¿Qué hierba aumenta la densidad ósea? Cistanche (CPhG) aumenta la osteogénesis a través de la vía SIRT2-C/EBP-AREG

 

 

OsteoporosisEs una enfermedad ortopédica común que afecta la salud de personas de mediana edad y ancianos, y su incidencia ha mostrado una tendencia ascendente en los últimos años [1]. En 2015, había 2,69 millones de pacientes con fracturas osteoporóticas en China, y se espera que esta cifra supere los 4,8 millones en 2035. Los costos del tratamiento alcanzarán decenas de miles de millones de yuanes, lo que impondrá una carga significativa a las familias y la sociedad [2]. La investigación [3] indica que la osteoporosis está relacionada con la diferenciación de osteoblastos. El equilibrio entre la formación y la resorción ósea es fundamental para mantener la regeneración del tejido óseo y la calidad ósea. La osteogénesis reducida y la resorción ósea acelerada son mecanismos patológicos que conducen a la osteoporosis. Los osteoblastos son responsables de la síntesis, secreción y mineralización de la matriz ósea y, por tanto, de la formación, el crecimiento, la resorción y el metabolismo del hueso [4]. El tratamiento de la osteoporosis requiere promover la diferenciación y proliferación de los osteoblastos y mejorar su función. Por tanto, es particularmente importante dilucidar los mecanismos de diferenciación de los osteoblastos. Actualmente, el tratamiento clínico emplea principalmente intervenciones farmacológicas, como fármacos antirresortivos (bifosfonatos, moduladores selectivos de los receptores de estrógeno, calcitonina, suplementos de vitamina D) y agentes anabólicos (análogos de la hormona paratiroidea). Sin embargo, la medicación a largo plazo puede provocar reacciones adversas dependientes de la dosis. Las reacciones gastrointestinales comunes incluyen náuseas, vómitos y diarrea. En particular, aunque la incidencia general de complicaciones graves como la osteonecrosis de la mandíbula y la lesión renal aguda es baja, los médicos deben controlar de cerca su riesgo en poblaciones específicas (p. ej., pacientes con metástasis óseas tumorales) [5].

Cistanche (Cistanche deserticola/tubulosa) tiene las funciones de la medicina tradicional china de tonificar el yang del riñón y nutrir la esencia y la sangre. Los estudios farmacológicos modernos [6] han demostrado que Cistanche puede regular el metabolismo óseo promoviendo la actividad de los osteoblastos e inhibiendo la actividad de los osteoclastos. Presenta baja toxicidad y pocas reacciones adversas. En ratas ovariectomizadas, el extracto de Cistanche puede revertir la pérdida ósea y prevenir la osteoporosis. La investigación [7] ha descubierto que los glucósidos feniletanoideos (CPhG) de Cistanche, como componentes activos clave dentro de los glucósidos totales de Cistanche, poseen efectos únicos en la regulación del metabolismo óseo, la mejora de la actividad de los osteoblastos y la supresión de la actividad de los osteoclastos. Sin embargo, no ha habido informes sobre si las CPhG regulan la diferenciación osteogénica a través del eje SIRT2-C/EBP-AREG. Este estudio investiga los efectos y mecanismos de las CPhG en la diferenciación osteogénica, con el objetivo de proporcionar apoyo teórico y una base aplicada para el uso de las CPhG en el tratamiento de la osteoporosis.

1 Materiales y métodos

1.1 Materiales e Instrumentos

CPhGs (echinacósido Mayor o igual al 40%, acteósido/verbascósido Mayor o igual al 15%, glucósidos feniletanoides totales Mayor o igual al 80%, número de lote. 20240211) se compraron enBiotecnología farmacéutica Co., Ltd de Xinjiang Hotan Dicheng. Se disolvió una cantidad adecuada de CPhG en 10 ml de medio de cultivo celular. Después de la disolución completa, la solución se filtró dos veces a través de una membrana microporosa de 0,22 µm. Se prepararon medios de inducción osteogénicos u osteoclásticos que contenían CPhG en concentraciones de 50, 100 y 200 μmol/l. Todos los medios que contenían CPhG se prepararon recientemente antes de su uso.

Especificación del extracto de Cistanche de Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd

Los anticuerpos calceína-AM, proteína quinasa B (AKT), proteína quinasa B fosforilada (p-AKT), CCAAT/proteína de unión potenciadora (C/EBP), sirtuina 2 (SIRT2), osteopontina (OPN), factor de transcripción relacionado con Runt 2 (RUNX2) y osteocalcina (OCN) se adquirieron de Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). Se adquirió una incubadora de CO2 y un instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real de Bio-Rad (EE. UU.). Se adquirió un lector de microplacas iMark de Eppendorf (Alemania). El reactivo de transfección Lipofectamine 3000 se adquirió de Thermo Fisher Scientific (EE. UU.). El kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightning se adquirió de Agilent (EE. UU.).

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1.2 Animales de experimentación y agrupaciones

Se adquirieron sesenta ratones hembra C57BL/6 del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Sichuan. Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Southwest Medical University (20230718-022).

Para aclarar los efectos de la intervención de las CPhG sobre la osteoporosis, se estableció un modelo de ovariectomía clásica (OVX). Los ratones de ocho semanas de edad fueron asignados aleatoriamente a tres grupos: Sham (extirpación de tejido adiposo de igual volumen alrededor de los ovarios únicamente), OVX (ovariectomía bilateral) y OVX + CPhG (ovariectomía bilateral + CPhG por sonda). Después de anestesia intraperitoneal con pentobarbital sódico (50 mg/kg), se realizó una cirugía simulada u ovariectomía bilateral en condiciones estériles. Las intervenciones comenzaron a las 24 h del postoperatorio. El grupo OVX + CPhG recibió CPhG por sonda (disueltas en solución de carboximetilcelulosa sódica al 0,5%, 300 mg·kg-1·d-1); los grupos OVX y Sham recibieron volúmenes iguales de vehículos mediante alimentación forzada. Las intervenciones continuaron durante 8 semanas. El peso corporal se controló semanalmente. Dos meses después de la cirugía, se evaluó la tasa de formación ósea utilizando doble marcaje con calceína y los fémures se sometieron a una exploración por micro-CT (parámetros: 50 kV, 200 μA, resolución de 10 μm) para analizar cuantitativamente la fracción de volumen óseo (BV/TV), el espesor trabecular (Tb.Th) y la separación trabecular (Tb.Sp). El día 60 del postoperatorio (intervención total de 8 semanas), se practicó la eutanasia a todos los ratones.

 

1.3 Experimentos celulares y agrupación

La línea celular de preosteoblastos de ratón MC3T3-E1 se adquirió de Guangzhou CytoNiche Biotechnology Co., Ltd. Las células se cultivaron en DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina.

Para analizar los efectos de las CPhG en la diferenciación osteogénica MC3T3-E1 y el eje SIRT2 –C/EBP –AREG, algunas células MC3T3-E1 cultivadas se dividieron aleatoriamente en un grupo de control (NC) y un grupo de CPhG. El grupo NC se cultivó en medio de inducción osteogénica estándar, mientras que el grupo CPhG se cultivó en medio osteogénico que contenía 50 μmol/L de CPhG.

Para verificar si SIRT2 influye en la expresión de C/EBP en células MC3T3-E1, otro lote de células MC3T3-E1 se dividió aleatoriamente en Control (MC3T3-E1 de tipo salvaje sin CPhG), SIRT2 KD (MC3T3-E1 de eliminación de SIRT2 estable sin CPhG), Control + CPhG (MC3T3-E1 de tipo salvaje tratado con 50 μmol/L de CPhG) y SIRT2 KD + CPhG (MC3T3-E1 de eliminación de SIRT2 tratado con 50 μmol/l de CPhG). Para los grupos SIRT2 KD y SIRT2 KD + CPhG, la eliminación de SIRT2 se logró transfectando ARNip mezclado con Lipofectamine 3000; Los niveles de ARNm de SIRT2 se midieron mediante qRT-PCR. Para los grupos Control y Control + CPhG, se transfectó NC-siRNA y se midieron los niveles de ARNm de SIRT2.

Para confirmar el papel de la desacetilación de C/EBP en la promoción de la diferenciación osteogénica, las células MC3T3-E1 restantes se asignaron a los grupos WT (control), mutante K102R, mutante K211R y tratado con CPhG (EX). Las células WT se mantuvieron en medio de inducción osteogénica estándar. Para los grupos K102R y K211R, se diseñaron cebadores mutantes en el sitio de acetilación basándose en la secuencia codificante de C/EBP. Utilizando pcDNA3.1-FLAG-C/EBP de tipo salvaje como plantilla y el kit QuikChange Lightning, se construyeron mutantes pcDNA3.1-FLAG-C/EBP (K102R y K211R). El grupo EX se cultivó en medio osteogénico que contenía 50 μmol/l de CPhG.

 

¿Qué hierba aumenta la densidad ósea?

1.4 Transferencia Western e inmunoprecipitación para la expresión de proteínas

Las membranas de PVDF se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados, seguidos de un anticuerpo secundario conjugado con HRP (IgG anti-conejo de cabra, 1:5000) a temperatura ambiente durante 1 h. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un sistema de imágenes de quimioluminiscencia y la -tubulina (1:1000) sirvió como control interno para la cuantificación relativa. Se utilizó el software ImageJ para el análisis. Para la inmunoprecipitación se utilizó tampón de lisis Pierce IP. Los extractos se incubaron con los anticuerpos correspondientes durante la noche a 4 grados, luego con perlas de agarosa de proteína A/G durante 4 horas a 4 grados. Los complejos de perlas de proteína A/G-anticuerpo-antígeno se precipitaron y se lavaron, luego se eluyeron en tampón de muestra SDS a 95 grados durante 5 minutos. Las proteínas diana se detectaron mediante transferencia Western.

 

1.5 PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para expresión de ARNm

El ARN total se extrajo utilizando el reactivo TRIzol. La densidad óptica a 260 y 280 nm se midió con un espectrofotómetro ultramicro UV-visible. La concentración de ARN se calculó a partir de la DO a 260 nm y la pureza se evaluó mediante la relación DO260/OD280. El ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc HiFiScript (Vazyme, Nanjing, China). qRT-PCR se realizó utilizando Ultra SYBR Mixture en un sistema de PCR en tiempo real. Secuencias de cebadores:

OCN, 5'-TCTGACCTCACAGATGCCAAG-3' directo, 5'-AGGGTTAAGCTCACACTGCT-3' inverso;

OPN, 5'-CACATGAAAGAGCGGTGAGTCT-3' directo, 5'-CCCTTTCCGTTGTTGTCCTG-3' inverso;

RUNX2, avance 5'-GGGACTGTGGTTACCGTCAT-3', retroceso 5'-ATAACAGCGAGGCATTTCG-3';

C/EBP, 5'-CTTCAGCCCCGTACCTGGAG-3' directo, 5'-GGAGAGGAAGTCGTGTGGC-3' inverso;

GAPDH, 5'-TGGCCCTTCCGTGTTCCTAC-3' directo, 5'-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3' inverso.
Se utilizó GAPDH como control interno y la expresión relativa se calculó utilizando el método 2-ΔΔCt.

 

1.6 Tinción con rojo de alizarina S (ARS)

Después del cultivo celular, las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. Se tiñeron a temperatura ambiente con solución de ARS al 1% (pH 4,2) durante 20 minutos y luego se lavaron repetidamente con agua ultrapura hasta que el fondo quedó claro. Después de obtener imágenes, los nódulos mineralizados se disolvieron con una solución de cloruro de cetilpiridinio al 10 % para su cuantificación y se midió la absorbancia a 562 nm.

 

1.7 Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 25.0. Los datos de medición se expresan como media ± desviación estándar. Para los datos distribuidos normalmente, se utilizó ANOVA unidireccional para comparaciones de grupos múltiples, seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones por pares. Para los datos con distribución no normal se utilizó la prueba U de Mann-Whitney. Se consideró estadísticamente significativo un valor de AP < 0,05.

Nota estratégica para compradores B2B que buscan soluciones herbales confiables para la osteoporosis

Enfoque de palabras clave: extracto de Cistanche, glucósidos feniletanoides (CPhG) de Cistanche, echinacósido, acteosido/verbascósido, diferenciación de osteoblastos, proveedor de extractos de hierbas para la osteoporosis, nutracéuticos para la salud ósea, fábrica GMP de Cistanche, Xinjiang Cistanche.

Por qué Cistanche/CPhG: La justificación traslacional anterior destaca la acción dual de los CPhG: promover la actividad de los osteoblastos y suprimir la actividad de los osteoclastos, lo que respalda su uso en formulaciones para la salud ósea dirigidas a la osteogénesis, la masa ósea y la microarquitectura.

Abastecimiento y calidad: para los compradores que requieren especificaciones consistentes de CPhG (p. ej., equinacósido mayor o igual al 40 %, acteósido mayor o igual al 15 %, glucósidos de feniletanoides totales mayor o igual al 80 %), busque cadenas de suministro rastreables, a gran escala y certificadas por GMP.

 

Presentación del proveedor Cistanche líder en la industria

Si está evaluando proveedores de extractos de hierbas centrados en la osteoporosis, Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd (WECISTANCHE) es un socio de primer nivel a considerar.WECISTANCHEes la empresa de ventas dedicada deBiotecnología farmacéutica Co., Ltd de Xinjiang Hotan Dicheng, y la sede del grupo se encuentra en Hotan, Xinjiang. Según su perfil de empresa:

Escala y origen: Fundada en 2003, con sede en el condado de Luopu, Hotan, Xinjiang (un origen central de Cistanche), con una base de Cistanche de 200.000 acres y la fábrica de procesamiento de Cistanche más grande del mundo.

Integrated supply chain: Seed breeding base (~20,000 acres), cultivation base (>85.000 acres), recolección y almacenamiento de 15.000 toneladas de Cistanche fresco y una fábrica GMP capaz de procesar 20.000 toneladas de Cistanche fresco y otros productos botánicos.

Certificaciones y calidad: Taller nacional de GMP de alimentos saludables, China SC, HACCP, certificaciones orgánicas IOIA/NOP y 14 patentes de invención relacionadas con Cistanche (incluida la tecnología de separación de membranas).

 

Biotecnología farmacéutica Co., Ltd de Xinjiang Hotan Dicheng

Fuerza de I+D:Dirigido por el Prof. Pengfei Tu (Universidad de Pekín) y colaboraciones a largo plazo con el Centro de Investigación Moderna TCM de la Universidad de Pekín, la Universidad Jiao Tong de Shanghai, la Universidad Médica de Shenyang, la Universidad Médica de Xinjiang, la Universidad Farmacéutica de Kioto y la Universidad Kinki.

Amplitud de aplicación: Extractos y formas terminadas adecuadas para decocciones de medicina tradicional china, alimentos funcionales, productos para la salud, suplementos dietéticos, productos farmacéuticos y cuidado de la piel.

Biotecnología farmacéutica Co., Ltd de Xinjiang Hotan Dicheng

Responsabilidad social:Contribuciones reconocidas al control de la desertificación y el alivio de la pobreza en Xinjiang; donaciones a gran escala de productos Cistanche durante el COVID-19.

Para documentos técnicos, cotizaciones o etiquetas privadas/OEM sobre CPhG para la salud ósea, comuníquese con WECISTANCHE:

Sitio web:https://www.xjcistanche.com/about-us

Correo electrónico:wallence.suen@wecistanche.com
 

DIRECCIÓN:No.1, Piso 26, Unidad 1, Edificio 6, No.133 Sheng'an Street, Distrito de Alta Tecnología, Chengdu, Sichuan, China (Zona Piloto de Libre Comercio)