Cistanche para tratar la inflamación y la enfermedad renal: ¿Cuál es la causa del papel patógeno de la inflamación en la afectación renal en la cistinopatía?
Mar 13, 2022
Contacto:joanna.jia@wecistanche.com
La interacción entre la galectina-3 y la cistinosina revela un papel patógeno de la inflamación en la afectación renal de la cistinosis
tatiana lobry1,2 y otros
Inflamaciónparticipa en la patogenia de muchos trastornos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a menudo se desconocen. Aquí probamos sicistinosis, la proteína implicada encistinosis, es un regulador crítico de la galectina-3, un miembro de la familia de proteínas de unión de b-galactosidasa, duranteinflamación. cistinosises un trastorno de almacenamiento lisosomal y, a pesar de la expresión ubicua de cistinosis, lariñónes el principal órgano afectado por la enfermedad.cistinosisse encontró que mejora la localización lisosomal y la degradación de la galectina-3. en cajas–/–ratones, un modelo de ratón decistinosis, la galectina-3 está sobreexpresada en elriñón. La ausencia de galectina-3 en ratones cistinóticos mejora la función y estructura renal patológica y disminuye la infiltración de macrófagos/monocitos en el riñón de los Ctns–/–Gal3–/–ratones en comparación con Ctns–/– ratones. Estos datos sugieren fuertemente que la galectina-3 mediainflamaciónenvuelto enriñónprogresión de la enfermedad en la cistinosis. Además, se descubrió que la galectina-3 interactúa con la citoquina proinflamatoria MonocyteChemoattractant Protein-1, que estimula el reclutamiento de monocitos/macrófagos, y se demostró que aumenta significativamente en el suero de ratones Ctns–/– y también pacientes concistinosis. Por lo tanto, nuestros hallazgos resaltan un nuevo papel para la interacción de la cistinosis y la galectina-3 en la inflamación y brindan una explicación mecánica adicional para lariñónenfermedad de la cistinosis. Esto puede conducir a la identificación de nuevos objetivos farmacológicos para retrasarcistinosisprogresión.
PALABRAS CLAVE:enfermedad renal cronica; cistinosis; galectina-3;inflamación; proteína quimioatrayente de monocitos–1
la cistanche puede tratar la enfermedad renal crónica y la cistinosis
La causa raíz de la inflamación es que el óxido nítrico puede conducir a la producción de células inflamatorias.Cistanchees una valiosa medicina herbaria china. Sus ingredientes activos pueden inhibir la secreción de óxido nítrico y desempeñar un papel en la prevención y el tratamiento de la inflamación y la enfermedad renal.
Declaración de traducción
A pesar del tratamiento, los pacientes siguen progresando hacia la insuficiencia renal terminal. En este estudio demostramos que la ausencia decistinosisda como resultado una degradación lisosomal de galectina -3 (Gal-3), lo que lleva ainflamacióny la progresión deenfermedad renal cronicaencistinosis. Estos hallazgos abren nuevas perspectivas sobre posibles dianas terapéuticas que podrían limitar o retrasar la degeneración renal en pacientes concistinosis. Como tales, los fármacos antiinflamatorios y los inhibidores de Gal-3, como los fármacos antiinflamatorios no esteroideos o la indometacina, pueden mejorar la patogenia renal en la cistinosis.
Inflamaciónes una respuesta aguda normal de un organismo a una lesión o infección,1pero crónicoinflamaciónse asocia con daño tisular. En el caso de enfermedades crónicas, como la diabetes, los tejidos dañados activan el sistema inmunológico, lo que lleva a una respuesta inflamatoria continua y, eventualmente, a la degeneración del tejido.2 Las citocinas son moduladores clave deinflamacióny son capaces de activar o resolver elinflamaciónproceso.3 En pacientes conenfermedad renal cronica(ERC), concentración plasmática elevada de citocinas (interleucina [IL]-6 y factor de necrosis tumoral-a) yinflamaciónLos marcadores (proteína C reactiva, IL-6, hialuronano y neopterina) están asociados con la progresión a la enfermedad renal en etapa terminal.4 Comprender los mediadores específicos que desencadenan las respuestas inflamatorias facilita el descubrimiento de objetivos farmacológicos apropiados para prevenir el daño degenerativo .
cistinosises una enfermedad metabólica autosómica recesiva que pertenece a la familia de trastornos de depósito lisosomal y se caracteriza por la acumulación de cistina en todos los órganos.5 El gen defectuoso encistinosis, CTNS, codifica el cotransportador lisosomal de cistina/protones, cistinosis.6,7 Aunque CTNS se expresa de forma ubicua, elriñónes el primer órgano afectado en personas concistinosis. Los pacientes suelen presentar en su primer año de vida el síndrome de Fanconi, que se caracteriza por trastornos graves de líquidos y electrolitos, crecimiento deficiente y raquitismo.8Posteriormente se desarrolla ERC, que progresa a enfermedad renal terminal y requiereriñóntrasplante. La acumulación de cistina en todos los tejidos finalmente conduce a una disfunción multiorgánica; los pacientes experimentan fotofobia y ceguera, hipotiroidismo, hipogonadismo, diabetes, miopatía y deterioro del sistema nervioso central.9 En el fondo C57BL/6, un modelo de ratón knockout (Ctns–/–) 10 replica el fenotipo renal de pacientes cistinóticos,11 así como la deposición de cristales de cistina en la córnea12y disfunción tiroidea.13
En el presente estudio, revelamos un nuevo papel paracistinosiseninflamacióna través de su interacción con Gal-3. Gal-3 es un miembro de la familia de proteínas de unión a lectinas y b-galactósidos 21 y está involucrado en múltiples funciones biológicas, incluyendoinflamación.22En el contexto deriñónenfermedades, se demostró que la inhibición de Gal-3 reduce la expresión de marcadores proinflamatorios y la fibrosis renal y previene la disminución de la tasa de filtración glomerular en modelos de hiperaldosteronismo, hipertensión u obesidad.23–26Aquí proporcionamos evidencia de que, encistinosis, la ausencia decistinosisconduce a la sobreexpresión de Gal-3 enriñones, mejorando la infiltración de macrófagos y la progresión de la ERC. Además, identificamos la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1) como un mediador potencial, lo que revela nuevos objetivos genéticos para la terapia farmacológica. RESULTADOS Gal-3 interactúa con la cistinosis a través de su dominio de reconocimiento de carbohidratos Para identificar interacciones específicas socios que utilizan espectrometría de masas cuantitativa, canino Madin-DarbyriñónLas células (MDCK) se transdujeron con una construcción lentiviral para expresar de manera estable la proteína de fusión cistinosis-proteína fluorescente FL verde (GFP). Además de las 9 subunidades de trifosfatasa de adenosina Hþ de tipo vacuolar publicadas anteriormente,19Gal-3 fue identificada como una de las proteínas que interactúan concistinosis(Figura 1a). Esta interacción se confirmó aún más mediante coinmunoprecipitación seguida de transferencia Western (Figura 1b y c). Además, mostramos que la interacción entre Gal-3 ycistinosisestuvo mediado por el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) Gal-3 localizado en la cola C-terminal de la proteína. La interacción fue inhibida por tiodigalactósido, un potente inhibidor de las interacciones galectina-carbohidrato (Figura 1d). Como todas las galectinas, Gal-3 tiene afinidad por las proteínas glicosiladas,21 por lo que es probable que la interacción con Gal-3 ocurra a través del resto glicosilado de cistinosis ubicado en la cola N-terminal intralisosomal de la proteína.27
La cistinosina mejora la localización y degradación lisosomal de Gal-3
Para verificar la posible localización lisosomal de Gal-3 al interactuar concistinosis, mostramos que Gal-3, como la catepsina D (una proteasa intralisosomal), estaba protegida de la digestión por la proteinasa K, mientras que ambas proteínas se digirieron cuando los lisosomas se permeabilizaron con Triton X- 100 (Figura 2a y Suplemento Figura S1). Se obtuvieron datos similares en lisosomas aislados de hígado de ratón, lo que confirma la localización lisosomal de Gal-3 in vivo (Figura 2b y c). Debido a la ausencia de un anticuerpo confiable para detectarcistinosis, la inmunotinción se realizó encistinosis-Líneas celulares MDCK que expresan GFP con un anticuerpo anti–Gal-3. Confirmó la presencia de Gal-3 en la luz de los lisosomas, mientras que la cistinosis-GFP y Lamp-2 (una proteína transmembrana lisosomal) se encontraron solo en la membrana de las vesículas (Figura 2d).
Para investigar sicistinosinaestuvo involucrado en el tráfico de Gal-3, analizamos la dinámica de amboscistinosisy Gal-3-vesículas positivas utilizando microscopía de fluorescencia FL de reflexión interna total de células vivas de dos colores en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de tipo salvaje (WT) y Ctns–/–ratones que expresan tanto CTNS-DsRed como Gal-3–GFP. Nuestro análisis confirmó quecistinosisy Gal-3 se someten a una verdadera colocalización en Ctns–/– MEF, como lo valida la distribución espaciotemporal similar de estas moléculas en la zona de microscopía de fluorescencia FL de reflexión interna total (Figura 2e). Los datos en WT MEF fueron similares (datos no mostrados). Además, cuando se analizaron los MEF transfectados solo con Gal- 3-GFP, se encontró Gal-3-GFP en el citoplasma y no se observó una estructura vesicular distinta, al contrario de la cotransfección con CTNS-DsRed ( datos no mostrados).
Estos datos se confirmaron en células 293T, en las que se observó una fuerte señal de GFP en el citoplasma en células que expresaban solo Gal-3–GFP, mientras que en células que expresaban tanto Gal-3–GFP comocistinosina-DsRed, Gal-3–GFP se localizó principalmente dentro de los lisosomas que expresan cistinosis-DsRed (Figura 3a). Además, la cuantificación de la expresión de la proteína Gal-3 en células transfectadas con Gal-3–GFP solo o Gal- 3–GFP y CTNS-DsRed, y Gal-3–GFP y DsRed como control, mostró significativamente menos proteínas Gal-3–GFP en las células cotransfectadas con CTNS-DsRed en comparación con las células transfectadas con Gal-3–GFP sola o cotransfectadas con DsRed (Figura 3b). En conjunto, estos resultados sugieren quecistinosinamejora la localización lisosomal y la degradación de Gal-3. Se demostró que la cistinosina está involucrada en la CMA.28 La proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsc70) participa en la CMA al ayudar al despliegue y la translocación de las proteínas del sustrato a través de la membrana hacia la luz lisosomal de una manera dependiente de LAMP2A.29,30 Debido a que Gal{ Se propuso que {8}} fuera degradado por CMA,31 investigamos la localización de Gal-3 en relación con Hsc70 en MEF cistinóticos. El análisis de microscopía confocal confirmó la colocalización de Gal-3–GFP en estructuras positivas de Hsc70- tanto en WT (datos no mostrados) como en Ctns–/–(Figura 3c), lo que respalda el cotransporte de Gal-3 con Hsc70 y sugiere que la internalización lisosomal pero no el reconocimiento de Gal-3 por parte de la chaperona es defectuoso encistinosis.
Gal-3 está involucrado en la inflamación renal en Ctns–/–ratones
Estudiar el papel de Gal-3 encistinosisin vivo, generamos un modelo de ratón de doble knockout deficiente en amboscistinosinay Gal-3 (Ctns–/–chica-3–/–ratones). WT, cajas–/–y Gal-3–/–Se usaron ratones como sujetos de control. En la C57BL/6 Cajas–/–ratones, las anomalías renales aparecen alrededor de los 10 meses de edad.11 Por lo tanto, los estudios se realizaron a los 8 a 9 meses, cuandoriñónse empiezan a detectar anomalías, ya los 12 a 15 meses cuando las anomalías renales han progresado. Debido a que se encontró que el contenido de cistina era diferente en Ctns masculinos y femeninos–/– riñones, se analizaron por separado. Si el contenido de cistina aumenta con la edad en ambos genotipos, no se observaron diferencias significativas en los riñones masculinos y femeninos entre los ratones Ctns–/– Gal-3–/– y Ctns–/– ratones de 8 a 9 meses y de 12 a 15 meses de edad (Figura 4a).
La función renal se evaluó en suero y orina y no se observaron diferencias significativas entre WT y Ctns–/–ratones a los 8 a 9 meses (datos no mostrados), pero a los 12 a 15 meses, Ctns–/–los ratones mostraron niveles de creatinina y urea sérica significativamente más altos en comparación con los ratones WT. Curiosamente, Ctns–/–chica-3–/–los ratones exhibieron una función renal mejorada en comparación con Ctns–/–ratones de 12 a 15 meses, con creatinina sérica más baja (P < 0.05) y urea (P < 0,05; Tabla 1).
Estudios histológicos de ratones de 8- a 9-meses y de 12- a 15-mesesriñónsecciones revelaron la presencia de anomalías severas en Ctns–/– riñones, incluyendo atrofia tubular, glomérulos retraídos e infiltrados mononucleares. El análisis ciego de las secciones de riñón varió la extensión del daño cortical de 1 (estructura tisular preservada) a 6. La puntuación promedio para Ctns–/–ratones fue 2.64 - 0.36 a los 9 meses de edad (n=7) y 4.12 0.37 a los 12 a 15 meses de edad (n=16). En los riñones de Ctns–/–chica-3–/–ratones a la misma edad, estas anomalías fueron significativamente menos extensas: 1.62 - 0.11 a los 9 meses (n=21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" prueba)="" y="" 3.04="" -="" 0.22="" a="" los="" 12="" a="" 15="" meses="" (n="33;" p=""><0.05, prueba="" t="" de="" mann-whitney)="" (figura="" 4b="" y="" figura="" complementaria="" s2).="" además,="" se="" asignó="" un="" porcentaje="" de="" atrofia="" tubular="" a="" cada="" tejido,="" y="" el="" promedio="" para="">–/–ratones y Ctns–/–chica-3–/–los ratones fueron 66 por ciento y 42 por ciento, respectivamente, a los 12 a 15 meses (P ¼ 0.01). Además, una notable diferencia entre Ctns–/–y cajas–/– chica-3–/– riñónsecciones fue la presencia de escasos infiltrados mononucleares en los Ctns–/–chica-3–/–secciones, mientras que los infiltrados pesados se observaron consistentemente en los Ctns–/– riñón(Figura 4b).
Caracterizamos los infiltrados mononucleares observados por examen histológico en Ctns de 8- a 9-meses de edad–/– riñonescomo macrófagos/monocitos por co-inmunotinción con CD68 y CD45 y con CD68 e histocompatibilidad mayor clase II (Figura complementaria S3), pero no con CD68 y CD163, lo que sugiere que estos macrófagos tienen un perfil proinflamatorio similar a M1-.32 ,33 La cuantificación de células CD68- positivas reveló significativamente menos macrófagos/monocitos en WT, Gal-3–/–y CTN–/–chica-3–/– riñonesen comparación con Ctns–/– riñones(Figura 4c), confirmando los datos histológicos (Figura 4b).
En conjunto, estos hallazgos sugieren que Gal-3 está involucrada en el reclutamiento de macrófagos/monocitos en células cistinóticas.riñonesy que su ausencia mejora la enfermedad renal en Ctns–/–ratones. De ahí que sugiera queinflamaciónes responsable, al menos en parte, del deterioro renal en Ctns–/– ratones.
Los riñones con deficiencia de Ctns exhiben sobreexpresión de Gal-3
Usando el análisis de transferencia Western, encontramos que la expresión de Gal-3 aumentó significativamente enriñonesde Ctn de 12-mesess–/–ratones en comparación con ratones WT (Figura 5a yb). Para investigar si esta mayor expresión de Gal-3 es específica de Ctns–/– riñones, cuantificamos la expresión de Gal-3 en los niveles de transcripción y proteína enriñonesde ratones con ERC inducida por operación de nefrectomía subtotal 2-escalonada estándar y de los animales que se sometieron a una operación simulada. WT y cajas–/–Se usaron ratones como sujetos de control. Las transcripciones de Gal-3 aumentaron significativamente en Ctns–/– y riñones simulados, pero aumentaron mucho en CKDriñonesen comparación con ratones WT (Figura 5c). Por el contrario, a nivel de proteína, Gal-3 se detectó solo en Ctns–/–riñones, lo que sugiere fuertemente que solo Ctns–/–los riñones no pudieron degradar la proteína Gal-3 (Figura 5d). Tinción inmunofluorescente de Gal-3 en el murinoriñóna los 8 a 9 meses también demostró sobreexpresión de Gal-3 en los Ctns–/– riñonesen comparación con WTriñones(Figura 5e). Además, Gal-3 fue expresada por macrófagos CD68þ, así como por células renales en Ctns–/– riñonesa los 8 a 9 meses (Figura complementaria S4). En conjunto, estos datos son consistentes con la disminución de la degradación de Gal-3 en ausencia decistinosiscomo se demostró in vitro (Figura 3a yb), lo que lleva a la acumulación de proteína Gal-3 en Ctns–/– riñones.
La ausencia de cistinosina conduce a un aumento de la MCP sérica-1 a través de la regulación positiva de Gal-3
Gal-3 regulainflamacióntravés de diferentes mecanismos. 34 Por lo tanto, para obtener más información sobre el mecanismo encistinosis, investigamos la expresión de diferentes citocinas proinflamatorias o antiinflamatorias en el suero de 12- a 15-meses de edad WT, Ctns–/–, chica-3–/–y CTN–/–chica- 3–/–ratones. Se midieron seis niveles de citocinas mediante matriz de perlas citométricas de ratón, MCP-1, interferón-g, factor de necrosis tumoral e IL-10, IL-6 e IL-12p70. Solo la expresión de MCP-1 aumentó significativamente en el suero de ratones Ctns–/– en comparación con los ratones WT y Gal-3–/– y también con Ctns–/–chica-3–/–ratones, cuyos niveles séricos de MCP-1 eran comparables con los ratones WT (Figura 6a). MCP-1 es producido por diferentes tipos de células, siendo la principal fuente de MCP-1 macrófagos y monocitos,35 y actúa como un quimioatrayente para monocitos y macrófagos que regula su migración e infiltración. Por el contrario, a la misma edad, se encontró que la expresión de Gal-3 era similar en el suero de ratones Ctns–/– (44,33 9,81 ng/ml; n=5) y ratones WT (40.{{12} },41 ng/ml, n=7).
La relación entre Gal-3 y MCP-1 se investigó más a fondo mediante coinmunoprecipitación usando Gal-3–GFP y MCP-1–DsRed– o Gal-3– GFP y CTNS-DsRed– (como control positivo) que expresan células 293T. Se observó interacción entre Gal-3 y MCP-1 (Figura 6b), lo que sugiere una inducción directa de MCP-1 por Gal-3. La incubación con N-acetil-D-lactosamina (LacNAc), un inhibidor de Gal-3 CRD, mostró que, en contraste concistinosinainteracción, el CRD no está involucrado en la interacción entre Gal-3 y MCP-1 (Figura 6c).
Para evaluar si este hallazgo es relevante en humanos, medimos los niveles de Gal-3 y MCP-1 en pacientes concistinosisque no estaban recibiendo terapia inmunosupresora o tomando medicamentos antiinflamatorios. Aunque se encontró que el nivel de Gal-3 estaba ligeramente aumentado en el suero de pacientes con cistinosis en comparación con donantes sanos, la diferencia no fue significativa (Figura 6e), lo que confirma nuestros resultados obtenidos en Ctns–/–ratones. Solo 2 pacientes tenían un nivel alto de Gal-3 (25,34 y 39,54 ng/ml); se consideraron valores atípicos y, por lo tanto, no se incluyeron en la Figura 6e. Por el contrario, al usar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas dirigido contra la MCP humana-1 (Figura 6d), se encontró que los niveles séricos de MCP-1 aumentaron significativamente en pacientes concistinosis(252,1 - 18,4 pg/ml; n=19; rango de edad de 1 a 23 años) a pesar del tratamiento con cisteamina en comparación con sujetos de control sanos (166,9 -13,5 pg/ml; n=1 0; rango de edad 8-63 años) (P < 0,001).="" no="" se="" ha="" encontrado="" correlación="" entre="" la="" edad="" y="" el="" nivel="" de="" mcp-="" 1="" en="" ambos="" pacientes="">cistinosisy donantes sanos (datos no mostrados).
Cistancheposeeantiinflamatoriopropiedades
DISCUSIÓN
A pesar de que la cistina se acumula en todos los tejidos de los pacientes afectados decistinosisLos riñones son los órganos más vulnerables al daño. Por lo tanto, creemos que la acumulación de cistina no es la única responsable de la degeneración renal. Aquí, describimos un nuevo rol paracistinosinaen la regulación deinflamaciónimplicados en la progresión de la enfermedad renal crónica encistinosis. Este estudio puede explicar por qué los pacientes evolucionan a insuficiencia renal terminal a pesar de recibir terapia con cisteamina.
El estudio de los socios moleculares de la cistinosis reveló una interacción directa con Gal-3, que puede ser inhibida por los inhibidores de Gal-3 CRD. Estudios recientes demostraron que Gal-3 podría interactuar con los glucanos ubicados en la luz lisosomal después del daño lisosomal, como la acumulación de cristales.36 En nuestro estudio, la interacción entre Gal-3 ycistinosinase estudió en células sanas que expresancistinosinay, por tanto, no acumular cisteína ni cristales de cistina. Además, la sobreexpresión tanto de Gal-3 como de cistinosina en células sanas modificó la localización subcelular de Gal-3, que luego se localizó en los lisosomas, en comparación con la sobreexpresión de Gal-3 únicamente, que se localizaba en el citoplasma. Estos resultados sugieren fuertemente que la interacción entre Gal-3 y la cistinosina ocurre independientemente del daño lisosomal y que la cistinosina es activamente responsable de la localización lisosomal de Gal-3. Previamente, se ha demostrado que Gal-3 se degrada a través de proteólisis dependiente de lisosomas en ausencia de Abl y Arg, 2 tirosina quinasas.31
Además, demostramos quecistinosisy Gal-3 co-localizan en estructuras vesiculares dinámicas y se movilizan juntas de manera espaciotemporal.cistinosinaanteriormente se ha asociado con los mecanismos de tráfico del lisosomal LAMP2A, el único receptor CMA conocido, que está mal localizado encistinosis.28Anteriormente se ha demostrado que la degradación de Gal-3 está mediada por CMA.31El análisis de microscopía confocal confirmó la colocalización de Gal-3 en estructuras positivas para Hsc70-en ambas Ctns–/– y células WT, que respaldan el cotransporte de Gal-3 con Hsc70 para su presentación en el lisosoma y degradación por CMA, ya que Hsc70 ayuda a la translocación de proteínas de sustrato a través de la membrana hacia la luz lisosomal.29,30Una posible interpretación de nuestros resultados es quecistinosinaregula el tráfico y la entrega de Gal-3 a los lisosomas activos de CMA para su degradación.
Este novedoso camino decistinosinaLa localización y degradación lisosomal de Gal-3 dependiente es compatible in vivo Los ratones deficientes en asCtns exhiben una sobreexpresión de Gal-3 dentro delriñón. Además, mientras que el aumento de ARNm de Gal-3 estaba limitado en Ctns–/–riñones en comparación con otro modelo de ERC, se detectó una gran cantidad de proteína Gal-3 solo en Ctns–/– riñones. Estos datos apoyan fuertemente la conclusión de quecistinosinaparticipa en la degradación de la proteína Gal-3, que puede controlar la sobreexpresión del ARNm de Gal-3 en condiciones de estrés como la ERC.
Gal-3 tiene varias funciones biológicas, incluidas funciones en enfermedades agudas y crónicas.inflamaciónatrayendo monocitos y macrófagos.37,38en cajas–/– ratones, observamos infiltrados mononucleares pesados principalmente en elriñóncomo se describió previamente,11,39que se caracterizaron como monocitos/macrófagos. Por el contrario, los riñones del doble knockout Ctns–/–chica-3–/–los ratones exhibieron muy pocos infiltrados de monocitos/macrófagos, lo que sugiere fuertemente que Gal-3 está involucrado eninflamaciónen los riñones de Ctns–/–ratones. En el contexto de lesiones tisulares repetitivas, Gal-3 puede desencadenar la transición a unainflamacióny fibrosis.34De acuerdo con estos hallazgos, nuestros datos demuestran la participación de Gal-3 en la progresión de la ERC encistinosis. Efectivamente, el doble nocaut Ctns–/– chica-3–/–los ratones exhibieron mejorriñónfunción y estructura en comparación con Ctns–/–ratones. De manera similar, los ratones deficientes en Gal-3 exhiben menos fibrosis renal en elriñónen comparación con ratones WT después de una obstrucción ureteral unilateral,40 y los ratones knockout para Gal-3 sometidos a lesión por isquemia-reperfusión tenían una mejor función renal en comparación con los ratones WT sometidos a lesión por isquemia-reperfusión.41
Aunque se encontró una correlación entre los niveles de Gal-3 en plasma y el desarrollo de ERC,42 no se observó ninguna diferencia en la expresión de Gal-3 en el suero de ratones y humanos afectados porcistinosisy sujetos de control sanos. Al medir diferentes niveles de citoquinas en el suero, encontramos un aumento significativo de MCP-1 en Ctns–/–ratones, mientras que Ctns–/–chica-3–/–los ratones tenían niveles comparables con los de los ratones WT. MCP-1 es una citocina que puede liberarse en el suero y forma un gradiente para atraer monocitos y macrófagos al sitio de la lesión.35 El aumento de MCP-1 en los sueros de Ctns–/–ratones en comparación con Ctns–/–chica-3–/–ratones fue independiente de la acumulación de cistina porqueriñónel contenido de cistina fue similar en ambos genotipos. Además, a pesar del tratamiento con cisteamina que permitió la salida de la cistina de los lisosomas, se encontró que la MCP-1 aumentaba significativamente en los sueros de pacientes concistinosisen comparación con donantes sanos. Estos datos sugieren fuertemente que la ausencia decistinosina, en lugar de la acumulación de cistina, es responsable del aumento de MCP-1 en suero. Además, mostramos una interacción directa entre Gal-3 y MCP-1, que fue sugerida recientemente por Gordon-Alonso et al.43 pero no se estudió más. El mecanismo de activación de MCP-1 mediada por Gal-3 no se estudió aquí. Una hipótesis es la presencia de un péptido señal en la MCP humana-1, que se puede escindir para mejorar su secreción.44 Además, la plasmina puede escindir el extremo C de la MCP-1, lo que aumenta su poder quimioatrayente. potencia.45 Además, en correlación con nuestros datos, la inhibición de MCP-1 en un modelo de ratón de nefropatía diabética previno la infiltración de macrófagos renales y mejoró la función renal.46,47 Encistinosis, nuestros datos sugieren fuertemente que la ausencia decistinosinaconduce al aumento de Gal-3, que activa la movilización sanguínea de MCP-1, mejorando la función renalinflamacióny la progresión deenfermedad renal cronica.
Estos hallazgos abren nuevas perspectivas sobre posibles dianas terapéuticas que podrían limitar o retrasar la degeneración renal en pacientes concistinosis. De hecho, se ha descubierto que los fármacos antiinflamatorios no esteroideos, como la aspirina y la indometacina, inhiben la expresión de Gal-3 al inhibir su transcripción.48 La indometacina en realidad se usa para regular la poliuria y la polidipsia encistinosis,49 y un estudio reciente de 307 pacientes europeos con cistinosis mostró un resultado renal mejorado en pacientes tratados con indometacina.50 A la luz de nuestro estudio, el uso de indometacina o medicamentos antiinflamatorios no esteroideos paracistinosislos pacientes pueden ser reconsiderados.
MÉTODOS
experimentos con animales
El C57BL/6 cajas–/–los ratones fueron proporcionados por el Dr. Antignac (Inserm U1163, París, Francia). C57BL/6 galectina-3 nula (Gal-3–/–) los ratones fueron proporcionados por el Dr. Fu-Tong Liu (Universidad de California, Davis) y el Dr. Jerrold M. Olefsky (Universidad de California, San Diego). La estrategia de mejoramiento para generar WT, Ctns–/–, chica-3–/–, Ctns–/– y Gal- 3–/–los ratones se describen en Métodos complementarios.
Líneas celulares
el desorden se generó a partir de biopsias de piel de recién nacidos de WT y Ctns–/–ratones. Las líneas celulares MEF, 293T y MDCK tipo II (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco que contenía 10 por ciento de suero bovino fetal o suero fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y L-glutamina 2 mM.
Co-inmunoprecipitación y análisis de espectrometría de masas
Para estudiar las interacciones proteína-proteína, las células MDCK se transdujeron utilizando el vector lentiviral pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE como columna vertebral para expresar de forma establecistinosina-GFP.51La coinmunoprecipitación se realizó como se describe en Métodos complementarios. Las proteínas coinmunoprecipitadas se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se analizaron mediante espectrometría de masas, LTQ Orbitrap, como ya se describió.19
Se usaron células 293T que expresan Gal-3–GFP y MCP-1–DsRed o Gal-3– GFP y CTNS-DsRed para la co-inmunoprecipitación como se describe en Métodos complementarios. Las proteínas coinmunoprecipitadas se resolvieron mediante SDS-PAGE, y se detectó MCP-1 que se une a Gal-3 mediante un anticuerpo anti-DsRed (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Fraccionamiento subcelular
Se obtuvieron ocho hígados de ratones C57BL/6 y se prepararon como se describió anteriormente.52 Las condiciones del gradiente fueron esencialmente las mismas que se describen en la publicación original,52 excepto que se usó Nycodenz en lugar de metrizamida.
Tratamientos con inhibidores de Gal-3 y proteinasa K
Lisados decistinosina-Células GFP MDCK y 293T que expresan Gal-3–GFP y CTNS-DsRed o Gal-3–GFP y MCP-1–DsRed se incubaron con o sin tiodigalactósido 5 mM o 5 mM de N -Acetyl-D-Lactosamine, respectivamente, 2 inhibidores de Gal-3 CRD. Después de 30 minutos de incubación a 4 - C con agitación constante, los lisados se incubaron con 50 ml de microesferas anti-GFP y se realizó inmunoprecipitación como se mencionó anteriormente. Las proteínas precipitadas se resolvieron mediante SDS-PAGE en gel al 10 por ciento.
Lisados decistinosina-Las células GFP MDCK y las fracciones enriquecidas con lisosomas de hígado de ratón se incubaron con o sin 2 % de Triton X-100 durante 10 minutos a 4 - C y luego se incubaron 30 minutos con o sin 2,5 mg/ml y 25 mg /ml proteinasa K, respectivamente. Después de la inactivación de la enzima con fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM durante 5 minutos a 4 - C, las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE en gel al 10 por ciento.
Análisis de inmunofluorescencia
Las células MDCK fijas se incubaron con anticuerpo anti-Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) y anti-Gal-3 (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Canadá) durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de Alexa Fluor. Anticuerpo secundario 555 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las imágenes confocales se tomaron con un microscopio Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopia, Jena, Alemania).
Células 293T que expresan transitoriamente Gal-3–GFP solo, Gal-3–GFP y DsRed o Gal-3–GFP ycistinosina-DsRed se cultivaron en un cubreobjetos antes de montarse en un portaobjetos. Se tomaron imágenes de las células utilizando un instrumento Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Osaka, Japón).
Fijadoriñónlas secciones se incubaron durante la noche a 4 - C con anticuerpo anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) o anti–Gal-3 (BioLegend), seguido de anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 1 hora a temperatura ambiente. Las imágenes se adquirieron utilizando un instrumento Keyence BZ-X700. La cuantificación de la expresión de CD68 se describe en Métodos complementarios.
Los MEF que expresan Gal-3-GFP se tiñeron con un anticuerpo anti-Hsc70 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) y se tomaron imágenes como se describió anteriormente.53
Microscopía de fluorescencia FL de reflexión interna total
WT y cajas–/–MEF que expresa Gal-3-GFP y CTNS-DsRed se sembraron en un plato inferior de borosilicato de 4-cámara 35- mm (Cellvis, Mountain View, CA). Después de 2 días en cultivo, los MEF se analizaron mediante microscopía de fluorescencia FL de reflexión interna total como se describió anteriormente54y en Métodos Suplementarios. Las imágenes se analizaron utilizando el software ImageJ.
Análisis de la expresión Gal-3
Células 293T que expresan Gal-3–GFP, Gal-3–GFP y DsRed o Gal-3–GFP y CTNS-DsRed y explantadasriñonesse lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación que contenía un cóctel de inhibidores de proteinasa. Las proteínas se separaron en un gel del 4 al 15 por ciento y se revelaron usando anticuerpos anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) o anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) .
Riñonesse homogeneizaron en tampón RLT que contenía b-mercaptoetanol utilizando Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Francia). Se aisló el ARN y se realizó una reacción en cadena de polimerasa digital de gotitas específica de Gal-3 como se describe en Métodos complementarios. La expresión del transcrito de Gal-3 se expresó como una proporción en comparación con el control endógeno 18S. Se utilizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Abcam) para detectar el nivel de Gal-3 en ratones y sueros humanos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Función renal
Los niveles de fosfato en suero y orina, creatinina en suero y urea se estimaron utilizando el kit de ensayo de fosfato QuantiChrom, el kit de creatinina Quanti Chrom y el kit de ensayo de urea QuantiChrom (BioassaySystems, Hayward, CA). Los niveles de proteína en la orina se midieron utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Rockford, IL).
Histología
En el momento en que mataron a los ratones,riñonesfueron recolectados, fijados en formalina e incluidos en parafina. Las secciones teñidas con hematoxilina y eosina fueron revisadas de manera ciega por la Dra. Marie Claire Gubler como se describe en los Métodos complementarios.
Medición del contenido de cistina
La medición de la cistina tisular se realizó mediante espectrometría de masas (LC-ESI-MS/MS) como se describió anteriormente.39
Nefrectomía estándar y operación simulada
Se indujo ERC en ratones mediante la operación de nefrectomía en etapa 2-subtotal estándar como se describió anteriormente.55,56El grupo simulado de ratones se sometió al mismo procedimiento pero sin cortarriñóntejido.
Nivel de citoquinas en suero
Para medir los niveles de citoquinas en suero de ratón, un ratóninflamaciónkit cytometric bead array (BD Biosciences, San Jose, CA) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de MCP-1 en suero humano se determinó utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas dirigido contra MCP-1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
análisis estadístico
Los valores se expresan como media - SEM. La importancia del resultado se evaluó mediante la prueba t de cola 2-no pareada o la prueba t de cola 2-no pareada con la corrección de Welch. Se realizaron comparaciones de grupos de 3 condiciones o más con análisis paramétricos de varianza, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para comparaciones por pares. Las puntuaciones histológicas se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney. Los análisis se realizaron utilizando el software Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA). Un valor de P inferior a 0.05 se consideró significativo.
Aprobación del estudio
Los experimentos con ratones se llevaron a cabo de conformidad con los protocolos del Comité Institucional de Uso de Animales. El uso de tejido humano en este estudio fue aprobado por el Programa de Protección de Investigación Humana de la Universidad de California, San Diego.
DIVULGACIÓN
SC es miembro del Consejo Científico y miembro del Patronato de lacistinosisFundación de Investigación. SC es cofundador, accionista y miembro tanto del consejo científico como del consejo de administración de GenStem TherapeuticsInc. Los términos de este acuerdo han sido revisados y aprobados por la Universidad de California-San Diego de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. Todos los demás autores no declararon intereses en competencia.
proporcionando la Gal-3–/–ratones. Agradecemos a Lou Devanneaux y NicholeFlerchinger por su ayuda técnica ya Elizabeth Souter por revisar el manuscrito. Agradecemos a Christopher Alfonso de BDBioscience por proporcionar el mouseinflamaciónmatriz de perlas citométricas y por su ayuda con la interpretación de los resultados. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud RO1-DK090058 y R01-DK110162, elcistinosisResearch Foundation y el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM, CLIN-09230). TL cuenta con el apoyo de una beca de posgrado de Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB y JZ cuentan con el apoyo de una beca de lacistinosisFundación de Investigación. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility fue financiado por la subvención P30-NS047101 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS).
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