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1. Introducción

La identificación de ingredientes alimentarios con propiedades inmunomoduladoras junto con sus respectivos objetivos moleculares ha atraído un mayor interés en los últimos años. Debido a su alta diversidad de ligandos, la superfamilia de canales iónicos de potencial receptor transitorio (canales TRP) representa una clase muy interesante de estructuras diana potenciales.

La superfamilia de canales TRP de mamíferos incluye seis familias de proteínas relacionadas, a saber, la anquirina (TRPA), la canónica (TRPC), la melastatina (TRPM), la mucolipina (TRPML), la policistina (TRPP) y la familia vanilloide (TRPV), todas ellas que normalmente comparten seis segmentos transmembrana que se ensamblan como tetrámeros para formar poros permeables a los cationes con selectividad catiónica variable. [1] El canal TRPV1 puede ser, con diferencia, el miembro de la superfamilia TRP investigado más intensivamente. TRPV1 se identificó inicialmente como el receptor de capsaicina, el componente picante de los chiles.[2] Más tarde, también se demostró que los ingredientes picantes del jengibre, los gingeroles, activaban TRPV1.[3]

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El papel biológico de TRPV1 en tipos de células no neuronales aún está bajo investigación exhaustiva, pero los resultados disponibles implican funciones mucho más allá de la percepción sensorial y térmica. Por ejemplo, una intervención de 12-semana con una dosis diaria de 0 0,15 mg del agonista de TRPV1 nonivamida, un análogo estructural de la capsaicina, previnieron un aumento de masa grasa corporal inducido por la dieta y aumentaron los niveles plasmáticos de serotonina en sujetos sanos con sobrepeso.[4]

En los adipocitos 3T3-L1, la activación de TRPV1 por la nonivamida disminuyó la acumulación de lípidos durante la diferenciación y maduración al suprimir la expresión de PPAR𝛾.[5] En los macrófagos, la capsaicina y la nonivamida atenuaron la liberación de citoquinas proinflamatorias inducida por LPS como IL6, CXCL8 y TNF-alfa, de manera dependiente de TRPV1-.[6] Sin embargo, las funciones particulares de TRPV1 en los leucocitos de la sangre humana siguen siendo vagas. En las células NK humanas, la capsaicina 10 y 50 μM indujo un aumento en las concentraciones de Ca2+ intracelular, lo que indica un canal TRPV1 funcional.[7]

Sin embargo, las funciones efectoras atenuadas de las células NK, como la degranulación citotóxica y la secreción de citoquinas, inducidas por el tratamiento previo de las células con capsaicina durante 1 h en un rango de concentración de 10-100 μM, fueron en gran medida independientes de TRPV1.[7] En las células T, se documentó que TRPV1 participa en los procesos de señalización del receptor de células T, proliferación y diferenciación de células T, así como en la producción de citoquinas.[8] Trabajos anteriores de nuestro grupo también demostraron la expresión funcional de TRPV1 en células T primarias humanas.[9] Además, los análisis de dosis-respuesta en concentraciones que oscilan entre 0,03 y 300 μmol L-1 revelaron que el [6]-gingerol inhibe la secreción de citocinas por los leucocitos humanos primarios con un valor de CI50 de 82,2 μmol L-1.

Sin embargo, la cuantificación de [6]-gingerol en muestras de plasma de sujetos sanos reveló una concentración plasmática máxima media de sólo 42,0 ±16,3 nmol L-1 después de la ingesta de 1 litro de té de jengibre. Dado que estas concentraciones de [6]-gingerol no tuvieron un impacto significativo en la secreción de citocinas en estudios previos, [9] no está claro si se alcanza una concentración dietética relevante de 50 nmol L-1 en el plasma sanguíneo después del consumo de 1 L de té de jengibre. , es suficiente para modular las respuestas inmunes celulares en otros leucocitos primarios humanos.

Para los neutrófilos humanos, el conocimiento sobre el papel funcional de TRPV1 es limitado. Mientras que Köse y Nazıroglu˘ [10] mostraron que los flujos de Ca2+-en los neutrófilos en respuesta a capsaicina 10 μM eran disminuidos por el antagonista de TRPV1 capsazepina, otros resultados no demostraron que la capsaicina indujera un influjo de Ca2+ cuando se probó en una concentración rango de 1 a 100 μM, a pesar de una expresión detectable de ARN de TRPV1.[11]

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre humana y representan entre el 60 y el 70 % de todos los glóbulos blancos circulantes. Son las primeras células inmunitarias que se reclutan en los sitios de infección; por lo tanto, a menudo se les llama la primera línea de defensa.[12] El reclutamiento de neutrófilos es desencadenado, entre otros, por las orquimiocinas del péptido N-formilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLF), bacteriano o derivado de mitocondrias, como CXCL8 (IL-8).[13]

Los mecanismos de defensa de los neutrófilos incluyen la fagocitosis,[14] la liberación de enzimas antimicrobianas mediante desgranulación,[15] la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS),[16] y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos.[17]Además de estos mecanismos de defensa directos, los neutrófilos Además, contribuye a respuestas inmunitarias posteriores mediante la liberación de diversas citocinas y quimiocinas.[18] Además, los neutrófilos pueden someterse a un proceso de preparación que les permite responder con más fuerza a la activación completa posterior.[16b]

En los últimos años, ha aumentado la evidencia de que los ingredientes provenientes de alimentos o plantas medicinales pueden modificar una o más de las respuestas de defensa mencionadas de los neutrófilos humanos. Estas modificaciones incluyen una mayor actividad fagocitótica[19] y generación de ROS,[20] un aumento de la quimiotaxis hacia fMLF,[21] y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos.[20] Sin embargo, no se identificaron los compuestos activos. Los constituyentes de Ferula akitschkensis (𝛽-pineno, sabineno, 𝛾-terpineno, geranilacetona, andisobornilacetato) desensibilizaron a los neutrófilos a la entrada de Ca2+ inducida por fMLF y CXCL8- e inhibieron la quimiotaxis inducida por fMLF, en la que la geranilacetona inducida los efectos fueron mediados a través de TRPV1.[22]

Con base en los datos disponibles, planteamos la hipótesis de que la activación de TRPV1 inducida por ligando por el [6]-gingerol puede afectar las funciones generales de los neutrófilos, ya sea directamente o mejorando sus respuestas a los estímulos activadores. Dentro del alcance de esta hipótesis, nuestro objetivo particular fue dilucidar si una concentración nutricionalmente relevante verificada es suficiente para modular las respuestas inmunes celulares en los neutrófilos primarios humanos como parte de la población de leucocitos. '

Además, intentamos comparar los niveles de expresión de ARN de todos los miembros de la superfamilia TRP de mamíferos en cinco de los tipos de células más prominentes en la sangre humana para obtener una descripción general cualitativa y cuantitativa de la expresión del canal TRP en leucocitos humanos.

2. Resultados

2.1. Abundancia y niveles relativos de transcripción de canales TRP en leucocitos humanos

Para evaluar la expresión de ARN del canal TRP en leucocitos sanguíneos, se aislaron cinco de los tipos de células leucocitarias más prominentes de la sangre de donantes sanos y se analizó la expresión de ARN de los canales TRP mediante RT-PCR cuantitativa (Figura 1).

Se detectaron transcripciones específicas de TRPV y de la familia TRPM con frecuencias altas de 75 a 100% en todos los tipos de células analizados. La frecuencia general media considerando todos los tipos de células fue del 96% para la familia TRPV y del 98% para la familia TRPM. Las transcripciones específicas de TRPC fueron mucho menos abundantes, oscilando desde el 0% en monocitos, células NK, células T y células B hasta el 100% en células NK y células T con una frecuencia media general de solo el 53% (Figura 1A). El transcrito específico TRPC5-sólo se detectó en neutrófilos, con una frecuencia del 70%.

Además, la transcripción específica de TRPA1-en general reveló una abundancia bastante baja en los tipos de células analizadas con una frecuencia del 100 % en neutrófilos, 25 % en monocitos, 80 % en células NK, 100 % en células T y 60 % en Bcélulas. Asimismo, el transcrito específico de TRPML3-mostró una baja frecuencia en neutrófilos (50%), monocitos (25%), células NK (40%) y células B (20%), pero una frecuencia del 100% en Células T. El transcrito específico de TRPV1- se detectó en todos los tipos de células, mostrando una frecuencia del 100 % en monocitos, células NK y células T, y una frecuencia del 90 % en neutrófilos y del 80 % en células B.

Con respecto a la expresión relativa de ARN, en comparación con las frecuencias respectivas, los canales TRP revelaron un patrón de expresión más específico del tipo de célula, como se evidencia en la comparación de los valores de Δct respectivos en los diferentes tipos de células analizados (Figura 1B). Por ejemplo, TRPP3 se detectó con una frecuencia del 100 % en todos los tipos de células, pero reveló claramente el nivel de expresión más alto en los monocitos.

Por el contrario, en todos los tipos de células investigados se detectó el canal TRPV2, con un nivel de expresión de ARN comparablemente alto, así como una alta frecuencia. Asimismo, los niveles de transcripción de TRPV1 fueron similares en todos los tipos de células examinados (Figura 1B).

2.2. Expresión de superficie de TRPV1 en neutrófilos

El conocimiento actual sobre la función de TRPV1 en los neutrófilos humanos aún no está claro. Para explorar más a fondo las funciones de TRPV1 en los neutrófilos humanos, a continuación investigamos si el canal TRPV1 se expresa en la superficie de los neutrófilos humanos primarios mediante citometría de flujo de células vivas (Figura 2).

Los neutrófilos aislados se tiñeron para CD15 como marcador de superficie para neutrófilos (Figura 2A, B) y simultáneamente se tiñeron con un anticuerpo generado contra un epítopo en el primer bucle extracelular de la proteína TRPV1 (Figura 2B) o el control de isotipo respectivo, sirviendo este último como un sustituto para medir la unión inespecífica (Figura 2A). Dentro de la población CD15+, se analizó la intensidad de fluorescencia para FITC. La tinción de los neutrófilos con el anticuerpo TRPV1 produjo una señal de fluorescencia claramente distinguible en comparación con el control de isotipo, lo que confirma la expresión superficial de TRPV1 en neutrófilos humanos primarios (Figura 2C). El análisis de neutrófilos de cuatro donantes individuales reveló una expresión superficial comparable de TRPV1 (Figura 2D).

2.3. [6] Aumento inducido por gingerol en Ca intracelular2+

Dado que la activación de TRPV1 inducida por ligando dará como resultado una entrada de Ca2+,[23] las concentraciones intracelulares de Ca2+ de neutrófilos se determinaron mediante el colorante sensible al Ca2+-Fura-2. Con base en nuestros hallazgos anteriores,[9] se eligió una concentración de 50 nM del conocido ligando TRPV1 [6]-gingerol y un tiempo de incubación de 2 h. Los análisis mostraron que la incubación de neutrófilos con [6]-gingerol 50 nM dio como resultado un aumento de las concentraciones de Ca2+ intracelular que fueron en promedio 18,4% ± 1,0% del valor máximo, según lo determinado aplicando 1 μM de ionoforeionomicina. El aumento inducido por DMSO fue del 4,7% ± 1,2% (Figura 3).

2.4. Impacto de [6] -Gingerol en la expresión de TRPV1

A continuación, nuestro objetivo fue analizar el impacto de la estimulación de TRPV1 por [6]-gingerol en la expresión de TRPV1 a nivel de transcripción mediante q-RTPCR, así como a nivel de proteína de superficie mediante tinción de células vivas. Para este propósito, se incubaron neutrófilos humanos con [6]-gingerol 50 nM durante 2 h y se cuantificaron los respectivos niveles de expresión.

Esta incubación de 2 h no afectó ni el transcrito de TRPV1 ni los niveles de proteína (Figura 4), y tampoco cambió, excepto para IL6, IL17A, IL24, C5 y GDF5, la expresión de ARN de genes de citocinas y quimiocinas comunes investigados (Figura S1, Tabla S2). ,Información de soporte).

2.5. Impacto del [6] -Gingerol en la expresión de marcadores de superficie de neutrófilos

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