedrovirus único de Helicoverpa zea. La lesión renal después de tx (a pesar de la exposición continua a IS), da como resultado un aumento general en el número de proteínas virales únicas sobre la cohorte de tx STA, con un aumento significativo en las proteínas virales en orina en el grupo de pacientes CAN (11.46 ± 3.52; p {{ 16}}e-10), y el grupo de pacientes BKVN (15,76 ± 5,65; p=13,7e-10). El repertorio de proteínas virales en la orina parece ser bastante diferente en las diferentes categorías de lesiones por transmisión (Figura 3). La prevalencia de proteínas virales BKV en la orina aumenta al 60-70 por ciento en AR, al 70-80 por ciento en pacientes con CAN y al 100 por ciento en pacientes con BKVN (Figura 2), lo que destaca que puede resultar en una mayor abundancia del virus BK en la orina. de aumento de IS, como se ve en la categoría AR, y con mayor tiempo post-tx, como se ve en la categoría CAN. Las muestras de orina BKVN muestran la máxima divergencia de proteínas virales urinarias, como se esperaba. En la cohorte BKVN ya no se observan cuatro proteínas virales que están constantemente presentes en todas las demás muestras, incluidos los controles sanos normales (virus de la viruela del canario, virus de Tacaribe, virus de los simios 12, virus de Acidianus filamentous 8). Como BKV es un virus de ADN, examinamos si los cambios en el viroma urinario están relacionados en gran medida con la aparición de nuevos virus de ADN en BKVN. Se observan cinco nuevas proteínas virales solo en la cohorte BKVN (nucleopoliedrovirus de Ectropis obliqua, adenovirus D de aves, virus del síndrome de Taura, virus iridiscente de invertebrados 6, herpesvirus de Gallid 2). 4/5 de los virus de la cohorte BKVN eran virus de ADN de doble cadena (Tabla 1).

La abundancia de proteínas virales de la orina humana

A continuación, evaluamos la abundancia de diferentes proteínas virales en todos los pacientes de tx y muestras de orina de HC. Entre los 37 virus únicos examinados, los siguientes virus fueron los más abundantes en pacientes con STA IS (Acidianus filamentous virus 8, Agrotis segetum nucleopolyhedrovirus, BK polyomavirus, Canarypox virus, Cotesia congregata bracovirus, Cowpea mottle virus, Glossina pallidipes salivary gland, hypertrophy virus, Simian virus 12, Tacaribe virus), y se observa una mayor abundancia del Marsellavirus tanto en CAN como en BKVN. A pesar de la infección intrarrenal con el virus BKV en pacientes con BKVN, observamos que también se detectan niveles bajos del virus BK en todas las categorías de tx examinadas y controles sanos, probablemente porque el virus BK es un comensal normal de la orina humana, con su persistencia en el uroepitelio humano. en niveles bajos en casi todos los pacientes examinados con HC y riñón tx no es inesperado.

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DISCUSIÓN

Un estudio sobre el papel del microbioma en el trasplante de órganos (13, 17, 34) tiene en cuenta el impacto de la ingesta de alimentos, la digestión, el metabolismo y la modulación; sin embargo, la disbiosis de la microbiota debida a los medicamentos tx e IS es un factor que contribuye a la disminución de los microbios predominantes de referencia y también provoca una pérdida de la diversidad general y la aparición de pocas poblaciones microbianas dominantes nuevas (35). Un hallazgo muy interesante de este estudio es que solo 8 de los 37 virus identificados en este conjunto de datos se han descrito previamente en humanos, y muchos de estos también se han descrito como patógenos. Se han descrito infecciones humanas con algunos de los virus identificados, lo que sugiere que su presencia en la orina puede estar relacionada con la patogenia de la lesión renal sistémica general o subyacente. La infección por el virus Junín (un arenavirus) puede provocar una enfermedad clínica humana que incluye fiebre, así como una entidad conocida como fiebre hemorrágica argentina (36). El virus Tacaribe es un arenavirus que también puede causar fiebre humana y enfermedad hemorrágica (36). El virus HHV-6 es un virus muy frecuente en los niños y causa fiebre, diarrea y erupciones cutáneas (37). Los rinovirus son virus de ARN monocatenario que son el agente más infeccioso en humanos y el culpable más probable del resfriado común (38). El virus de la clorella de superficie 1 de Acanthocystis ha estado presente en el 44 % de los humanos sanos (39) y solo se ha descrito en la orofaringe y no se sabe que sea patógeno para los humanos. El virus de Marsella es un virus de ADN grande nucleocitoplasmático que se ha descrito en la sangre y las heces de pacientes con linfadenopatía no febril (40).

El virus SV40 es un poliomavirus de ADN que probablemente se introdujo en la población humana a través de vacunas contaminadas (41) y la infección por este virus se coinfecta con frecuencia con la infección por el virus BK, siendo este un hallazgo casi invariable en la población tx. Estudios recientes también han destacado el papel de la infección crónica por SV40 en cánceres humanos (42). Los anticuerpos contra el antígeno T de SV40 reaccionan de forma cruzada con los antígenos T de los virus BK y JC, que pertenecen a la familia de los poliomavirus, y la tinción SV40 se usa para el diagnóstico de la infección por el virus BK en BKVN. La exposición al virus BK, en el riñón, se observa en el 90 por ciento de la población normal, y nuestros datos sugieren que el viroma urinario tiene rastros de proteínas virales BK en todos los controles sanos muestreados.

La replicación del virus BK se observa en el 10-60 por ciento de los pacientes con tratamiento renal que se ha descrito que eliminan el virus BK en la orina, lo que se confirma con nuestros datos (Figura 2). El virus BK está latente en las células epiteliales de los túbulos renales y se sabe que su prevalencia aumenta la disfunción inmunitaria y la exposición a la inmunosupresión (43). En este estudio, no pudimos identificar ninguna diferencia específica del viroma urinario que pudiera distinguir los grupos AR y BKVN, a pesar de que estas condiciones son inmunológicamente distintas y requieren enfoques de tratamiento muy diferentes, es decir, minimización de la inmunosupresión en BKVN y aumento de la inmunosupresión en AR. Se confirmó la categoría AR y hubo una tinción negativa de SV40 en el tejido de la caja examinado. Sin embargo, estos datos sugieren que la detección de BKVN puede estar infranotificada en pacientes con tratamiento renal, y los cambios histológicos pueden ser irregulares, lo que resulta en un diagnóstico infradiagnóstico de la enfermedad de BKVN.

De los 19 virus restantes que no se han descrito previamente en humanos, se ha observado que los siguientes se utilizan como pesticidas/insecticidas (nucleopoliedrovirus de E. obliqua, nucleopoliedrovirus de Euproctis pseudoconspersa, nucleopoliedrovirus de Helicoverpa armigera, nucleopoliedrovirus único de H. zea). Los pesticidas en el uso de la salud pública están destinados a limitar el potencial de la enfermedad, pero se sabe que llegan a los tejidos/fluidos corporales humanos si no se manipulan adecuadamente y que las dietas orgánicas limitan la cantidad de pesticidas en la orina de los niños (44, 45) . El hallazgo de estas proteínas virales en muestras de orina humana plantea una cuestión de exposición ambiental a estos posibles contaminantes no descubiertos previamente.

El hallazgo de una prevalencia del 100 por ciento de algunos virus solo en el grupo de control sano sugiere que hay comensales virales que pueden existir sin causar daño o incluso se puede suponer que ayudan en la adaptación inmunológica. El análisis del árbol filogenético de estos virus puede ser interesante, ya que algunos virus, como los bacteriófagos, desempeñan un papel importante en la salud al eliminar las bacterias patógenas y ayudar a estimular la inmunidad innata (16). Una reducción en los virus o fagos protectores puede dar como resultado una mayor proliferación bacteriana que se observa en el contexto de IS después de un tratamiento renal. La secuenciación metagenómica de las nuevas especies virales encontradas en pacientes tratados con IS puede identificar si la exposición a IS ha cambiado los patrones de resistencia o el resistoma de algunos de los virus, especialmente aquellos que son más propensos a provocar inflamación e inmunidad (16). Se ha demostrado que el tratamiento con nanopartículas de plata reduce las poblaciones virales y bacterianas intestinales que son proinflamatorias (46). Los microbiomas mucinófilos pueden ser más propensos a proporcionar inmunidad protectora que no sea del huésped, y la pérdida de cualquier virus/microbio eosinofílico con IS también puede ser un factor que incremente el riesgo de cistitis e infecciones del tracto urinario que se observa en los pacientes después del tratamiento.

El microbioma se cruza con estados de salud y enfermedad. La detección novedosa de una gran cantidad de virus utilizados como pesticidas/insecticidas es un hallazgo sorprendente. La identificación de virus que no se espera que estén presentes en la orina apunta a la posibilidad de que su origen ingrese a los sistemas corporales por ingestión (contaminación de alimentos, agua u otras bebidas como la leche) o absorción cutánea (p. ej., lavado de manos inadecuado). De hecho, de acuerdo con la ley federal, se reconoce y acepta un pequeño residuo de plaguicidas/insecticidas en la contaminación de los alimentos humanos (41, 47), aunque nadie hasta la fecha ha examinado su presencia en la orina. También es posible que estos virus colonicen o invadan el tracto urinario por infección ascendente, especialmente en el contexto de SI en un paciente con tx renal, donde hay una disminución de las defensas inmunitarias del huésped.

La validación adicional de estos resultados mediante la evaluación del repertorio de viroma humano en diferentes cohortes geográficas y demográficas de pacientes con diferentes causas de lesión renal identificará mejor si el repertorio particular de proteínas virales observado en este estudio es específico para un paciente, su geografía, su demografía, o el subtipo de enfermedad renal. Los estudios de validación adicionales mediante ensayos de PCR viral en orina pueden proporcionar una evaluación rápida del impacto clínico de estos virus en otras cohortes de lesiones renales. Curiosamente, en el repertorio de péptidos virales identificados, no observamos ningún fago. Esto se atribuye a la metodología utilizada para la preparación de péptidos a partir del sobrenadante de orina, que no captura las bacterias (que se precipitan), el anfitrión de los virus fagos (48). El informe de virome basado en el análisis de la secuencia de ADN tampoco identificó fagos en el informe publicado (19). El estudio de viroma en orina que usó el aislamiento de bacteriófagos purificados usando un gradiente de densidad de cloruro de cesio ha informado la identificación de fagos (20). Todos estos artículos respaldan que la metodología de preparación de muestras influye en los hallazgos finales.

La colonización, la resistencia y la ecología microbiana han sido descritas y bien estudiadas en el contexto de las infecciones microbianas (49), y se ha demostrado que el tratamiento con antibióticos (en el contexto del tratamiento de infecciones en los animales que forman productos alimenticios o como parte del profilaxis antiviral para pacientes con tx en los primeros 3 a 6 meses posteriores a la tx) elimina muchas especies bacterianas y virales comensales del intestino y otros fluidos corporales y reduce la defensa antimicrobiana (50). La colonización por microbiota en los primeros años de vida da forma al sistema inmunitario y crea una ventana de oportunidad para un estado homeostático que, si se interrumpe, en el contexto de tx e IS, puede contribuir a la inflamación. Los enfoques de medicina de precisión en el futuro pueden querer personalizar la terapia desde un enfoque "centrado en la microbiota" y "centrado en el huésped" para la medicina de precisión. Hasta hace poco, no habíamos prestado mucha atención al microbioma de los alimentos y al entendimiento de que muchas infecciones emergentes pueden ser transmitidas por los alimentos. Esfuerzos actuales para desarrollar una herramienta de seguimiento del metagenoma que evaluará el impacto de diferentes infecciones (bacterianas, virales y fúngicas) y sus huellas dactilares en el contexto de los alimentos que comemos, que pueden estar influenciados por la temperatura ambiente, la causalidad de supervivencia deficiente de la cohorte animal, y prácticas agrícolas que incluyen el tratamiento del suelo (el tratamiento del suelo con bromuro de metilo como pesticida da como resultado un gran aumento en las especies de Bacillus), las fuentes de agua [diferentes cargas microbianas en el estanque frente al agua de pozo (51)], la genética del cultivo de plantas alimenticias que puede resultar en la alteración de las defensas de las plantas contra los microbios, las plantas y los pesticidas (51). Las lipoproteínas virales y bacterianas pueden ser responsables de las propiedades inmunomoduladoras, y estudios recientes también sugieren un papel para la interacción de la inmunidad innata para regular la diversidad del microbioma y controlar la infección, por linajes celulares específicos como las células T invariantes de la mucosa (células MAIT). Por lo tanto, será fundamental realizar estudios adicionales que se centren en la causa de la diversidad microbiana de los tejidos humanos y su impacto en la inflamación y las respuestas inmunitarias como parte de futuras investigaciones.

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DECLARACIÓN DE ÉTICA

Todas las muestras del estudio se recolectaron de receptores pediátricos y adultos jóvenes trasplantados entre los años 2000 y 2011 en el Lucile Packard Children's Hospital de la Universidad de Stanford. El estudio fue aprobado por los comités de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford y el Centro Médico de la UCSF. Todos los pacientes adultos y los padres/tutores de pacientes no adultos dieron su consentimiento informado por escrito para participar en la investigación, en pleno cumplimiento de la Declaración de Helsinki.

CONTRIBUCIONES DE AUTOR

MS y TS participó en el diseño del estudio; SN, TS, NM y MS participaron en la redacción del artículo y la interpretación de los resultados; NM realizó los análisis estadísticos y la evaluación de resultados; CN, KB-J y W-JQ generaron y procesaron los datos sin procesar.

FONDOS

Reconocemos el apoyo de la Universidad de California San Francisco. Los autores agradecen el apoyo financiero de NIDDK R01DK083447 (a MS), DP3 DK110844 (W-JQ) y P41 GM103493 (W-JQ).

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