Abstracto

Objetivo:Para investigar los efectos deverbascósido (VB; también conocido como acteósido)encuración tendón-huesoen ratas siguientesreconstrucción del ligamento cruzado anterior (LCA)y explorar si elJanus quinasa 2 (JAK2)/transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3)La vía de señalización está involucrada.

Métodos:Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a seis grupos:Impostor, Modelo, VB en dosis bajas (VB‑L), VB de dosis media (VB-M), VB en dosis altas (VB-H), yVB-H + AG490(un inhibidor de la vía JAK2/STAT3). Excepto el grupo Sham, todos los grupos se sometieron a reconstrucción del LCA para establecer el modelo posoperatorio.

Micro‑CTse utilizó para evaluar los parámetros de la microestructura ósea del túnel óseo y para medir laárea de sección transversaldel túnel femoral y tibial.

Pruebas biomecánicasrodilla reconstruida evaluadarigidezycarga máxima.

ELISAmidieron citoquinas inflamatorias y marcadores de estrés oxidativo en el líquido de lavado de rodilla.

Tinción H&EyTinción con safranina O-Fast GreenPatología del cartílago evaluada.

Inmunohistoquímicaexpresión evaluada decolágeno tipo I (COL-I)ymetaloproteinasa de matriz‑13 (MMP13).

mancha occidentalexaminaron proteínas relacionadas conJAK2/STAT3camino.

Resultados:En comparación con el grupo de modelos, VB‑L/VB‑M/VB‑H aumentórelación entre superficie ósea y volumen, espesor trabecular, yBV/TV, y disminuyó elfemoralyárea de la sección transversal del túnel del hueso tibial, con los cambios más significativos en el grupo VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB‑L/VB‑M/VB‑H also increased rigidezycarga máxima, nuevamente más prominente en VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05). ELISA showed that VB reduced TNF‑, IL-6, IL‑1, yMDA, mientras aumentaCÉSPEDyGSH‑Px, siendo VB‑H el que muestra el efecto más fuerte (P<0.05P < 0.05P<0.05). Histology indicated improved cartilage damage with thicker cartilage layers, more orderly chondrocyte arrangement, reduced inflammatory infiltration, increased proteoglycan content, and clearer tidemark-most evident in VB‑H. Immunohistochemistry showed increased COL-Iy disminuidoMMP13en grupos VB (VB‑H más fuerte, P<0.05P < 0.05P<0.05). Western blot indicated increased p‑JAK2/JAK2yp‑STAT3/STAT3en grupos VB (VB‑H más fuerte, P<0.05P < 0.05P<0.05). Compared with VB‑H, AG490revirtió parcialmente estas mejoras.

Conclusión:El verbascosido puede promover la curación del tendón y el hueso en ratas después de la reconstrucción del LCA, potencialmente a través deactivación de la vía de señalización JAK2/STAT3.

Palabras clave:Vía de señalización JAK2/STAT3; verbascósido (actósido); reconstrucción del LCA; curación tendón-hueso

Introducción

La rotura del LCA suele ser causada por deportes de alta intensidad y traumatismos mecánicos, y normalmente se presenta con dolor, inflamación rápida de las articulaciones, inestabilidad y tolerancia reducida al ejercicio, lo que a menudo conduce a una limitación funcional importante. La reconstrucción del LCA se usa ampliamente en la clínica, perola recuperación postoperatoria exitosa depende en gran medida de la integración tendón-huesoen la interfaz injerto-hueso.

En los últimos años, los investigadores han explorado múltiples estrategias para acelerar la curación del tendón y el hueso, comoestimulación física(estiramiento, presión, vibración), implantación de biomateriales y uso de citoquinas o enfoques de ingeniería de tejidos. Aun así, la curación puede ser lenta y los resultados siguen siendo variables, lo que motiva el interés ennuevos enfoques complementarios, incluidocompuestos bioactivos con propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y protectoras de los huesos.

Verbascósido (actósido)es un glucósido feniletanoide soluble en agua que se encuentra en varias plantas medicinales. Se ha informado que exhibeantiinflamatorio, antioxidante, yprotector de huesosactividades, incluida la supresión de la osteoclastogénesis y la mitigación de la erosión ósea en modelos de artritis inflamatoria.

Un candidato mecanicista clave es elJAK2/STAT3vía, una importante cascada de señalización intracelular involucrada en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Trabajos anteriores sugieren que la activación de JAK2/STAT3 puede aumentar el grosor trabecular, la rigidez y la carga máxima en contextos de lesión ósea, lo que favorece la curación de fracturas.

Lista de especificaciones de extracto de cistanche con alto contenido de acteosido

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Donde encaja Cistanche

Para lectores que exploranestrategias de apoyo naturales derivadas de hierbas, es útil saber quecistanche(a menudo discutida en contextos herbarios tradicionales) es una de las plantas frecuentemente mencionadas por contenerglucósidos feniletanoides, incluidoacteosido (verbascosido)en algunas preparaciones. Esto hacenosignifica que es una terapia postoperatoria probada o aprobada para la reconstrucción del LCA; más bien, proporciona un contexto botánico de por qué el acteósido/verbascósido ha atraído la atención de la investigación. En modelos animales controlados como el de este estudio, el uso de un compuesto definido (VB) permite realizar pruebas mecanísticas, algo que los suplementos de hierbas enteras no pueden garantizar debido a la variabilidad en la composición y la dosis.

Por lo tanto, este estudio investiga si el verbascosido puede mejorar la curación del tendón-hueso en un modelo de reconstrucción del LCA de rata y si este efecto se relaciona conActivación JAK2/STAT3.

Materiales y métodos

1. animales

Se obtuvieron ratas macho SPF SD (7 semanas de edad, 200–220 g) del Departamento de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Hebei (licencia: SCXK (Hebei) 2025‑005). Condiciones de alojamiento: humedad del 55 % al 65 %, temperatura de 22 a 24 grados, ciclo de luz/oscuridad de 12 h, libre acceso a alimentos y agua. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Facultad de Medicina de Cangzhou (nº de aprobación. 2202130618).

2. Medicamentos y Reactivos

Verbascósido (pureza 99,8 %, HY‑N0021‑107208), AG490 (pureza 99,0 %, HY‑12000‑09922): Shanghai Haoyuan Biopharmaceutical Technology Co., Ltd.

Kits de ELISA para TNF‑ (ml002859), IL‑6 (ml102828), IL‑1 (ml003057), SOD (EK‑M26101), MDA (EK‑M29370), GSH‑Px (EK‑M27911): Shanghai Enzyme‑linked Biotechnology Co., Ltd.

Anticuerpos: JAK2 (FNab04432), STAT3 (FNab08298) de Wuhan Fine Biotech; COL-I (GTX82720), MMP13 (GTX100665), p-JAK2 (GTX32203) de GeneTex; p-STAT3 (bsm-52210R) de Bioss; -actina (48139) de Nanjing Saigowe; HRP-IgG de cabra anti-conejo (P0948) de Beyotime.

3. Instrumentos

Lector de microplacas (EnVision), microscopio (Olympus BX51), sistema de imágenes en gel (Bio‑Rad GelDoc Go).

4. Establecimiento, agrupación y administración de modelos

Modelado (reconstrucción del LCA):Las ratas fueron anestesiadas con hidrato de cloral al 10% intraperitoneal (4 ml/kg). Se realizó una incisión parapatelar medial para exponer el LCA, que se seccionó (pruebas de cajón y de Lachman positivas). Se perforaron túneles tibiales y femorales en la huella nativa del LCA. Se pasó un injerto de tendón fijo a través del túnel tibial hacia la cavidad articular y hacia el túnel femoral, luego se suturó y se fijó en el tejido blando femoral lateral cerca de la salida del túnel. Con la rodilla flexionada a 30 grados, se suturó el extremo tibial y se fijó al puente óseo del túnel tibial y al tejido blando circundante. Las pruebas de cajón y de Lachman negativas y una buena tensión del injerto indicaron una reconstrucción exitosa. Se cerró la incisión, se desinfectó y se inyectó penicilina durante 3 días para prevenir la infección. Criterios de éxito: cajón/Lachman negativo y buena tensión del injerto.

Agrupamiento:Se utilizaron 120 ratas. Dieciocho fueron seleccionados al azar como simulados (solo incisión y cierre). De las 102 ratas modeladas restantes, 90 se establecieron con éxito (tasa de éxito del 88,24 %) y se asignaron aleatoriamente (18 por grupo) a: Modelo, VB‑L, VB‑M, VB‑H y VB‑H+AG490.

Régimen de dosificación (una vez al día durante 8 semanas):

VB‑L/VB‑M/VB‑H: 50/100/200 mg/kg VB por sonda + solución salina de igual volumen por vía intraperitoneal.

VB‑H+AG490: 200 mg/kg VB por sonda + AG490 5.0 mg/kg por vía intraperitoneal.

Simulado/Modelo: dosis igual de solución salina por sonda + solución salina por vía intraperitoneal.

5. Micro-CT

Después de la eutanasia, se recolectaron articulaciones de rodilla intactas con fémur y tibia adyacentes y se fijaron en paraformaldehído al 4% a 4 grados durante 24 h. Las muestras se envolvieron en papel húmedo sin pelusa y se escanearon con Micro-CT de 360 ​​grados (resolución de 10 μm; 70 kV; 114 μA; exposición de 400 ms; filtro de Al de 0,5 mm). Parámetros analizados:relación superficie ósea/volumen, BV/TV, espesor trabecular; yÁrea de sección transversal de los túneles femoral y tibial..

6. Pruebas biomecánicas

Las rodillas reconstruidas se montaron en una máquina de prueba de materiales. Se aplicó una precarga de 0,8 N para eliminar la holgura, seguida de una prueba de tracción a 5 mm/min hasta que la carga cayó aproximadamente un 25 % desde el pico. Se registró el desplazamiento de carga yrigidezcalculado.

7. ELISA para factores de estrés inflamatorio y oxidativo en el lavado de rodilla

Se abrieron las rodillas en la bolsa suprapatelar y se lavaron con solución salina tres veces para recoger el líquido de lavado. Después de la centrifugación (2000 r/min, 15 min), se utilizaron los sobrenadantes para cuantificarTNF‑, IL-6, IL‑1y marcadores de estrés oxidativoCÉSPED, GSH‑Px, MDApor ELISA.

8. Tinción verde rápida con H&E y safranina O

Las rodillas se fijaron, descalcificaron, se incluyeron en parafina, se seccionaron a 4 μm, se desparafinaron, se rehidrataron y se tiñeron con H&E y Safranin O-Fast Green para la evaluación de la patología del cartílago.

9. Inmunohistoquímica para COL-I y MMP13

Después del procesamiento de rutina, se realizaron la recuperación y el bloqueo del antígeno. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios contra COL-I y MMP13 durante la noche a 4 grados, luego con anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizó DAB para el desarrollo del color, se realizó una contratinción con hematoxilina y se observó la expresión microscópicamente.

10. Western Blot para proteínas de la vía JAK2/STAT3

La proteína total se extrajo de los tejidos de la rodilla, se cuantificó, se desnaturalizó, se separó mediante electroforesis, se transfirió a PVDF y se bloqueó. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios contra p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3 y -actina durante la noche a 4 grados, seguido de anticuerpo secundario HRP durante 1 h. Las bandas fueron visualizadas y analizadas mediante densitometría.

 

Tabla 6. Comparación de los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la vía de señalización JAK2/STAT3 en los tejidos de las articulaciones de la rodilla de cada grupo de ratas (n=6n=6n=6, media ± DE)

Grupo	p‑JAK2/JAK2	p‑STAT3/STAT3
Impostor	0.95 ± 0.10	0.88 ± 0.10
Modelo	0.34 ± 0.04a^{a}a	0.25 ± 0.04a^{a}a
VB‑L	0.52 ± 0.06b^{b}b	0.43 ± 0.05b^{b}b
VB‑M	0,71 ± 0,08bc^{bc}bc	0,61 ± 0,07bc^{bc}bc
VB‑H	0,92 ± 0,10bcd^{bcd}bcd	0,83 ± 0,09bcd^{bcd}bcd
VB-H + AG490	0.55 ± 0.06e^{e}e	0.46 ± 0.05e^{e}e

11. Análisis estadístico

Los datos se distribuyeron normalmente y se expresaron como media ± DE. Se utilizó SPSS 29.0. Se aplicó ANOVA unidireccional para comparaciones multigrupo y prueba SNK-q para comparaciones por pares. PAG<0.05P < 0.05P<0.05 indicated statistical significance.

Resultados

1. Microestructura del túnel óseo y área de la sección transversal del túnel

En comparación con Sham, el grupo Modelo mostró una disminuciónrelación superficie ósea/volumen, espesor trabecular, yBV/TV, y aumentófemoralyárea de la sección transversal del túnel tibial (P<0.05P < 0.05P<0.05). Compared with Model, VB‑L/VB‑M/VB‑H increased bone microstructure parameters and decreased tunnel cross‑sectional areas (P<0.05P < 0.05P<0.05), with VB‑H being most significant. Compared with VB‑H, VB‑H+AG490 reduced these improvements and increased tunnel areas (P<0.05P < 0.05P<0.05).

2. Rigidez de la rodilla y carga máxima

En comparación con Sham, el grupo Modelo exhibió una reducciónrigidezycarga máxima (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB‑L/VB‑M/VB‑H significantly increased both outcomes vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 partially reversed the VB‑H benefits (P<0.05P < 0.05P<0.05).

3. Citoquinas inflamatorias en el lavado de rodilla

TNF‑, IL‑6 e IL‑1 estuvieron elevados en el grupo modelo frente a Sham (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB treatment decreased these cytokines vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05). AG490 increased cytokine levels vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

4. Marcadores de estrés oxidativo en el lavado de rodilla

Las ratas modelo habían aumentadoMDAy disminuidoCÉSPEDyGSH‑Pxvs farsa (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB lowered MDA and raised SOD and GSH‑Px vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05). AG490 partially reversed these effects vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

5. Patología del cartílago (H&E y Safranin O–Fast Green)

H&E mostró una lesión grave del cartílago en el grupo Modelo con pérdida de estructura en capas, células superficiales dañadas y desorganizadas y una marcada infiltración inflamatoria. Los grupos VB mostraron una mejora significativa: cartílago más grueso, más condrocitos con disposición ordenada y reducción de la infiltración inflamatoria; VB‑H tuvo la mejora más clara.
Safranin O – Fast Green indicó una pérdida severa de proteoglicanos y una marca de marea irregular/ausente en el modelo, mientras que VB restableció la tinción de proteoglicanos y la integridad de la marca de marea; AG490 empeoró la patología en relación con VB‑H.

6. Expresión COL-I y MMP13

En comparación con Sham, el modelo mostró una disminuciónCOL-Iy aumentadoMMP13 (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB increased COL‑I and decreased MMP13 vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 partially reversed these changes (P<0.05P < 0.05P<0.05).

7. Proteínas de la vía JAK2/STAT3

Las ratas modelo habían reducidop‑JAK2/JAK2yp‑STAT3/STAT3vs farsa (P<0.05P < 0.05P<0.05). VB increased both ratios vs Model (P<0.05P < 0.05P<0.05), strongest in VB‑H. AG490 decreased both ratios vs VB‑H (P<0.05P < 0.05P<0.05).

 

Discusión

Los tendones conectan los músculos con los huesos y son esenciales para restaurar la función articular. En el contexto de la reconstrucción del LCA, la integración tendón-hueso es un determinante importante de la estabilidad mecánica y la recuperación funcional. En este modelo, la cirugía afectó la microarquitectura y la biomecánica ósea (menor BV/TV, espesor trabecular, rigidez, carga máxima; áreas de túnel más grandes), consistente con un retraso en la maduración de la interfaz.

La inflamación desempeña un doble papel en la curación tendón-hueso: una respuesta inflamatoria controlada puede eliminar los desechos y favorecer la proliferación celular y la formación de colágeno, mientras que la inflamación excesiva promueve daño tisular, adherencias y formación de cicatrices. Aquí, TNF-, IL-6 e IL-1 aumentaron notablemente después de la reconstrucción, lo que indica un entorno proinflamatorio probablemente desfavorable para la curación organizada de la interfaz.

El estrés oxidativo es igualmente importante. Un nivel elevado de MDA con reducción de SOD y GSH‑Px sugiere un aumento de la peroxidación lipídica y una reducción de la defensa antioxidante. El estrés oxidativo puede alterar la osteogénesis y alterar la remodelación de la matriz. Paralelamente, el aumento de MMP13 y la reducción de COL-I implican una degradación acelerada de la matriz extracelular, lo que puede retrasar la estabilización de la interfaz tendón-hueso.

Por qué el verbascosido (acteoside) es interesante en estrategias "naturales"

El verbascósido es un compuesto de origen vegetal con propiedades antiinflamatorias y antioxidantes, lo que se alinea con la idea de que la modulación de los microambientes inflamatorios y oxidativos podría ayudar a la curación de la interfaz. En este estudio, VB mejoró la microestructura ósea, redujo el agrandamiento del túnel, mejoró la resistencia mecánica, redujo las citocinas inflamatorias, mejoró los marcadores redox, aumentó el COL-I y redujo la MMP13, lo que sugiere un cambio coordinado hacia una remodelación constructiva en lugar de una inflamación destructiva.

JAK2/STAT3 como centro mecánico

La vía JAK2/STAT3 se activa cuando las señales extracelulares se unen a los receptores de citocinas, lo que promueve la fosforilación de JAK2, el reclutamiento/fosforilación de STAT3, la dimerización de STAT3 y la translocación nuclear para regular genes implicados en la inflamación, la respuesta al estrés oxidativo y la formación ósea. Los resultados actuales mostraron una disminución de la activación de la vía después del modelado, pero VB aumentó p-JAK2/JAK2 y p-STAT3/STAT3. Es importante destacar que el bloqueo de la vía con AG490 revirtió parcialmente los beneficios de VB en micro-CT, biomecánica, marcadores de inflamación/oxidación, proteínas remodeladoras de la matriz y participación de la vía de apoyo histológico.

 

Contexto "natural" práctico: cistanche y botánicos ricos en actósidos

Para audiencias interesadas en estrategias derivadas de hierbas,cistancheA menudo se analiza como una fuente botánica de glucósidos feniletanoides, incluido el acteósido/verbascósido en algunas preparaciones. Desde una perspectiva traslacional, el punto científico clave es queuna dosis definida de VB purificadopueden validarse mecánicamente en modelos animales, mientras que los productos de hierbas enteras pueden variar en composición, método de extracción y biodisponibilidad. Por lo tanto, si bien Cistanche es relevante para la conversación sobre los productos botánicos ricos en actósidos, la evidencia en este manuscrito respalda específicamenteverbascosido como compuestoen un modelo de rata postoperatorio controlado, no es una recomendación clínica.

Conclusión general:El verbascósido puede mejorar la curación del tendón-hueso después de la reconstrucción del LCA en ratas, potencialmente activando la señalización JAK2/STAT3 y mejorando el microambiente inflamatorio/oxidativo al tiempo que favorece la integridad de la matriz de colágeno.

 

Referencias

(La lista traducida se conserva tal como está de su manuscrito; puedo formatearla según el estilo de la revista de destino si me dice la revista).