Una vacuna bivalente viva atenuada contra el virus de la influenza protege contra aislados clínicos H1N2 y H3N2 derivados en cerdos Parte 1

Abstracto:

Los virus de influenza A (IAV) pueden causar una enfermedad respiratoria altamente contagiosa para muchas especies de mamíferos. En cerdos, los IAV causan enfermedades de alta morbilidad y baja mortalidad en poblaciones susceptibles que pueden tener impactos financieros y productivos significativos. También pueden presentar oportunidades para mutaciones y reordenamiento de genes, produciendo cepas de influenza con potencial pandémico.

La influenza A es una enfermedad respiratoria altamente contagiosa que representa una grave amenaza para la salud pública mundial. Los estudios relacionados con la inmunidad han demostrado que un sistema inmunitario fuerte puede ayudar a las personas a combatir mejor el virus cuando están infectadas con el virus de la gripe, lo que reduce la incidencia y la gravedad de la enfermedad.

La inmunidad es la capacidad de nuestro sistema inmunitario para combatir las enfermedades. El sistema inmunitario humano consta de dos partes: la inmunidad innata y la inmunidad adquirida. El sistema inmunitario innato es con lo que nacemos y tiene la capacidad de todo el cuerpo para defenderse de las enfermedades. El sistema inmunitario adquirido es la inmunidad que vamos adquiriendo gradualmente en nuestra vida, e incluye principalmente la inmunidad humoral compuesta por células inmunitarias y anticuerpos, y la inmunidad celular compuesta por linfocitos T y células inmunitarias.

Los estudios han demostrado que al mantener un estilo de vida y una dieta saludables, hacer ejercicio y obtener suficientes vitaminas y otros nutrientes, puede mejorar su sistema inmunológico. Además, la vacuna también puede mejorar la inmunidad del cuerpo a los virus de la influenza y reducir la incidencia de la enfermedad.

Los virus de la influenza A son compartidos por humanos y animales, por lo que a menudo mutan. Especialmente en otoño e invierno, la inmunidad de las personas es baja y el virus de la influenza A puede atacar fácilmente aprovechando esta oportunidad. Pero si insistimos en desarrollar un estilo de vida saludable, fortalecer el ejercicio y vacunarnos activamente, podemos mejorar nuestra inmunidad y enfrentar mejor la invasión del virus de la influenza A. Además, si descubre que tiene síntomas similares a los de la gripe, debe buscar tratamiento médico y recibir tratamiento a tiempo, para que su cuerpo pueda recuperarse rápidamente.

En resumen, existe una influencia mutua entre el virus de la influenza A y la inmunidad. Reforzar la inmunidad, mantener un estilo de vida y una dieta saludables y, sobre todo, aceptar la vacunación son medidas eficaces para prevenir y luchar contra el virus de la gripe A. ¡Seamos positivos y avancemos hacia un estilo de vida más saludable en términos de prevención del virus de la influenza A! Se puede ver que necesitamos mejorar la inmunidad. Cistanche puede mejorar significativamente la inmunidad, porque la ceniza de carne contiene una variedad de ingredientes biológicamente activos, como polisacáridos, dos hongos, Huang Li, etc. Estos ingredientes pueden estimular varios sistemas inmunológicos. células similares a células, aumentando su actividad inmunológica.

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Por lo tanto, es muy importante prevenir y controlar la infección por influenza en cerdos, y la principal forma de hacerlo es a través de la vacunación. Los subtipos de IAV más prevalentes en cerdos en todo el mundo son H1N1, H1N2 y H3N2; sin embargo, la diversidad genética de estos virus puede variar mucho según la región. Previamente, desarrollamos una vacuna viva atenuada bivalente dependiente de elastasa utilizando dos aislados del virus de la influenza porcina canadiense A (swIAV), A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] y A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2 ) [SD69], que protegía frente a cepas homólogas.

En este estudio, demostramos que esta vacuna extiende la protección en cerdos a cepas H1N2 y H3N2 no homólogas más actuales, derivadas, A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] y A/Swine/AB/SD0435/ 2019 (H3N2) [SD435].

La vacuna provocó una respuesta inmune robusta en el suero y el pulmón y redujo la replicación viral así como la patología pulmonar asociada con estas cepas. Por lo tanto, esta vacuna bivalente sigue siendo una fuerte candidata que sería beneficiosa para el mercado de vacunas contra la influenza porcina en América del Norte.

Palabras clave:

Influenza; vacuna; cerdo.

1. Introducción

Los virus de la influenza A (IAV) son un patógeno importante para muchas especies, incluida la porcina. La infección puede causar una enfermedad respiratoria altamente contagiosa en los cerdos [1]. La infección por influenza en cerdos conduce a una enfermedad leve con una mortalidad muy baja, pero las tasas de morbilidad en una piara pueden alcanzar el 100 % [2]. Esto da como resultado pérdidas económicas para los ganaderos debido a la disminución de la ganancia de peso en los cerdos infectados, disminución del rendimiento productivo y fallas reproductivas en las cerdas [3,4].

La coinfección de influenza con otros patógenos respiratorios porcinos también puede conducir al desarrollo de un complejo de enfermedades respiratorias porcinas y, en consecuencia, a una mayor mortalidad y pérdidas económicas [5].
Además, los cerdos son susceptibles a la infección con IAV aviares y humanos, así como a IAV porcino (swIAV) debido a la presencia de enlaces de galactosa de ácido siálico de aves y mamíferos en sus vías respiratorias [6]. Esto hace posible que se produzca un reordenamiento cuando se coinfectan múltiples cepas, lo que podría dar lugar a la producción de nuevas cepas con potencial pandémico [4,7].

Dado que los seres humanos tienen una distribución similar del enlace galactosa del ácido siálico en todo el tracto respiratorio, es posible que se produzcan eventos indirectos bidireccionales entre los seres humanos y los cerdos. La primera ocurrencia conocida de esto fue durante la pandemia de influenza de 1918 cuando se introdujo IAV a los cerdos de humanos [8]. Este linaje se mantuvo estable en las poblaciones porcinas hasta la década de 1990, cuando las cepas H3N2 humanas y aviares se reagruparon con el linaje circulante H1N1 para producir cepas reagrupadas dobles y triples de los subtipos H1N1, H1N2 y H3N2 [8,9].

El casete del gen triple reordenado (TRIG) recientemente desarrollado condujo a un período de rápida diversificación de IAV en los cerdos de América del Norte [10]. Este casete TRIG es muy estable y facilita la sustitución de diferentes combinaciones de HA y NA [5]. Desde 2005, muchas cepas con este casete TRIG interno emparejado con genes humanos HA y NA se han extendido a través de piaras en los EE. UU. [9].

El siguiente evento indirecto notable ocurrió en 2009, cuando una cepa H1N1 de origen porcino (H1N1pdm2009) se propagó a los humanos, lo que condujo a la pandemia de influenza de 2009 [11]. La transmisión de humano a cerdo (zoonosis inversa) del IAV pandémico humano H1N1 (H1pdm) se registró varias veces en los cerdos de América del Norte, lo que condujo al establecimiento de un nuevo linaje y nuevos swIAV reagrupados [8,10,12].

En total, se han registrado siete clados H1 antigénicamente distintos y cuatro clados distintos de virus H3 en cerdos de América del Norte [5]. Recientemente, un programa de vigilancia de swIAV en Asia identificó un virus de genotipo 4 (G4) reordenado de tipo aviar (EA) predominante en Eurasia, con H1pdm y genes internos reordenados triples.

Este virus G4 se midió en el 10,4 % de los trabajadores porcinos evaluados y presenta marcadores de potencial pandémico, con la capacidad de transmitirse a los humanos y una antigenicidad diferente a la de los virus humanos que circulan actualmente [7]. Por lo tanto, es muy importante prevenir y controlar la infección por influenza en cerdos tanto desde la perspectiva de la industria porcina como de la salud pública, y la principal forma de hacerlo es a través de la vacunación [4].

En los EE. UU., el tipo de vacuna más común es el virus completamente inactivado (WIV), pero también se ha aprobado una vacuna de vector de ARN que expresa HA y una NS1-vacuna de virus de influenza atenuada viva truncada (LAIV) [4] . Los subtipos de IAV más frecuentes en cerdos en todo el mundo, incluida América del Norte, son H1N1, H1N2 y H3N2 [13].

Sin embargo, la diversidad genética de estos virus puede variar mucho según la región, y existen diferencias en la evolución genética de swIAV en Canadá y EE. UU., particularmente en los virus del subtipo H1 [12]. La vigilancia en Canadá entre 2009 y 2016 indicó que los clados genéticos de H1 que eran dominantes en los EE. UU., H1g (1A.3.3.3) y H1d-1 (1B.2.2), no se detectaron en Canadá, y el Los virus H1 en Canadá eran muy diferentes de los de los EE. UU. [12].

Se identificó un nuevo clado H1 (H1a-3) en Canadá que comenzó en Manitoba y experimentó un rápido crecimiento antes de extenderse por todo el país y los EE. UU. Con respecto a los virus H3, se documentaron seis linajes H3 en cerdos americanos (IV-A a IV-F), y de ellos, tres se encontraron en cerdos canadienses (IV-B, IV-C y IV-E) [12 ].

Esto destaca la importancia de la vigilancia regional y el conocimiento de las cepas circulantes para informar programas de vacunas efectivos e indica que las vacunas diseñadas en base a IAV que circulan en los cerdos estadounidenses pueden no proteger a los cerdos canadienses [12].

Anteriormente, se creó una vacuna bivalente utilizando dos aislamientos canadienses de swIAV, A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] y A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2), que son representantes del H{{ 9}} grupo antigénico y un nuevo grupo antigénico H3 del oeste de Canadá (grupo porcino IV-E), respectivamente [14]. Esta nueva vacuna es una vacuna de virus vivo atenuado elaborada con formas dependientes de elastasa de SD191 y SD69, SD191−R342V y SD69-K345V. Los estudios demostraron que protegía contra SD191 y SD69, así como contra una cepa heteróloga H1N2 A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2) que también se aisló en el oeste de Canadá [14].

Desde entonces, las cepas de swIAV circulantes han seguido disminuyendo. Los aislamientos clínicos más recientes de cerdos en el oeste de Canadá se recolectaron y aislaron de muestras de campo en el Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canadá. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] es un miembro del grupo antigénico H -3 pero tiene cinco sustituciones de aminoácidos de 54 sitios antigénicos H1 clave en comparación con SD191 [10,15, dieciséis].

A/Swine/AB/ SD0435/2019 (H3N2) [SD435] es un miembro del grupo IV-E, pero se ha desviado para incluir dos sustituciones de aminoácidos de los seis sitios antigénicos H3 clave [17].

En este estudio, evaluamos si la LAIV dependiente de elastasa bivalente se mantendría frente a nuevos aislamientos clínicos y podemos informar que protegió a los cerdos cuando se desafiaron con las cepas SD467 (H1N2) y SD435 (H3N2) de swIAV que circulan actualmente.

2. Materiales y métodos

2.1. Células y Virus

Células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) (ATCC, #CRL-2936) se mantuvieron en medio mínimo esencial (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, St. Louis, MO, EE. UU.) que contenía suero bovino fetal al 10 %. (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canadá 16000-044), y se mantuvieron en una incubadora humidificada con CO2 al 5 por ciento a 37 ◦C. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] y A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV fueron aislados de muestras de campo en el Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon , SK, Canadá.

Los virus de la vacuna SD191-R342V y SD69- K345V se rescataron como se describió anteriormente [14]. Todos los virus se cultivaron en células MDCK en presencia de 0.2 por ciento de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) con 1 µg/ml de L-[(tolueno{ {11}}sulfonamida)-2-fenil] etil clorometil cetona (TPCK)-tripsina (virus WT) o 0,5 µg/mL de elastasa de neutrófilos humanos (virus dependientes de elastasa) (Sigma-Aldrich, E8140).
2.2. Diseño de ensayos con animales

Veinticuatro cerdos negativos para swIAV de cuatro semanas de edad se obtuvieron del Prairie Swine Center Inc. (Saskatoon, SK, Canadá). Estos cerdos se seleccionaron al azar y se dividieron en cuatro grupos con siete cerdos por grupo vacunado y cinco cerdos por grupo vacunado simulado.

La asignación de grupo se describe en la Figura 1A. Estos grupos se alojaron en habitaciones separadas según los grupos de vacunación (grupos A más B y C más D alojados juntos) y se les permitió aclimatarse durante siete días antes de la infección.

A las cinco semanas de edad (día 0), así como a las ocho semanas de edad (día 21), los cerdos de los grupos A y B fueron vacunados de forma intratraqueal con 4 mL de MEM, mientras que los grupos C y D fueron vacunados con una vacuna bivalente que contiene 1 × 106 UFP de cada SD191−R342V y SD69-K345V en 4 ml de MEM. Diez días después (día 31), los cerdos fueron desafiados con MEM (simulacro) o 1 × 106 PFU de SD435-WT (H3N2) o SD467-WT (H1N2).

Los cerdos fueron monitoreados durante cinco días después del desafío, con temperaturas rectales tomadas diariamente y frotis nasales tomados de ambas fosas nasales los días 1, 3 y 5. Se recolectó suero después de la primera (día 20) y la segunda (día 30) vacunas para el ensayo de neutralización del virus sérico (SVN) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En el día 5 después del desafío, todos los cerdos fueron sacrificados humanitariamente, y los pulmones fueron extraídos y evaluados para determinar la presencia de lesiones macroscópicas características de swIAV. También se recolectaron muestras de tejido pulmonar para el aislamiento del virus (Figura 1B).

2.3. Declaración de Ética

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad (UACC) y la Junta de Ética de Investigación Animal (AREB) de la Universidad de Saskatchewan. Este protocolo fue aprobado el 12 de noviembre de 2021 (Protocolo de Uso Animal #20190064). Todos los procedimientos se realizaron según los estándares requeridos por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal (CCAC) en la Organización de Vacunas y Enfermedades Infecciosas (VIDO), Universidad de Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canadá.

2.4. Muestreo

Se colocaron hisopos nasales de cada fosa nasal en 1 ml de MEM que contenía 1 × antibiótico antimicótico (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canadá, 15240-062) y se congelaron a -80 ◦C hasta que se realizó qRT-PCR. Todos los cerdos se sacrificaron de forma humanitaria mediante la administración intravenosa de etanol (240 mg/ml de pentobarbital sódico; 2 ml por 4,5 kg). Tras la eutanasia, se extirparon los pulmones en su totalidad para determinar tanto el porcentaje de lesiones firmes de color rojo púrpura como la neumonía.

Los porcentajes se determinaron en función de los pesos de los lóbulos pulmonares, así como del volumen pulmonar total [18]. También se tomaron muestras de pulmón de los lóbulos apicales, cardíacos y diafragmáticos derechos para la titulación viral. Estas muestras de pulmón se mezclaron en volúmenes iguales de MEM al 10 por ciento p/v que contenía 1x antibiótico-antimicótico para la titulación.

Figura 1. Agrupación de cerdos y diseño del ensayo para evaluar la eficacia protectora de la LAIV bivalente frente a nuevos aislados clínicos. Los cerdos (n=5 para los grupos MEM/MEM y n=7 para los grupos bivalente/bivalente) se vacunaron por vía intratraqueal con 4 ml de MEM o la vacuna bivalente compuesta por 1 × 106 PFU de cada SD191−R342V y SD69-K345V en los días 0 y 21. En el día 31, los cerdos fueron desafiados intratraquealmente con MEM o 1 × 106 PFU de SD435 (H3N2) o SD467 (H1N2). (A)

El programa de inmunización, desafío y toma de muestras para este ensayo con animales. Se permitió que veinticuatro cerdos negativos para swIAV de cuatro semanas de edad se aclimataran durante siete días antes de la infección. A las cinco semanas de edad (día 0) así como a las ocho semanas de edad (día 21), los cerdos de los grupos A y B fueron vacunados de forma intratraqueal con 4 mL de MEM, mientras que los grupos C y D fueron vacunados con una vacuna bivalente que contiene 1 × 106 PFU de cada SD191−R342V y SD69-K345V en 4 ml de MEM.

Diez días después (día 31), los cerdos fueron desafiados con MEM (simulacro) o 1 × 106 PFU de SD435-WT (H3N2) o SD467-WT (H1N2). Los cerdos fueron monitoreados durante cinco días después del desafío, tomándose la temperatura rectal diariamente y tomando hisopos nasales de ambas fosas nasales los días 1, 3 y 5. Se recolectó suero después de la primera (día 20) y la segunda (día 30) vacunas. El día 5 después de la exposición (día 36) todos los cerdos fueron sacrificados sin crueldad y se extrajeron los pulmones para su evaluación. (B) Creado con BioRender.com.

2.5. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Para producir antígenos de recubrimiento, se propagaron SD435 y SD467 en células MDCK y se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. La inactivación de los virus ocurrió agregando 97 por ciento de -propiolactona al virus a una concentración de 1:1000 (v/v) (Thermo Fisher Scientific, AAB2319703). Esta mezcla se agitó a 4 ◦C durante la noche, se incubó a 37 ◦C durante dos horas para facilitar la hidrólisis de -propiolactona y luego se almacenó a -80 ◦C hasta su uso.

Para medir los niveles de IgG específica de swIAV inducidos por la vacunación y el desafío, se tomó suero de cerdo después de la primera (día 20) y la segunda (día 30) vacunas, y antes de la necropsia (día 36).

Se aplicaron virus SD435 (1 µg/ml) y SD467 (2 µg/ml) inactivados con propiolactona purificados, diluidos en tampón de recubrimiento de carbonato/bicarbonato (pH 9,6) a placas de pocillos Immulon-2 96- a 1{{ 12}}0 µL/pozo (Thermo Labsystems, Ottawa, ON, Canada, 3655) e incubado durante la noche a 4 ◦C. Después de la incubación durante la noche, las placas recubiertas se lavaron cuatro veces con TBST (0.1 M Tris, 0.17 M NaCl y 0.05 por ciento de Tween 20), a las que se añadieron diluciones en serie de cuatro veces del suero o BALF para la placa por duplicado, seguido de una incubación de dos horas a temperatura ambiente. Se añadió suero a una dilución inicial de 1:10 y se añadió BALF sin diluir.

Se analizaron en cada placa muestras de sueros de control positivo previamente definidos y los controles negativos, suero y BALF apropiados de cerdos no vacunados en un estudio anterior [14]. Las placas se lavaron cuatro veces con TBST, después de lo cual, anticuerpo purificado por afinidad marcado con fosfatasa (1:5000) anti-IgG porcina (H más L) de cabra (Sigma Aldrich, SAB3700435) o IgA anti-porcina de ratón (Serotec, MCA658) ( 1:300) diluido en TBST y se dejó incubar a temperatura ambiente durante una hora.

Los ELISA de IgA se desarrollaron mediante la adición de anticuerpos IgG de cabra anti-ratón biotinilados (H más L) (CALTAG, Burlingame, CA, EE. UU., M30015) y solución de fosfatasa alcalina de estreptavidina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) ambos durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas de IgG e IgA se lavaron cuatro veces con TBST, a las que se añadió sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) [10 mg/ml de di(tris) sal cristalina de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma-Aldrich), dietanolamina al 1 por ciento ( Sigma-Aldrich), 0,5 mg/ml de MgCl2 y pH 9,8] (1 mg/ml) y se incubó a temperatura ambiente durante dos horas.

La reacción se detuvo mediante la adición de ácido 0.3 M etilendiaminotetraacético (EDTA), y las placas se leyeron en un espectrofotómetro a 405 nm con una referencia de 490 nm. El título de la muestra se definió como la dilución más alta a la que la DO de esa muestra fue mayor que el límite definido (la DO media de una muestra negativa conocida más dos veces la desviación estándar).

2.6. Ensayo de neutralización de virus (VN)

Las células MDCK (3,5 × 104) se sembraron en 96-placas de pocillos. El suero y BALF se inactivaron con calor a 56 ◦C durante 30 min. Se añadieron diluciones dobles de suero y BALF a la placa por cuadruplicado, y se incubaron 60 µL de suero diluido o BALF con un volumen igual de SD435 o SD456 que contenía 100 TCID50 a 37 ◦C durante 1 hora.

Luego se agregaron 100 µL de la mezcla a las células MDCK y se documentó el efecto citopatogénico (CPE) a las 48 horas y 72 horas después de la infección (pi). El título de anticuerpos de neutralización fue la dilución más alta de cada muestra de suero que protegió completamente a las células de CPE en al menos 2 de 4 pocillos.

2.7. Determinación viral

Tras la recogida, las muestras de pulmón se colocaron inmediatamente en hielo y se congelaron a -80 ◦C hasta su procesamiento. Para el procesamiento, se pesó cada tejido pulmonar y se añadió una concentración del 10 por ciento (p/v) de MEM suplementado con 1x antibiótico-antimicótico (Thermo Fisher Scientific, 15240-062). El tejido pulmonar se homogeneizó en el TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Alemania) a 30 Hz durante 5 min, seguido de centrifugación a 5000 × g durante 10 min a 4 ◦C. El sobrenadante homogeneizado se recogió y almacenó a -80 ◦C hasta su posterior análisis.

Los hisopos nasales se agitaron durante 15 segundos y se centrifugaron a 1600 × g durante 25 min a 4 ◦C. Los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -80 ◦C hasta su posterior análisis. Los títulos virales se determinaron mediante ensayo TCID50 para el pulmón y RT-PCR cuantitativa para los hisopos nasales.

2.8. Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR)
Para determinar los niveles de ARN viral de SD467 y SD435 en los hisopos nasales posteriores a la exposición, se realizó qRT-PCR. Se realizó una curva estándar utilizando ARN extraído de SD435 y SD467 de un título conocido. Brevemente, se usó el Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen, Toronto, ON, Canadá, 74136) para extraer ARNv de 200 µL de lavado nasal.

El ARN se convirtió en ADNc utilizando el cebador universal de influenza Uni12 y SuperScript III Transcriptase (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) [19]. La qPCR se realizó por triplicado en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlusTM (Applied Biosystems, CA, EE. UU.) con Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5 µL de ADNc y 1 µL de cebadores directo e inverso de 10 µM. Las reacciones de PCR se realizaron a una temperatura de hibridación de 58 ◦C durante 40 ciclos. Todas las secuencias de cebadores de qPCR están disponibles a pedido.

2.9. Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 8. Se utilizaron las pruebas no paramétricas de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis. Las diferencias significativas se indican con * (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0,001) , o **** (p < 0,0001). ns=no significativo.

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