¿Cuál es la diferencia entre la cistanche de cultivo salvaje y la cistanche cultivada artificialmente en la actividad de mejora de la inmunidad?

Contacto: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

ZhaoBing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; zhang ailian

Resumen:

Objetivo:Comparar los efectos de mejora inmunológica de la cistanche de crecimiento silvestre y los polisacáridos de cistanche cultivados artificialmente (en lo sucesivo: WCDPS y CCDPS, respectivamente).

Métodos:Se inmunizaron por vía subcutánea diferentes dosis (baja, media y alta) de WCDPS y CCDPS y ovoalbúmina (OVA) con ratones ICR, anticuerpos IgG específicos de OVA y subtipos de anticuerpos IgGl e IgG2a detectados por ELISA y por el método MTT. Actividad de proliferación de linfocitos específica de OVA, citometría de flujo para detectar el nivel de expresión de células T CD4 plus y células T CD8 plus.

Resultados:Tanto WCDPS como CCDPS pueden aumentar significativamente los niveles de expresión del anticuerpo IgG específico de OVA y el tipo de anticuerpo IgG1 e IgG2a (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS y CCDPS también pueden aumentar significativamente el porcentaje de subcontenido de células CD4 más T y CD8 más T (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS y CCDPS no tuvieron efecto sobre el peso de los ratones inmunizados.

Conclusión:Tanto WCDSP como CCDPS pueden mejorar significativamente las respuestas inmunes celulares y humorales específicas de OVA, y no hay una diferencia estadísticamente significativa entre los dos, y tienen buena seguridad.

Palabras clave: cistanche; polisacáridos de cistanche; ovoalbúmina; auxiliar

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),también conocida como Cunyun y Dayun, es una planta herbácea parásita de las Lydanaceae desde hace muchos años. Es un material medicinal chino raro y precioso. Sus ingredientes principales incluyen polisacáridos de cistanche, compuestos de glicósido feniletanoide de cistanche, ácidos orgánicos, alcaloides, etc.⑷, tienen múltiples funciones como nutrir la esencia y la sangre, ayudar al yang y tonificar el riñón y aliviar el envejecimiento⑸. Debido al altísimo valor medicinal de la cistanche, la sobreexplotación de especies silvestres está al borde de la extinción, y la cistanche cultivada artificialmente ha tenido éxito. Los investigadores nacionales y extranjeros han investigado mucho sobre los componentes químicos y los ingredientes activos de la cistanche de crecimiento silvestre y la cistanche cultivada artificialmente, pero hay pocos informes sobre la comparación de los polisacáridos de cistanche silvestres y cultivados de la actividad adyuvante de cistanche (WCDPS/CCDPS). . Un gran número de estudios han demostrado que los polisacáridos vegetales de la cistanche como adyuvante pueden regular la respuesta inmunitaria del organismo. Muchos investigadores han utilizado la medicina herbal china como adyuvante de vacunas y han logrado un buen progreso ".

Este estudio se basa en la investigación previa (6) para comparar lainmuno-mejoradoractividades de Xinjiang WCDPS y CCDPS. Principalmente a través de experimentos de inmunización en ratones, diferentes dosis de WCDPS y CCDPS fueron inmunizadas por vía subcutánea con OVA en ratones ICR, y sus efectos sobre el nivel de humoralinmunidady la inmunidad celular inducida por OVA después de la inmunización. Compararcrecer salvajemente cistancheycistanche cultivada artificialmentepolisacáridos La actividad de mejora inmunológica de los polisacáridos en los cítricos puede proporcionar una referencia para un mejor desarrollo y utilización de la cistanche cultivada artificialmente en Xinjiang.

Materiales y método

Materiales experimentales:

Cultive salvajemente cistanche y cistanche cultivada (disponible comercialmente). El medio de cultivo RPMI 1640 se adquirió de GIBCO; El suero bovino fetal se adquirió de Israel Bioind; Anticuerpos de citometría de flujo: PE rata-anti-ratón CD3, APC rata-anti-ratón CD4, FITC rata-anti-ratón CD8a se adquirieron de la compañía estadounidense BD, producto Sigma de proteína de clara de huevo (ovoalbúmina, OVA), anti-ratón de cabra marcado con peróxido de rábano picante IgG, IgGl e IgG2a se adquirieron de Southbiotech, EE. UU. Los demás reactivos químicos experimentales son todos reactivos analíticos domésticos.

Animales de experimentación:

Se compraron ratones ICR hembra de grado limpio (6-8 semanas, 18-22 g) del Centro de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Xinjiang. Los animales se mantuvieron en la sala de animales de nuestro laboratorio y el experimento se inició 7 días después de la aclimatación de los animales.

Preparación de WCDPS y CCDPS:

La referencia [17] utiliza el método de extracción con agua y precipitación con alcohol. Los breves pasos son los siguientes: Tome polvo seco de cistanche cultivado y salvaje de Xinjiang, agregue 10 veces el volumen de vaselina y etanol absoluto a ultrasonidos durante 1 h; después de la filtración por succión, conserve el residuo del medicamento y seque, agregue 10 veces el volumen de agua destilada Ultrasonido 37T dos veces, centrifugar a 4 000 r/min durante 10 min, combine los sobrenadantes, evapore rotatoriamente y concentre, y precipite durante la noche con alcohol; después de la filtración al vacío y secado, se obtiene el polvo de extracto crudo; El método salvaje ⑻ elimina la proteína de WCDPS y CCDPS. El contenido de polisacáridos de cistanche en WCDPS y CCDPS determinados por el método de ácido sulfúrico de cebolla fue 76.82 por ciento y 59.58 por ciento, respectivamente.

Inmunización de ratones y recolección de suero:

Se usaron ratones hembra ICR de {{0}} semanas de edad como modelos animales experimentales. El experimento se dividió en 9 grupos, 5 en cada grupo: 0.9 por ciento NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 neto, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 neto. Disolver con NaCl al 0,9 por ciento antes de la inmunización e inmunizar a los ratones por vía subcutánea dos veces con un intervalo de 2 semanas. La sangre se recolecta antes de la inmunización y el suero-80Y se prepara y almacena para su uso posterior.

Los efectos de WCDPS y CCDPS en el crecimiento de ratones:

Para observar los efectos de WCDPS y CCDPS en el crecimiento de los ratones, se pesaron los pesos de los ratones en cada grupo 0 d antes de la inmunización inicial, 14 d y 21 d después de la inmunización.

Detección de anticuerpos IgG en suero de ratón y tipificación después de la inmunización con WCDPS y CCDPS:

Se utilizó el método ELISA indirecto para determinar los anticuerpos séricos. Se revistió la placa ELISA con 2,5 µg/ml de OVA, 4Y durante la noche; se lavó con PBST 3 veces y luego se agregó leche en polvo descremada al 5 por ciento 37 L para bloquear durante 1 hora; se lavó 3 veces con PBST y se añadió el anticuerpo primario a los ratones después de la inmunización en cada grupo Suero, la relación de dilución del anticuerpo primario es 1: 100, 100 píldoras por pocillo, 37 Tl h; después de lavar 3 veces con PBST, agregue anticuerpos secundarios: cabra anti-ratón IgG, IgGl, IgG2a (l: 5 000) marcados con HRP 37 Incube el dragón durante 1 h; después de lavar 4 veces con PBST, agregue solución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB) para evitar la luz durante 15 min. Agregue 50 a cada pocillo para detener la reacción con 2 mol/L de H2SO4 y mida el valor A45O/655. Compare los niveles de anticuerpos en cada grupo.

Detección de proliferación de linfocitos esplénicos de ratón después de la inmunización con WCDPS y CCDPS:

Se utilizó el método MTT para detectar la proliferación de linfocitos en el bazo de ratones inmunizados con CCDPS y WCDPS. El bazo de los ratones se aisló en condiciones asépticas 21 días después de la inmunización inicial y las células del bazo se diluyeron con medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10 por ciento para hacer células individuales Suspensión, recuento y ajuste de las células (r células/ml esparcidas en una 96-placa de cultivo celular de pocillos, añadir 20 OVA (concentración final 10 |xg/ml) y ConA (concentración final 5 µg/ml) respectivamente Estimular, establecer un control de células vacías y un suero vacío control al mismo tiempo, colóquelo en una incubadora de células 37Y durante 48 horas, agregue 20 MTT a cada pozo, 37^ y continúe incubando durante 4 horas, agregue 100|±1 DMSO a cada pozo para disolver y probar el corazón 0 /63 Valor, calcular el índice de estimulación (SI) de cada grupo de ratones.

La expresión de CD4 y CD8 en células T CD3 plus después de la inmunización con WCDPS y CCDPS:

Se usó citometría de flujo para detectar la expresión de células T CD4 plus y CD8*T en la superficie de células T CD3 plus. El bazo del ratón se aisló en condiciones asépticas 21 días después de la inmunización primaria, y el bazo se trató con medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10 por ciento. Prepare una suspensión de células individuales, cuente y ajuste el número de células a 1x106 células/muestra, realice la tinción de CD4 y CD8 en la superficie de las células T CD3 más, proteja de la luz a temperatura ambiente durante 25 minutos y use 10 ml de un solución tamponada con fosfato que contiene 0.5 por ciento de FBS (solución tamponada con fosfato). solución salina, PBS) 1 200 r/min 7 min lavar una vez, agregar 250 |jil de PBS, pasar malla de cobre de malla 200, citometría de flujo para detectar la expresión de CD4 y CD8 en la superficie de las células T CD3*.

Métodos de estadística:

El software Flowjo 7.6 procesa los resultados de las pruebas de citometría de flujo; GraphPad Prism 5.0 se utiliza para el análisis de datos, y todos los datos se basan en la media ± desviación estándar. Use Student y pruebe para comparar los datos entre los grupos experimentales. PAGS<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Resultado

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. El efecto de WCDPS y CCDPS sobre el anticuerpo IgG específico de OVA: WCDPS y CCDPS se inmunizaron por vía subcutánea con OVA para detectar la expresión del anticuerpo IgG específico de OVA en el suero después de 14 días y 21 días de inmunización. Los resultados se muestran en la Figura 1, WCDPS y CCDPS promovieron la expresión del anticuerpo IgG en el suero de manera dependiente de la dosis; OVA más WCDPS 50 p,g en comparación con OVA más CCDPS 50 |xg pueden promover significativamente los anticuerpos específicos de OVA en comparación con OVA más CCDPS 50 |xg. La expresión de IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. El efecto de WCDPS y CCDPS en la tipificación de anticuerpos específicos de OVA: 21 días después de la inmunización, se detectó la expresión de anticuerpos específicos de OVA tipificando IgG1 e IgG2a en suero. Los resultados se muestran en la Figura 2. OVA-WCDPS 50 jig y OVA-WCDPS 100 |xg Mumu promovieron significativamente la expresión del anticuerpo IgG2a en suero que el grupo OVA solo (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. El efecto de WCDPS y CCDPS en la proliferación de linfocitos específicos de OVA de ratón: para detectar el efecto de WCDPS y CCDPS en los linfocitos esplénicos, los polisacáridos de cistanche se inmunizaron por vía subcutánea con OVA y las células del bazo se separaron 21 días después de la inmunización. , y se utilizó el método MTT para detectarlos Promover la proliferación de linfocitos específicos de OVA. Los resultados se muestran en la Figura 3. WCDPS y CCDPS mejoraron la proliferación de linfocitos específicos de OVA de una manera dependiente de la dosis. La combinación de WCDPS y CCDPS con el grupo OVA puede promover significativamente la proliferación de linfocitos específicos de OVA en comparación con el grupo OVA solo. Proliferación de linfocitos (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. El efecto de WCDPS y CCDPS en las células CD3 más CD4 más T y CD3 más CD8 más T: 21 días después de que WCDPS y CCDPS se inmunizaran por vía subcutánea con OVA, se detectó la expresión de CD4 y CD8 en células T CD3 más mediante citometría de flujo , como se muestra en la Figura 4A Se muestra que OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 jig y OVA-WCDPS 100 pueden promover significativamente la proliferación de células T CD3 más CD4 más (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Discusión

Numerosos estudios han demostrado que la medicina herbal china tiene una función inmunomoduladora "Da], y también hay una gran cantidad de informes que prueban que los polisacáridos de la medicina herbal china de la cistanche se pueden usar como adyuvante para mejorar el efecto inmunológico de las vacunas"3], y la carne del desierto de Xinjiang de Congrong seleccionada en este estudio es un material medicinal único en Xinjiang, y las especies silvestres están al borde de la extinción, combinado con su mayor valor medicinal, el cultivo de especies cultivadas es particularmente importante para el desarrollo y la utilización de recursos de plantas medicinales . Las nuevas vacunas en el mercado actual tienen una buena especificidad antigénica, pero una baja inmunogenicidad. Los polisacáridos vegetales de la cistanche pueden compensar esta deficiencia. mi país tiene una gran ventaja en la investigación de la fitoterapia china. Examinamos adyuvantes de vacunas de hierbas medicinales chinas naturales. Alta factibilidad. Los estudios han demostrado que los polisacáridos de hierbas chinas de la cistanche tienen diversos grados de regulación sobre la inmunidad específica y la inmunidad no específica, como los polisacáridos de Ganoderma de la cistanche, los polisacáridos de Radixisatidis de la cistanche, los polisacáridos de Poria cocos de la cistanche koji, los polisacáridos de inulina de la cistanche 27], etc. Puede potenciar el efecto inmunológico de la vacuna.

Debido al rápido aumento de la demanda de cistanche, sus especies silvestres se han extinguido y ahora figuran como plantas protegidas y en peligro de extinción en mi país. Basado en el éxito de la plantación artificial del desierto de Caulis Carlsbad, se espera que las especies cultivadas reemplacen a las especies silvestres. En este experimento, se usaron polisacáridos de cistanche de cultivo silvestre y polisacáridos de cistanche cultivados artificialmente como adyuvantes de OVA para llevar a cabo experimentos de inmunización de ratones in vivo. Al probar varios indicadores, se evaluó inicialmente el efecto inmunológico de la cistanche silvestre y cultivada, lo que proporcionó una referencia para el uso efectivo de la cistanche cultivada en Xinjiang.

Para comprender la seguridad de la cistanche de cultivo silvestre y cultivada artificialmentesacáridos de cistanchede cistanche, los experimentos de inmunización en animales in vivo han observado las características de apariencia de los ratones y han encontrado que los ratones no tienen diarrea, pelo erecto o lágrimas después de la inmunización, y sus actividades y respiración son normales, y no hay espasmos musculares. No hubo diferencia significativa en el peso corporal de los ratones en cada grupo debido al fenómeno del trastorno, lo que indica que la inmunización con WCDPS y CCDPS no afectó el crecimiento de los ratones y tiene cierto grado de seguridad. El anticuerpo IgG y los resultados de la prueba de tipificación muestran: WCDPS y CCDPS pueden aumentar significativamente la expresión del anticuerpo IgG específico de OVA después de la co-inmunización con OVA, y el efecto es equivalente al adyuvante de aluminio; puede mejorar significativamente la expresión de anticuerpos específicos de OVA tipo IgG2a e IgGl. Muestra que los polisacáridos de cistanche mejoran la respuesta inmune Th1 y Th2 al mismo tiempo, y no hay una diferencia significativa entre WCDPS y CCDPS. Los resultados de la tipificación de anticuerpos IgG2a encontraron que el grupo de co-inmunización WCDPS y CCDPS y OVA puede mejorar significativamente la expresión de IgG2a en comparación con el grupo adyuvante de aluminio, un adyuvante de aluminio es más débil en la promoción de la expresión de células T, lo que prueba que se utilizan WCDPS y CCDPS como adyuvantes La capacidad de promover la inmunidad celular es significativamente mayor que la de los adyuvantes de aluminio.

Los resultados de la detección de la proliferación de linfocitos por el método MTT mostraron que las células del bazo de los ratones en cada grupo fueron estimuladas por OVA. El índice de estimulación (SI) de la proliferación de linfocitos en WCDPS y CCDPS combinados con OVA fue significativamente mayor que en el grupo de inmunización con OVA sola. OVA: el índice de estimulación del grupo WCDPS 50 Ah y OVA-CCDPS 50 jig fue significativamente mayor que el del grupo adyuvante de aluminio; indica que WCDPS y CCDPS combinados con el grupo OVA pueden aumentar significativamente la proliferación de linfocitos específicos de OVA en comparación con el grupo OVA y el grupo adyuvante de aluminio.

Hay diferentes subgrupos de linfocitos T. CD3 es la molécula de superficie de todos los linfocitos T. Según los diferentes fenotipos, se pueden dividir en células T CD8 plus y células T CD4. Las moléculas CD4 plus se pueden formar bajo la acción de las moléculas MHC fl, que se utilizan principalmente como células auxiliares (Th) después de la activación. Las moléculas CD8 plus deben formarse bajo la acción de las moléculas MHC I. Después de la activación, se convierten en células asesinas (TC o CTL), que desempeñan un papel importante en la inmunidad contra las infecciones virales y la inmunidad tumoral. 3". La citometría de flujo detecta la expresión de células T CD3PD4 más T y CD3 más CD8 más T, los resultados muestran que WCDPS y CCDPS pueden promover significativamente la proliferación de células T CD4 más T y CD8 más T dentro de un cierto rango de dosis, y no hay diferencia entre WCDPS y CCDPS en la misma dosis.La combinación de CCDPS y OVA puede estimular la expresión de CD3 más CD4 más T y CD3 más CD8 más células T, y los dos efectos son equivalentes.

En resumen, WCDPS y CCDPS son seguros como adyuvantes. Después de ser inmunizados con OVA, pueden mejorar simultáneamente la inmunidad humoral específica y la inmunidad celular. En comparación con los adyuvantes de aluminio, WCDPS y CCDPS tienen mejores efectos sobre la mejora de la inmunidad celular y no hay diferencia en los efectos de mejora de los dos polisacáridos de la cistanche. Estos resultados de investigación proporcionan referencias materiales para los polisacáridos de cistanche cultivados artificialmente en Xinjiang como adyuvantes y también proporcionan la base material para evaluar adyuvantes inmunitarios seguros y eficientes del desierto de Xinjiang.cistanche.

Referencias

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, et al. La respuesta inmune adyuvante de polisacáridos de Atractylodis macrocephalus Koidz en pollos vacunados contra la enfermedad de Newcastle (ND) [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. carbohidrato 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W, et al. El extracto acuoso de ferulato de Pleurotus mejora la maduración y la función de las células dendríticas derivadas de la médula ósea murina a través de la vía de señalización TLR4 [J]. Vacuna, 2015, 33(16): 1923-1933. DOI: 10.1016/j. vacuna.2015.02. 063.

[3]Zhao H, Luo Y, Lu C, et al. La respuesta inmune de la mucosa entérica podría desencadenar la actividad de inmunomodulación del polisacárido de Ganoderma en ratones [J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.