Organoides renales 3D para traducción de banco a cama

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Navin Gupta, et al.

Resumen

Los riñones son órganos esenciales que filtran la sangre, eliminando los desechos urinarios y manteniendo la homeostasis de líquidos y electrolitos. Los modelos de investigación convencionales actuales, como los cultivos celulares estáticos y los modelos animales, son insuficientes para comprender la compleja situación humana in vivo o carecen de valor traslacional. Acelerarriñóninvestigación, se requieren nuevas herramientas de investigación. Desarrollos recientes han permitido la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas para generar organoides renales.RiñónLos organoides se asemejan al riñón humano in vitro y se pueden aplicar en medicina regenerativa y como modelos de desarrollo, toxicidad y enfermedades. Aunque los estudios actuales se han mostrado muy prometedores, quedan desafíos que incluyen la inmadurez, la reproducibilidad limitada y la falta de sistemas vasculares y de conductos colectores perfundibles. Esta revisión brinda una descripción general de nuestra comprensión actual de la nefrogénesis que permitió la generación de organoides renales. A continuación, las posibles aplicaciones deriñónSe discuten los organoides seguidos de perspectivas futuras. Esta revisión propone que el avance en la investigación de organoides renales se verá facilitado a través de nuestro creciente conocimiento de la nefrogénesis y la combinación de técnicas prometedoras como los modelos de órganos en un chip.

Palabras clave Organoide renal. Células madre. Bioingeniería.nefrona

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Introducción

Los riñones son órganos esenciales que filtran la sangre para generar desechos metabólicos, destinados a la excreción urinaria. Los riñones tienen una notable plasticidad para adaptar la composición de la orina, haciendo coincidir la ingesta con la excreción para mantener la homeostasis de solutos y el equilibrio de líquidos. Como el riñón de los mamíferos es un órgano no regenerativo, la pérdida de unidades funcionales, o nefronas, se acumula con el tiempo en todos los individuos [1]. Enfermedades sistémicas de alta prevalencia, a saber, hipertensión y diabetes mellitus, medicamentos o enfermedades agudas inducidas por hemodinámica.riñónlesión(AKI), y las enfermedades primarias del riñón, son causas comunes de pérdida acelerada de la función renal y comprenden las principales etiologías de la enfermedad renal crónica (ERC) [2]. La ERC se divide en etapas segúnriñón disfunción, que provoca trastornos de solutos y desequilibrio de líquidos responsables de una gran morbilidad y mortalidad. En los EE. UU., la ERC tiene una prevalencia informada del 14 por ciento [3], tiene un costo de tratamiento anual de $ 120 mil millones [4], tiene un impacto negativo en la calidad de vida [5] y, en etapas avanzadas, culmina en enfermedad renal en etapa terminal ( ESRD), que requiere la necesidad de terapia de reemplazo renal (TSR). Las formas de RRT incluyen la diálisis y el trasplante, el primero representa el 7 por ciento del presupuesto de Medicare [6] y el segundo está limitado por el suministro de órganos adecuados [7]. La ERC y la ESRD suponen una carga importante para los recursos y costes sanitarios, así como para los pacientes que padecen estas enfermedades [8].

Para hacer frente a estas cargas, la investigación fundamental y traslacional se ha llevado a cabo en los campos deriñón desarrollo, pruebas de nefrotoxicidad, modelado de enfermedades y medicina regenerativa renal. Las herramientas de investigación tradicionales consisten en cultivos celulares in vitro, tanto de células renales primarias aisladas como de líneas celulares inmortalizadas transformadas viralmente, y modelos animales in vivo. Si bien estos modelos comunes se han utilizado para estudiar la fisiología y la patología renal con cierto éxito, tienen limitaciones inherentes que pueden contribuir a la traducción deficiente de los estudios de laboratorio a la terapia clínica [9]. Los modelos in vitro se limitan en gran medida al análisis de tipos de células individuales, ignorando los efectos de las interacciones intercelulares y ambientales dentro de un tejido heterogéneo complejo, como el riñón. Los modelos animales, si bien integran los sistemas corporales, están limitados por las diferencias entre especies, lo que da como resultado conclusiones no fieles que conllevan un alto gasto de tiempo y costo [10]. Los nuevos métodos de experimentación en células y tejidos humanos son una necesidad para superar las limitaciones de las técnicas de investigación tradicionales [11].

Dado que la necesidad es la madre de la innovación, los avances en los protocolos que utilizan células madre pluripotentes humanas (hPSC) han generado tejidos complejos tridimensionales, multicelulares y específicos de órganos, denominados organoides. Los organoides de hígado, pulmón, corazón, intestinos y riñón permiten la experimentación en tejidos humanos in vitro [12]. En teoría, los tejidos que comprenden la totalidad del soma humano pueden reproducirse a escala, en virtud de las hPSC que definen las características de pluripotencia y autorrenovación. Los dos tipos de hPSC son las células madre embrionarias humanas (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). En 1998, Thomson et al. describió por primera vez la generación de líneas ESC derivadas de blastocistos humanos. Para eludir la controversia relacionada con el origen embrionario de las ESC, en 2006, Takahashi et al. describió un método revolucionario para inducir pluripotencia en células somáticas terminalmente diferenciadas. Denominadas iPSC, estas células están formadas por la activación transcripcional de los factores de Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc) [13]. Además de evitar problemas éticos, las iPSC permiten enfoques de medicina personalizados. Las iPSC representan un suministro ilimitado de células que son isogénicas para sus células somáticas parentales [13]. Las iPSC específicas del paciente con mutaciones naturales se pueden usar para generar modelos de enfermedades clínicamente relevantes en tejido humano, particularmente en condiciones para las que no existe un modelo animal. En los modelos de enfermedades hereditarias, los controles con corrección del genoma pueden establecer un vínculo directo entre el genotipo y el fenotipo [14]. Los enfoques de medicina regenerativa inmunocompetente pueden emplear tejido específico de órgano a granel generado a partir de iPSC de un paciente, negando la necesidad de inmunosupresión y evitando la escasez de órganos trasplantables [15]. Aprovechar la utilidad de traducción de las hPSC, en particular las iPSC, puede revolucionar los campos del desarrollo de fármacos y el trasplante de órganos, lo que conducirá a resultados dramáticos para la salud y las enfermedades humanas.

La capacidad de las hPSC para reconstituir todas las células del cuerpo plantea un gran desafío, específicamente, cómo controlar la diferenciación hacia tipos específicos de células y tejidos de interés. La organogénesis de mamíferos sirve como arquetipo para la diferenciación dirigida, la inducción secuencial eficiente de tipos de células intermedias que ocurren durante el desarrollo de órganos [16]. Por el contrario, la reprogramación directa implica la inducción de factores de transcripción específicos del tipo de célula, evitando los tipos de células intermedios durante la conversión de una célula somática hacia una población objetivo definida. Si bien se beneficia de una metodología más simple, la reprogramación directa a menudo da como resultado una conversión incompleta a la célula diana debido al perfil de metilación del ADN y la epigenética de la célula parental [17]. Incluso si se produjera una reprogramación directa con una conversión completa, es probable que el resultado sea una población celular uniforme [18]. Con respecto al riñón, más de una docena de tipos de células distintas contribuyen a la estructura y función de la nefrona in vivo. La reconstitución de una nefrona necesitaría una reprogramación directa a un ancestro común de todos los tipos de células contribuyentes, es decir, células progenitoras de nefronas, células progenitoras endoteliales y células progenitoras estromales [19]. El enfoque requerido para desarrollar tejido similar al riñón nativo es la diferenciación dirigida, un método basado en un conocimiento profundo del desarrollo renal. En esta revisión, destacamos el papel esencial que ha desempeñado la biología del desarrollo renal en la generación de organoides renales derivados de hPSC, comentamos brevemente las aplicaciones de la tecnología de organoides renales y discutimos las direcciones futuras que abordan las limitaciones y desafíos actuales para la traducción clínica.

desarrollo renal

El desarrollo renal sirve como estándar de oro para la diferenciación dirigida, para producir tejido in vitro más biosimilar a su contraparte in vivo. Décadas de estudios de desarrollo en modelos de mamíferos revelaron que las vías Wnt, FGF, ácido retinoico y TGF-/BMP gobiernan la morfogénesis, el patrón de tejido y la inducción de primordios de órganos [12]. Estas vías son fundamentales para el desarrollo iterativo de tejidos en las 3 capas germinales, incluido el riñón derivado del mesodermo. El mesodermo, intercalado entre las capas endodérmica y ectodérmica, está modelado por la gastrulación de las hPSC (epiblastos anteriores) a través de la estría primitiva, una estructura transitoria que define los ejes anterior-posterior y medial-lateral del embrión en desarrollo [12]. El eje anterior-posterior del mesodermo está determinado por la duración de la involución a través de la racha primitiva con exposición temporal a la señalización de Wnt, ya que las hPSC que involucionan a través de la racha primitiva migran anteriormente para contribuir inicialmente a las estructuras anteriores, y luego se llenan posteriormente [1]. El eje medial-lateral del mesodermo está determinado por un gradiente rostrocaudal de BMP en la línea primitiva, a medida que las hPSC que experimentan gastrulación a través de la línea primitiva rostral (baja actividad de BMP) se vuelven mesodermo paraxial, a través de la línea primitiva media (actividad moderada de BMP) se vuelven mesodermo intermedio (IM), y a través de la racha primitiva caudal (alta actividad de BMP) se convierten en mesodermo de placa lateral [20, 21]. En la línea primitiva, la duración de la señal de Wnt y el grado de la señal de BMP son los principales determinantes del patrón en toda la capa germinal mesodérmica.

En el desarrollo del riñón de los mamíferos, hay 3 etapas nefríticas, pronefros, mesonefros y metanefros, que derivan todas del mesodermo. Los estudios en ratones revelan que el metanefros, que persiste como el riñón adulto, se deriva de la inducción recíproca de dos tejidos derivados de IM, el mesénquima metanéfrico (MM) y la yema ureteral (UB) [22]. El MM se compone de células progenitoras de nefronas (NPC) intercaladas con células del estroma, mientras que la UB se forma como una evaginación remanente del conducto de Wolff, una estructura degenerativa que drena el mesonefros primitivo a la cloaca [23]. Los NPC concentrados del mesénquima de la tapa del MM experimentan una morfogénesis progresiva desde cuerpos en forma de coma hasta cuerpos en forma de S, que se diferencian segmentariamente en estructuras epiteliales contiguas que comprenden la nefrona, a saber, podocitos, túbulos proximales, un asa de Henle, túbulos distales y túbulos de conexión. 24–27]. Los túbulos de conexión de las nefronas individuales convergen en un sistema colector ramificado derivado de la UB, luego de la inducción recíproca entre los dos tejidos [28]. La señalización de Wnt derivada de UB cataliza la transición de mesenquima a epitelio (MET) de NPC a epitelio de nefrona [29], mientras que las señales de GDNF derivadas de MM a través del complejo Ret/GFRA1 gobiernan la morfogénesis de ramificación [30] (Fig. 1).

Fig. 1 El desarrollo del riñón humano desde la racha primitiva hasta una nefrona madura. [1] La estría primitiva (PS) da lugar al mesodermo y, posteriormente, al mesodermo intermedio (IM), del cual se pueden distinguir el IM posterior (PIM) y el IM anterior (aIM) durante la gastrulación temprana. [2] El mesénquima metanéfrico (MM), que incluye células progenitoras de nefronas (NPC) y células estromales, se forma a partir del PIM, mientras que el aIM forma el conducto de Wolffian a partir del cual se desarrolla la yema ureteral (UB). El UB comienza a ramificarse con las NPC, las células progenitoras del estroma (SPC) y las células progenitoras endoteliales (EPC). En esta etapa, la vasculatura no se infiltra en las poblaciones de NPC. [3] A continuación, los NPC desarrollan vesículas renales que forman un cuerpo en forma de coma seguido de un cuerpo en forma de s. Eventualmente, esta estructura se conecta con UB y se convierte en una nefrona madura. La sangre se filtra en el glomérulo (gris) que traslada el ultrafiltrado al túbulo colector (amarillo) a través del túbulo proximal (naranja), un asa de Henle (azul) y el túbulo distal (verde). Se dan los marcadores correspondientes a cada estructura.

Un gran avance en nuestra comprensión del desarrollo renal ocurrió en 2014 cuando Taguchi et al. descubrió inesperadamente que los precursores T más MM son distintos desde el punto de vista del desarrollo de los progenitores Osr1 más UB [31], utilizando técnicas de rastreo de linaje, y señaló que el trabajo anterior sugería un ancestro común en Osr1 más IM sin más delimitación [22]. En el estudio mencionado anteriormente, se usó un ratón Osr1-GFP para determinar que Osr1 se expresa en diferentes momentos y en diferentes ubicaciones en la zona néfrica de la MI. Mediante el análisis histológico y la clasificación/reagregación de células OSR1-GFP plus en diferentes etapas de desarrollo, los autores pudieron demostrar que la IM anterior contribuye al mesonefros, al conducto mesonéfrico (conducto de Wolff) y a la yema ureteral (protuberancia del conducto de Wolffian), mientras que el IM posterior contiene Six2 más Sall1 más NPC del MM que se diferencian en las células epiteliales de la nefrona. La determinación de que MM se deriva de la IM posterior y UB de la IM anterior, junto con la expresión del marcador característico, proporciona una hoja de ruta para la inducción específica de los linajes específicos de riñón y ha permitido protocolos de diferenciación dirigidos para inducir de manera eficiente la nefrona derivada de MM. epitelios sin contaminación de otros derivados IM. Es importante destacar que los estudios históricos asumieron que el desarrollo del riñón del ratón reflejaba la nefrogénesis humana. Comparando el desarrollo renal humano y de ratón, estudios recientes han aclarado características convergentes y divergentes, incluida la formación de lóbulos, la organización del nicho progenitor y la expresión de marcadores presuntivos que definen el tipo de célula [32]. En tales estudios, los datos de riñones humanos se han obtenido a partir de tejido embrionario póstumo, lo que permite obtener información en lugar de experimentación. El advenimiento de los organoides renales derivados de hPSC permite hipótesis comprobables en el desarrollo del riñón humano, entre las aplicaciones traslacionales.

organoides de riñón modelo 3d

Los desarrollos recientes han permitido la formación de organoides renales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPCS) a través de la diferenciación dirigida [33], generando una nueva plataforma de traducción para el desarrollo de fármacos y técnicas de medicina regenerativa. Los organoides son mini órganos in vitro que se autoorganizan a partir de células (madre) en microentornos 3D. Presentan grandes similitudes con sus contrapartes in vivo en términos de morfología tisular, recuento celular, proliferación y diferenciación [34].

Después de delinear los distintos orígenes de MM y UB durante el desarrollo del riñón de mamíferos y trabajar hacia atrás en un enfoque gradual para identificar etapas intermedias y su expresión de marcador característica, Taguchi et al. establecieron protocolos de diferenciación dirigida para MM en PSC de ratón y humanos [31]. Específicamente, los cuerpos embrioides formados a partir de OCT3/4 más SOX2 más hPSC se sometieron a señalización extendida de Wnt y BMP4 para inducir T más CDX2 más mesodermo naciente, que está destinado a contribuir a las células del mesodermo naciente posterior. El eje medial-lateral del mesodermo se dirigió hacia WT1 más HOXD11 más OSR1 más IM posterior mediante tratamiento concurrente con BMP4, Activin y ácido retinoico. A continuación, se utilizaron Wnt y FGF9 bajos para respaldar el desarrollo de OSR1 más SIX2 más SALL1 más WT1 más NPC, con una eficiencia de inducción informada de ~62 por ciento. Si bien los NPC se generaron a partir de PSC de ratón y humanos, fue necesario el cocultivo con médula espinal embrionaria de ratón para diferenciarlos aún más en túbulos proximales, túbulos distales y grupos de podocitos.

Usando tanto hESC como hiPSC en cultivo en monocapa, Morizane et al. describió un protocolo de diferenciación dirigida que indujo SIX2 más SALL1 más WT1 más NPC con una eficiencia de hasta el 90 % en los días 8 y 9 de diferenciación. Brevemente, la señalización de Wnt extendida indujo una racha primitiva tardía que estaba sujeta a activina para formar PIM, que se diferenciaba en NPC en respuesta a FGF9. Luego, los NPC se agregaron en un cultivo de suspensión tridimensional mediante centrifugación, se sometieron a un pulso CHIR99021 (CHIR) transitorio para simular la señalización de Wnt derivada de UB para catalizar MET en los NPC, y continuaron sujetos a FGF9 para expandir y mantener la tallo de la Nicho de PNJ [35]. Después del pulso CHIR, MM hizo la transición a PAX8 más LHX1 más agregado peritubular, que se diferenció aún más en LAM1 más vesícula renal en el día 14 de diferenciación. estructuras que consisten en epitelios contiguos que contienen múltiples marcadores para cada uno de los podocitos (NPHS1 más PODXL más), túbulos proximales (LTL más), asa de Henle (CDH1 más UMOD más), túbulos distales (CDH1 más UMOD−) y túbulos de conexión ( CDH1 más AQP2 más ) [36].

Freeman et al. han utilizado un enfoque diferente para crear un protocolo simplificado para obtener organoides renales. Aquí, los autores han utilizado un método Matrigel tipo sándwich para proporcionar un microambiente 3D para que las hPSC formen esferoides que rodean cavidades huecas de tipo amniótico [37]. A través de la diferenciación dirigida, estos esferoides se estimulan para convertirse en organoides renales con un protocolo de dos pasos. Los esferoides formados se trataron con CHIR durante 1,5 días seguidos de exposición a medios suplementados con B27-. En el día 10, se formaron organoides tubulares translúcidos y enrevesados ​​después de la transición de mesenquimatoso a epitelial. Takato et al. han identificado características de desarrollo tanto del túbulo colector como de los progenitores del mesénquima renal [38]. Aquí, los autores utilizaron esta información para inducir tanto el mesénquima metanéfrico (frente al mesonéfrico) como el epitelio urético mediante 4 días de exposición a CHIR seguidos de 3 días de exposición a FGF9. Luego, los agregados se cultivaron durante 20 días, lo que permitió que se formaran organoides que se correspondían con un riñón de primer trimestre. Los autores han afirmado la presencia del conducto colector por la presencia de los marcadores GATA3 y ECAD. Sin embargo, esto se evaluó más tarde como poco fiable, ya que los túbulos colectores y distales derivados del MM también pueden expresar estos marcadores [39, 40] (Fig. 2).

Fig. 2 Protocolos de diferenciación dirigidos para generar organoides de riñón derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Se visualizan las similitudes y las diferencias entre los cuatro protocolos para generar organoides de riñón humano. Cada protocolo visualizado incluye la escala de tiempo en días, la etapa de desarrollo de los organoides y los factores complementados para impulsar la diferenciación dirigida y la maduración de los organoides. Los protocolos de Taguchi et al. y Takasato et al. dio como resultado organoides en membranas Transwell. Morizane et al. permitió la generación de organoides renales en 96-placas de pocillos y Freedman et al. en un enfoque de sándwich de Matrigel

Después de que se publicaran los cuatro protocolos de diferenciación dirigidos anteriores en 2015, varios grupos han seguido un enfoque similar para convertir secuencialmente las hPSC en estrías primitivas tardías, PIM, MM, agregado peritubular, vesícula renal y, en última instancia, organoides renales [41–44]. Wu et al. realizó una transcriptómica unicelular como análisis comparativo entre los protocolos de Morizane y Takasato, ambos entre sí y frente a riñón fetal humano (16 semanas de gestación) y riñón humano adulto (hombre de 62-años conriñónfunción). Cuando se evaluaron en condiciones estáticas en el día 26 de diferenciación, ambos protocolos generaron tejido inmaduro, cada uno expresando ~ 20 por ciento de los factores de transcripción del túbulo proximal y podocitos adultos [41]. Sin embargo, Tran et al. empleó transcriptómica unicelular en organoides renales desarrollados utilizando el protocolo Morizane para respaldar la aplicación de podocitos derivados de organoides para el modelado de enfermedades y la restauración de la función de filtración. Los podocitos de los organoides compartieron perfiles transcripcionales progresivos muy similares con los riñones fetales humanos y reclutaron la vasculatura del huésped en el trasplante para fomentar una mayor maduración [42]. Garreta et al. descubrió que el perfil transcripcional de los organoides renales se amplió al de los riñones fetales humanos del segundo trimestre en el día 16 de la diferenciación mediante el empleo de un hidrogel suave para alargar la duración de un microambiente 3D para facilitar las interacciones célula-célula y célula-matriz [44] . Siguiendo un protocolo de diferenciación similar, Low et al. realizó una secuenciación de ARN de una sola célula (RNAseq) que identificó un subconjunto de células progenitoras de nefronas como una fuente potencial de la vasculatura renal, lo que difiere de los estudios en el desarrollo de ratones que demostraron la fuente como FLK1 más células progenitoras endoteliales, que son distintas de las NPC de la MM [45] y en parte se derivan de las células progenitoras del estroma FOXD1 [46]. Sin embargo, otros hallazgos importantes incluyeron que la señalización de Wnt gobierna la vascularización y la proporción de segmentos de nefrona proximales frente a distales, la maduración funcional de los organoides después de la implantación y el modelado de la enfermedad renal poliquística autosómica recesiva (ARPKD) utilizando iPSC derivadas del paciente [43].

Utilidad traslacional de los organoides renales.

En general, los modelos de investigación actuales para estudiar enfermedades o compuestos a menudo se limitan a estudios celulares y modelos animales. Los modelos de celdas son fáciles de usar y se pueden aplicar en grandes cantidades. Sin embargo, estos a menudo incluyen líneas de una sola célula y no pueden comprender la complejidad de los riñones humanos in vivo, como el microambiente 3D y las múltiples células presentes. Por lo tanto, los modelos celulares no pueden imitar la morfología del tejido 3D in vivo y el microambiente heterogéneo y complejo. Para dar cuenta del complejo entorno in vivo, los modelos animales como los ratones han sido un modelo de investigación convencional. Sin embargo, estos modelos son poco traducibles a las condiciones humanas [47, 48]. Además, las preocupaciones éticas sobre el uso de animales con fines de investigación han ido en aumento [49, 50]

Por lo tanto, se requieren modelos novedosos que puedan imitar específicamente la situación humana in vivo con mayor precisión [51].

Los organoides tienen el potencial de superar estas limitaciones debido a su capacidad única para imitar la situación in vivo de los humanos. Y debido a que los organoides se derivan de hiPSC, también se pueden usar para la medicina personalizada. Por ejemplo, ciertos (combinaciones de) compuestos se pueden probar con los organoides derivados de las células de una persona específica para probar la toxicidad o la eficacia. Además, son posibles aplicaciones a mayor escala. Por ejemplo, los organoides se pueden utilizar como modelos preclínicos para determinar las características de ciertos compuestos. Además, los modelos confiables de enfermedades humanas se pueden usar en ensayos clínicos para acelerar el desarrollo de tratamientos para enfermedades especialmente raras para las cuales los pacientes son escasos.

Aunque se requieren más avances para crear riñones completamente funcionales in vitro, los estudios hasta la fecha son muy prometedores. Algunos estudios ya han mostrado aplicaciones de los organoides renales tal como son hoy. Estos avances en los organoides renales permiten la aplicación (futura) para la medicina regenerativa y como modelos de desarrollo, toxicidad y enfermedad. Entre estas aplicaciones traslacionales, los organoides también se consideran métodos potenciales para la aplicación de la medicina regenerativa para crear riñones de bioingeniería para introducir terapias alternativas a la diálisis y el trasplante de riñón (Fig. 3). Dado que numerosas revisiones han informado sobre las aplicaciones traslacionales publicadas de los organoides renales [1, 52–59], esta revisión se centra en la futura generación de tejido renal derivado de células madre que es histológicamente biosimilar al riñón humano nativo para facilitar la traducción de la investigación sobre organoides renales. hacia un impacto en la atención clínica.

Retos actuales y perspectivas de futuro

El riñón es un órgano muy vascularizado que, en conjunto, recibe el 20 % del gasto cardíaco y filtra hasta 180 l de sangre al día [60]. Diecinueve kilómetros de capilares glomerulares, con una superficie de ~ 6000 cm2, contribuyen a la barrera de filtración glomerular (GFB) [61]. Los constituyentes de la GFB son los capilares glomerulares fenestrados, la membrana basal glomerular cargada negativamente y los podocitos que exhiben diafragmas de hendidura entre los procesos podales [61]. La estructura de la GFB engendra su función, la filtración de sangre basada en el tamaño y la carga de los solutos. La orina primitiva formada a partir de la filtración glomerular ingresa a los túbulos de las nefronas, donde es procesada por mecanismos de absorción y secreción. De los hasta 180 l de filtrado, ~ 99 por ciento se absorbe y solo 1 a 2 l se destinan a la excreción urinaria en condiciones normales. Dada la reabsorción de volumen sustancial en los capilares peritubulares, no sorprende que múltiples nefronas drenen hacia conductos colectores compartidos que convergen en la pelvis renal para formar uréteres solitarios. La estructura general, desde la extensa vascularización proximal de la nefrona hasta la comunicación generalizada del lecho capilar epitelial-peritubular tubular y el drenaje arborizado de la nefrona distal, desempeña un papel fundamental en la función renal. Los riñones mantienen una función relativamente necesaria incluso cuando la capacidad disminuye al 20 por ciento, y muchos de estos pacientes permanecen asintomáticos. Sin embargo, las reducciones por debajo del 15 por ciento a menudo se traducen en la necesidad de TRS [62, 63]. Los NPC con habilidades regenerativas se pierden en los humanos antes del nacimiento y, por lo tanto, las nefronas no pueden renovarse. Actualmente, no hay terapias disponibles para reponer la función renal perdida, por lo que existe una gran demanda de aplicaciones de medicina regenerativa. Además, se requiere un GFB para modelar enfermedades que afectan la filtración, el transporte tubular funcional necesario para una amplia variedad de pruebas de toxicidad y modelado de enfermedades, y la combinación de nefronas derivadas de MM con conductos colectores derivados de UB necesaria para modelar la mayoría de las anomalías congénitas del riñón. y tracto urinario (CAKUT) [64]. El desarrollo de una vasculatura renal organizada y un sistema colector ramificado representaría importantes avances traslacionales en la tecnología de organoides renales.

Vascularización organoide renal

La vascularización del riñón implica dos procesos distintos: vasculogénesis y angiogénesis [65]. En la vasculogénesis, el ensamblaje de la vasculatura ocurre de novo, mientras que la angiogénesis implica la ramificación o extensión de vasos preexistentes. La interacción entre estos dos procesos durante la nefrogénesis sigue siendo desconocida, aunque los microvasos renales vasculogénicos pueden preceder al desarrollo de la arteria renal angiogénica [65]. En ratones, el MM no tiene vasculatura durante la invasión de la yema urética pero desarrolla una rica red capilar al día siguiente con la subsiguiente formación de glomérulos vascularizados. Este último se realiza mediante células endoteliales que invaden la hendidura vascular para formar glomérulos en estadio de asa de un solo capilar [66-68]. Mientras tanto, FLK1 vasculogénico más células progenitoras endoteliales intercaladas en el MM contribuyen a la rica red capilar glomerular [69]. De manera similar a los enfoques de diferenciación dirigida para formar MM ex vivo, la vascularización del tejido renal derivado de hPSC debe seguir sus orígenes embrionarios para desarrollar la red vascular renal jerárquica y modelada.

Se encontró que los organoides de riñón 3D desarrollados a partir de los protocolos iniciales para MM derivado de PIM contenían células vasculares; sin embargo, los glomérulos permanecieron en gran medida avasculares y la abundancia general de vasos sanguíneos fue escasa en comparación con el tejido renal nativo [70]. Es importante destacar que estos conjuntos de vasos sanguíneos vasculogénicos imitan la formación temprana de microvasos en el desarrolloriñóntejido, que se produce antes de la invasión angiogénica de la arteria renal [65]. En su trabajo seminal, Taguchi et al. trasplantaron su MM de ratón inducido a ratones, con vasculatura angiogénica derivada del huésped que resultó en un aumento de los capilares glomerulares. Los grupos de podocitos WT1 plus se co-localizaron con los vasos PECAM1 plus, que se encontró que contenían glóbulos rojos del huésped en las imágenes [31]. Se ha repetido un trasplante subcapsular similar de organoides renales, lo que demuestra que la vasculatura dentro de los glomérulos de los organoides se deriva persistentemente del huésped y la formación de una membrana basal glomerular temprana que consta de células endoteliales fenestradas y procesos del pie de podocitos [71]. Se ha afirmado un pequeño grado de filtración glomerular en el trasplante subcutáneo de organoides renales, con base en la detección intracelular en túbulos de dextranos fluorescentes administrados sistémicamente tomados para indicar la captación del filtrado glomerular [72]; sin embargo, no se puede excluir la captación apical habilitada por la falta de uniones estrechas a lo largo de la cápsula de Bowman hasta el túbulo proximal o la captación basolateral a través de mecanismos fagocíticos tubulares [73]. Sobre la base de su trabajo en el que los organoides renales trasplantados debajo de la cápsula renal se vascularizan por el huésped y demuestran la maduración glomerular y tubular [71], recientemente, van den Berg et al. desarrolló un elegante sistema in vivo que emplea imágenes multifotónicas de alta resolución para demostrar el tamizado glomerular selectivo por tamaño [74]. En particular, los glomérulos vascularizados formados a partir de tejido quimérico entre especies no logran superar las limitaciones relacionadas con la dependencia continua de los sistemas animales, incluidas las diferencias fisiológicas y de desarrollo entre especies, una pérdida significativa para los enfoques de medicina personalizada, bajo rendimiento y alto costo.

La vascularización de organoide renal se ha logrado in vitro, con resultados similares a los informados en experimentos de trasplante. Al unir las tecnologías de organoide renal y riñón en un chip para recapitular el microambiente fluídico in vivo, Homan y Gupta et al. descubrió que la tensión de cizallamiento fluídico aplicada a los organoides renales incrustados en el chip facilitó la formación de redes vasculares perfusibles desarrolladas a partir de la expansión y diferenciación de células progenitoras endoteliales co-inducidas. Además, los autores demostraron un aumento de la polaridad y la maduración de las células epiteliales tubulares y los podocitos, que manifiestan procesos de los pies que lindan con los capilares glomerulares para formar un GBM primitivo [70, 75]. Aunque los organoides renales estaban superfundidos, a diferencia del flujo limitado dentro de la vasculatura, la aplicación de tensión de cizallamiento fluídico en los organoides completos simula el flujo intersticial generado por los cambios de líquido compartimentales durante la reabsorción de ~ 99 por ciento del filtrado glomerular. En otras palabras, ~99% del volumen de las luces tubulares se transmite a través del intersticio y es reabsorbido por los capilares peritubulares in vivo. Si bien la vasculatura perfundible se demostró con sondas fluorescentes, la filtración glomerular no se vio respaldada por la detección de fluorescencia en los lúmenes tubulares debido al uso de perlas de 500 nm de diámetro, mientras que el diámetro promedio de las fenestraciones en los capilares glomerulares es de ~ 70 nm [ 76]. En particular, toda la vasculatura del sistema se deriva de los organoides renales sin invasión angiogénica.

Los métodos para superar los desafíos actuales incluyen el acoplamiento de redes vasculares angiogénicas in vitro con organoides renales vasculogénicos para permitir la maduración del GBM con filtración glomerular funcional. Existe una multitud de razones plausibles por las que aún no se ha producido la filtración glomerular definitiva en los enfoques de organoide en chip de riñón, incluida la falta de experimentación longitudinal, la presión hidrostática limitada transmitida en los capilares glomerulares, la inmadurez del epitelio de la nefrona y el potencial de circulación esencial. Factores que facilitan el desarrollo renal embrionario. Anteriormente se han descrito redes vasculares angiogénicas directamente perfundibles in vitro, que son capaces de soportar tejido grueso o invadir construcciones celulares incrustadas en el chip [77, 78]. Dicha vasculatura puede anastomosarse con microvasos derivados de organoides para limitar la perfusión al compartimento vascular, lo que permite la transmisión de una presión hidrostática sustancial a los capilares glomerulares. Se pueden abordar otras limitaciones mediante el empleo de estudios longitudinales, la perfusión con suero embrionario y el uso de organoides de día de diferenciación óptima (que influyen en la madurez) en dichos dispositivos. Si la red vascular angiogénica estuviera compuesta por células humanas, se evitarían las limitaciones relacionadas con las diferencias entre especies. De manera similar, el uso de vasos sanguíneos derivados de hPSC, como se ha descrito [79], facilitaría los enfoques de medicina personalizada tanto para el desarrollo de fármacos como para las estrategias de medicina regenerativa.

Formación de brotes ureterales

La producción de ultrafiltrado glomerular ex vivo representaría un descubrimiento histórico para facilitar las aplicaciones traslacionales de tejido renal derivado de células madre, aunque sería necesario un sistema colector para el drenaje posterior. Una red de conductos colectores ramificados dicotómicamente hace converger la producción de ~ 1 millón de nefronas de un riñón individual en un solo uréter [60]. Los conductos colectores no solo transportan el filtrado, sino que también participan en la reabsorción de agua y el equilibrio de electrolitos a través de varios transportadores y canales en sus diversos tipos de células epiteliales tubulares. Los túbulos colectores son un producto de la morfogénesis ramificada de la yema ureteral que está controlada por varias señales moleculares que pueden explotarse in vitro para imitar este proceso, incluidas las vías de señalización de FGF, GDNF/RET y Wnt [68].

Los estudios de desarrollo renal que utilizan MM y UB de ratón microdiseccionado proporcionan información importante sobre la formación temprana de lo que constituirá el riñón humano adulto. El MM no inducido, separado de las estructuras epiteliales de la UB, impide la maduración de cualquiera de los tejidos. Sin embargo, el cocultivo de MM y UB ex vivo es capaz de reconstituir el riñón de ratón, lo que sugiere que estas poblaciones de precursores de riñón poseen un programa autónomo suficiente para impulsar la organogénesis renal [80]. Desde una perspectiva de desarrollo, es probable que el método óptimo para desarrollar tejido renal funcional a partir de hPSC in vitro implique inducir por separado MM y UB con alta eficiencia y cocultivo de las dos poblaciones distintas.

Los protocolos de diferenciación descritos anteriormente generan predominantemente MM, destinados a convertirse en estructuras de nefrona. La diferenciación dirigida hacia las células progenitoras del conducto colector de la UB se publicó por primera vez en 2013, antes de que Taguchi delineara los orígenes IM divergentes de MM y UB. Xiao et al. convirtió hPSC en tejido comprometido mesodérmico usando FGF2 y BMP4 durante 2 días, luego indujo células progenitoras UB usando una combinación de activina, BMP2 y ácido retinoico durante 2 días adicionales en un protocolo de diferenciación de dos pasos [81, 82]. Las células progenitoras UB derivadas de hPSC se autoensamblaron en tejido quimérico entre especies cuando se combinaron con MM embrionario de ratón. En 2017, al analizar los perfiles de expresión génica durante el desarrollo de la yema ureteral en embriones de ratón, Taguchi et al. han establecido un protocolo para incluir tejido MM y UB en los organoides renales utilizando ESC de ratón (mESC) [83]. Este protocolo se basó en la clasificación FACS CXCR4 más KIT más progenitores del conducto de Wolffian. El cocultivo de progenitores del conducto de Wolffian con MM derivado de mESC requirió la presencia de células progenitoras del estroma para formar organoides reensamblados que se sometieron a una organogénesis de orden superior para formar nefronas interconectadas por un epitelio ureteral ramificado. En última instancia, los hallazgos no se replicaron en MM y UB derivados de hPSC debido al cese prematuro de la ramificación de UB, que los autores creían que podría deberse a la falta del conjunto de progenitores estromales [83]. El establecimiento de la diferenciación dirigida a los progenitores del estroma renal humano y el aumento del acceso a los tejidos renales fetales humanos primarios pueden discernir la causa de la morfogénesis de ramificación incompleta informada. Sin embargo, puede haber limitaciones en la eficiencia de inducción del tipo de célula requerido, a saber, células de punta Ret más UB en proliferación, que son responsables de ramificarse y formar un enlace estructural con los túbulos de conexión de las nefronas distales [84].

Hay escasez de protocolos de diferenciación dirigidos de hPSC hacia UB y sus derivados, y los protocolos publicados demuestran limitaciones. Se requieren protocolos mejorados para permitir la adición de una red de conductos colectores para abarcar la totalidad de los organoides renales que contienen nefronas. De manera análoga a maximizar la eficiencia de inducción para NPC en función de la expresión de SIX2, maximizar la eficiencia de inducción para las células de punta UB en función de la expresión de Ret es una de esas estrategias. Con este fin, se requiere una comprensión del desarrollo renal. En particular, la UB se forma como una evaginación del conducto de Wolffian (también conocido como conducto mesonéfrico), que se genera a partir de la migración caudal de las células IM anteriores por el seno urogenital hasta la cloaca, observando que estas células se someten a MET en el camino. Los orígenes tortuosos de la UB plantean un desafío para el establecimiento de un sólido protocolo de diferenciación dirigida. Sin embargo, las células mesenquimales que expresan Ret presentes en el aIM son capaces de contribuir al UB [84], de modo que un protocolo de 3-pasos puede convertir las hPSC en una racha primitiva temprana (paso 1), luego en un aIM (paso 2) , luego Ret más celdas de punta UB (paso 3). En particular, el repositorio celular del consorcio ReBuilding a Kidney (RBK) de los NIH incluye una línea de reportero Ret

Conclusión

El riñón es un órgano notable que, entre otras cosas, regula la homeostasis del agua y los electrolitos del cuerpo. La desregulación de estos procesos puede dar lugar a graves complicaciones de salud con una alta carga social y económica. A través de nuestra comprensión de la nefrogénesis humana in vivo, arrojamos luz sobre la recapitulación de este proceso in vitro. Los avances actuales han permitido la generación de organoides de riñón derivados de hiPSC. Estos organoides renales se asemejan al riñón humano y brindan ventajas adicionales en comparación con los modelos de investigación convencionales. La aplicación de organoides renales incluye medicina regenerativa y modelos de desarrollo, toxicidad y enfermedades. A pesar de los avances en los últimos años, los organoides renales requieren protocolos mejorados y modificaciones hacia la maduración del tejido, la vasculatura perfusible y la integración del sistema colector. A continuación, estos sistemas deben adaptarse para proporcionar un valor adicional a los modelos convencionales de investigación con células y animales o incluso reemplazarlos. Mejorar los protocolos de generación de organoides a través de nuestro creciente conocimiento del desarrollo renal, combinado con la adopción de la tecnología de órgano en un chip, puede facilitar y acelerar la traducción de organoides renales 3D hacia el uso clínico.

De: 'Organoides de riñón 3D para traducción de banco a cama' porNavin Gupta, et al.

---J Mol Med (2021) 99:477–487