Una nueva mutación homocigótica de KLHL3 como causa de pseudohipoaldosteronismo autosómico recesivo tipo II diagnosticado en una etapa avanzada de la vida
Nov 02, 2023
Introducción abstracta:
El pseudohipoaldosteronismo tipo II (PHA II) es un trastorno mendeliano que se caracteriza por acidosis hiperpotasémica y niveles bajos de renina plasmática, típicamente asociados con hipertensión. Las mutaciones en WNK1, WNK4, CUL3 y KLHL3 causan PHA II, con mutaciones dominantes en WNK1, WNK4 y CUL3 y mutaciones dominantes o recesivas en KLHL3. Se han informado catorce familias con mutaciones recesivas de KLHL3, con diagnóstico entre los 3 meses y los 56 años de edad, generalmente en individuos con función renal normal.
Métodos: Realizamos investigaciones clínicas y genéticas en un paciente con hipertensión hiperpotasémica y utilizamos simulaciones de dinámica molecular, expresión heteróloga en células COS7 y transferencia Western para investigar el efecto de una mutación de la enfermedad candidata KLHL3 en la expresión de la proteína WNK4.
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Resultados: La paciente, una mujer de 58-años de familia consanguínea, presentó hipertensión arterial, acidosis hiperpotasémica persistente asociada a dolores musculares severos, nefrolitiasis, enfermedad renal crónica (ERC) y enfermedad coronaria. La terapia con hidroclorotiazida corrigió la hiperpotasemia, la hipertensión y el dolor muscular. El análisis genético reveló una mutación homocigótica de p.Arg431Trp en una posición KLHL3 altamente conservada. Las simulaciones sugirieron una estabilidad reducida de la proteína mutante, lo que fue confirmado mediante transferencia Western. En comparación con el KLHL3 de tipo salvaje, la cotransfección de p.Arg- 431Trp KLHL3 condujo a un aumento de los niveles de proteína WNK4, lo que se infiere que causa una mayor reabsorción de NaCl a través del portador sensible a tiazidas y PHA II.
Conclusiones: Incluso en pacientes que se presentan a una edad avanzada y en presencia de ERC, se debe sospechar PHA II si los niveles de renina son bajos y la acidosis hiperpotasémica y la hipertensión son inadecuadas para el estadio de ERC, particularmente en presencia de antecedentes familiares sospechosos.
Introducción
La hipertensión arterial sistémica afecta a más de 1.100 millones de adultos en todo el mundo [1] y se considera el factor de riesgo modificable más importante de morbilidad y mortalidad por todas las causas en todo el mundo [2]. Aproximadamente el 90% de los pacientes adultos tienen la llamada hipertensión primaria o esencial con etiología multifactorial gen-ambiente [2], mientras que en el resto se puede identificar una causa subyacente de hipertensión. Las causas comunes de hipertensión secundaria son el aldosteronismo primario, la apnea obstructiva del sueño, la enfermedad renal parenquimatosa y la estenosis de la arteria renal [3]. En casos raros, la hipertensión se hereda como rasgo monogénico. Los pacientes afectados suelen presentar niveles bajos de renina plasmática, mientras que los niveles de aldosterona y electrolitos varían según la etiología subyacente [4]. Las formas mendelianas de hipertensión suelen manifestarse en la infancia o la juventud. Los adultos rara vez son investigados por hipertensión monogénica; por tanto, se desconoce su prevalencia en la población general. En una cohorte seleccionada (criterios de inclusión al menos uno de: edad de inicio menor o igual a 35 años, hipertensión resistente, hipertensión con anomalías electrolíticas, anomalías hormonales, resultados de imágenes anormales o signos clínicos sugestivos), se examinaron 37 genes candidatos. y se identificaron variantes patógenas o probablemente patógenas en 33 de 1.179 casos (2,8%) [5].
Este estudio se centra en el pseudohipoaldosteronismo tipo II (PHA II), una forma de hipertensión mendeliana que presenta acidosis hiperpotasémica y niveles bajos de renina plasmática [6]. PHA II también se conoce como hipertensión hiperpotasémica familiar. Fue descrita por primera vez en 1964 por Paver y Pauline en un varón joven con hipertensión grave e hiperpotasemia a pesar de una función renal normal [7], que fue caracterizado además por Stokes y colegas [8] y Arnold y Healy [9] y demostró tener baja renina plasmática. Tras el informe de una niña de 10- años con estatura baja, hipertensión, hiperpotasemia grave, acidemia leve, parálisis periódica y renina suprimida en 1970 por Gordon et al. [10], el síndrome también se ha denominado ocasionalmente síndrome de Gordon.
En 2001, se identificaron mutaciones en los genes de serina-treonina quinasa sin lisina (WNK), WNK1 y WNK4, como causas de PHA II [11], y otras mutaciones en KLHL3 (que codifica kelch-like 3) y CUL3 (que codifica Los genes cullin 3) se describieron en 2012 [12, 13]. Las subformas de PHA II causadas por mutaciones en WNK1, WNK4 y CUL3 son trastornos autosómicos dominantes, mientras que las mutaciones en KLHL3 pueden heredarse de forma autosómica dominante o autosómica recesiva [12]. KLHL3 presenta un dominio BTB N-terminal, seguido de un dominio BACK y una estructura de hélice de seis palas C-terminal que consta de las llamadas repeticiones tipo kelch (que se muestran en las figuras 1d, 2a). Las mutaciones dominantes de KLHL3 se agrupan en o entre las palas de la hélice, mientras que las mutaciones recesivas se distribuyen por toda la proteína [12]. Los casos recesivos son menos comunes que los casos dominantes; en total, se han publicado 21 pacientes de 14 familias con mutaciones recesivas de KLHL3 [12-15] (Tabla 1).
La fisiopatología subyacente de la hipertensión en PHA II es el aumento de la reabsorción de NaCl a través del transportador sensible a tiazidas (cotransportador de Na-Cl, NCCT) en el túbulo contorneado distal del riñón, y la terapia con tiazidas corrige tanto la hipertensión como las anomalías electrolíticas en pacientes con PHA II. [dieciséis]. En resumen, WNK1 y WNK4 fosforilan OSR1 (gen 1 que responde al estrés oxidativo) y SPAK (quinasa rica en prolina-alanina relacionada con Ste{{8}), que luego fosforilan y activan NCCT [17, 18]. KLHL3 es un adaptador de sustrato de la ubiquitina ligasa CUL3; el complejo KLHL3-CUL3 ubiquitinila las quinasas WNK y, por lo tanto, promueve su degradación [19]. La pérdida de la función de la ubiquitina ligasa o la alteración de la unión a las quinasas WNK provocan un aumento de la abundancia de WNK, un aumento de la fosforilación de NCCT [18] y un aumento de la absorción de NaCl en el túbulo contorneado distal. En segmentos posteriores de la nefrona, la reabsorción de NaCl a través de ENaC (canal de sodio epitelial) y la secreción de K+ a través de ROMK (canal de potasio medular externo renal) se reducen [20, 21]. Los ratones knockout para KLHL3 muestran hipoplasia del túbulo contorneado distal, niveles fuertemente aumentados de WNK1 y WNK4, y aumento de la fosforilación de OSR1, SPAK y NCC en el riñón. Además, presentan hiperpotasemia, hipercloremia y acidosis metabólica [22]. Aquí, informamos sobre un paciente con PHA II autosómico recesivo y caracterizamos la mutación genética y la fisiopatología subyacentes.
Materiales y métodos
Preparación de ADN y secuenciación de Sanger El ADN se preparó a partir de una muestra de sangre venosa periférica utilizando el kit QIAamp DNA Blood Maxi (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron PCR estándar y secuenciación Sanger bidireccional directa de ADN genómico utilizando cebadores publicados para KLHL3 [13], WNK1 y WNK4 [11], y CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3′) y cebadores CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCAAAACAATCTACC-3′) para CUL3. La secuenciación de Sanger se realizó en Eurofins Genomics.
Alineación de secuencia
Las secuencias de proteínas homólogas se identificaron utilizando NCBI Protein BLAST (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y la base de datos eggNOG (//eggnogdb.embl.de). Las secuencias mostradas incluyen KLHL3 humano y sus ortólogos: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1) y Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . Los parálogos humanos se identificaron mediante investigaciones bibliográficas e incluyen KLHL1 a KLHL42, como se muestra en la Tabla 1 complementaria en línea (para ver todo el material complementario en línea, consulte www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. Las secuencias se alinearon utilizando Jalview versión 2.10.5 [24]. La estructura del dominio era de UniProt (Q9UH77, consultado el 13 de abril de 2021) y se visualizó utilizando DOG [25].
Plásmidos y mutagénesis dirigida al sitio.
Los plásmidos pTRE2hyg WNK4 y pFN21A KLHL3 fueron un amable obsequio del Dr. Shinichi Uchida (Universidad Médica y Dental de Tokio). Para introducir la mutación p.R431W, se diseñaron cebadores utilizando Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) y 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). Los residuos mutantes se muestran en negrita. La mutagénesis dirigida al sitio se realizó utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange con una ADN polimerasa de alta fidelidad PfuUltra (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc fue secuenciado por Sanger en Eurofins Genomics. Los plásmidos se prepararon utilizando el kit QIAGEN Plasmid Plus Maxi.
Cultivo de tejidos, transfección transitoria y Western Blot
Las células COS7 se cultivaron en DMEM + L-glutamina, 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina (todos Gibco, Thermo Fisher). Para las transfecciones, las células se sembraron en placas de 6-pocillos a una densidad de 1,9 × 105 células/pocillo y se cultivaron hasta aproximadamente un 90% de densidad. Las células se transfectaron con 1 µg de pTRE2hyg WNK4 y 2 µg de pFN21A (vector vacío o KLHL3 de tipo salvaje [WT]) o ADNc de KLHL3 R431W usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Se usaron dos clones independientes cada uno para la transfección. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lavaron en PBS frío y se lisaron en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM y NP40 al 1% que contenía un cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche, Merck). El lisado se centrifugó a 20,{49}} g durante 30 minutos a 4 grados y el sobrenadante se almacenó a -20 grados. Las concentraciones de proteína se determinaron por duplicado (estándar) o por triplicado (muestras) mediante el ensayo BCA (Pierce, Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se fraccionaron aproximadamente 20 µg de proteína total mediante SDSPAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (1,5 h, 100 V). Las membranas se bloquearon en leche en polvo al 2% en TBST. La transferencia Western se realizó usando anti-HaloTag policlonal de conejo (Promega #G9281, 1:500, 4 grados durante la noche), seguido de lavado e incubación con IgG de burro anti-IgG de conejo (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46 }}, dianova, 1:20, 000, 1 h a temperatura ambiente), lavado y detección quimioluminiscente mejorada (reactivo de detección de transferencia Western Amersham ECL Prime, GE Healthcare). Las transferencias se eliminaron usando ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth), se bloquearon en leche en polvo al 2% en TBST durante la noche a 4 grados y se incubaron con anti-FLAG M2 monoclonal de ratón (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{{69} }, 1,5 h a temperatura ambiente), seguido de IgG de burro anti-IgG de ratón (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 h a temperatura ambiente temperatura), detección ECL, extracción y bloqueo como se indicó anteriormente. Luego, las transferencias se incubaron con actina monoclonal de ratón anti- -(Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5000, 1 hora a temperatura ambiente) e IgG de burro anti-IgG de ratón, seguido nuevamente por detección de ECL. Las bandas se cuantificaron utilizando el software Image Lab en un ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Las intensidades de las bandas detectadas por el anticuerpo anti-HaloTag y el anticuerpo anti-FLAG M2, respectivamente, se dividieron por las intensidades correspondientes de las bandas detectadas por los anticuerpos anti-actina. Para evaluar los niveles de expresión de KLHL3, las células se transfectaron como anteriormente, sin embargo, usando 0 µg, 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg y 8 µg de pFN21A KLHL3 WT o R431W. La electroforesis en gel y la transferencia se realizaron como anteriormente. Para el ensayo de persecución de cicloheximida, las células se sembraron como anteriormente y se transfectaron como anteriormente, pero con 2 µg de pFN21A KLHL3 WT o 4 µg de KLHL3 R431W. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se añadió cicloheximida 100 µM y las células se lisaron después de los puntos de tiempo indicados. Los pasos de análisis adicionales fueron los anteriores.
Fig. 2. Simulaciones MD de los dominios Kelch WT y p.Arg431Trp (R431W) KLHL3. a Vista de arriba hacia abajo del dominio Kelch (PDBID: 4CH9), coloreada por las palas de la hélice (K1 – K6). El sitio de mutación está indicado por una estrella amarilla, la región de interés está coloreada en gris (residuos 425–465) y el péptido WNK4 (no incluido en las simulaciones) es transparente y está coloreado en gris. b Diferencia en los MSF del dominio Kelch mapeado en la columna vertebral de la proteína. El sitio de la mutación está indicado por una estrella amarilla. El color rojo indica partes más dinámicas (menos estables) de la proteína. c RMSD de la proteína completa (arriba), residuos 425–465 (centro) y el bolsillo de unión WNK4-(abajo) de la estructura cristalina para tres réplicas de simulación independientes (líneas en negrita, promedios móviles). d Gráficos de violín de enlaces h (izquierda) y distancia COM (centro) entre K3 (residuos 425–441) y K4 (442–465): palas de hélice y electrostática del bolsillo de unión (derecha). e Superposición estructural de la interfaz K3-K4 del cuadro final (1,1 μs) de cada réplica (WT, azul; R431W, gris) con los modelos experimentales/iniciales (negro). La columna vertebral de la proteína se muestra como una caricatura, y el residuo 431 se muestra como palitos. MSF: fluctuación cuadrática media.
Simulación de dinámica molecular
El modelo WT se basó en la estructura cristalina de rayos X (PDBID: 4CH9) del dominio Kelch humano en complejo con el fragmento peptídico WNK4 [26]. Los átomos faltantes y las tapas terminales se agregaron utilizando la utilidad psfgen en la versión 1.9.3 de dinámica molecular visual [27]. El modelo KLHL3 mutante (R431W) se generó utilizando Modeller versión 9.18 [28]. El rango de residuos final para cada sistema fue 300–585. Los extremos N y C de los modelos WT y R431W se neutralizaron mediante acetilación y N-metilamidación, respectivamente. Se asignaron estados de protonación predeterminados a cada residuo titulable según el análisis con PROPKA versión 3.0 [29]. El péptido WNK4 se eliminó de las simulaciones de producción debido a la disociación de KLHL3 después de las simulaciones de equilibrio iniciales.
Todas las simulaciones se realizaron utilizando el paquete de software GROMACS versión 2021 [30]. Se utilizaron parámetros del campo de fuerza CHARMM36m para átomos de proteínas [31]. Los iones se describieron utilizando parámetros CHARMM predeterminados y el modelo TIP3P se utilizó para aguas [32]. Se utilizó un paso de tiempo de integración de 1 fs para el paso de equilibrio inicial, y se utilizaron 2 fs para todas las simulaciones posteriores. Todos los enlaces que involucran hidrógeno se limitaron utilizando LINCS [33]. Las interacciones de Van der Waals no enlazadas se calcularon utilizando el potencial de Lennard-Jones con un radio de corte de 1,2 nm; Las fuerzas se desconectaron suavemente en el rango de 1,2 a 1,0 nm. Toda la electrostática se calculó utilizando el método de malla de partículas suavizada de Ewald [34] con una distancia de corte en el espacio real de 1,2 nm. Después de una simulación inicial en el conjunto isocórico-isotérmico (NVT), todas las simulaciones posteriores se realizaron en el conjunto isobárico-isotérmico (NPT) a una temperatura de 310,15 K utilizando el termostato de reescalamiento de velocidad [35] con una constante de tiempo de 0,5 ps. El termostato se aplicó por separado a la proteína y al disolvente (es decir, agua e iones); Se utilizaron los mismos grupos para la eliminación del movimiento del centro de masa (COM). Se impuso una presión de 1 bar usando un barostato Berendsen [36] o Parrinello-Rahman [37] de manera isotrópica con una constante de tiempo de 5 ps.
Los modelos WT y R431W se solvataron en una caja cúbica con dimensiones iniciales de 1,2 × 1,2 × 1,2 nm3. Cada sistema se neutralizó con NaCl 150 mM. Después de una minimización inicial de energía en el descenso más pronunciado, cada sistema se equilibró en el conjunto NVT durante 5 ns con restricciones de posición en todos los átomos de proteína. Se realizó un paso de equilibrio posterior en el conjunto NPT durante 5 ns con las mismas restricciones que en el paso anterior. Se eliminaron las restricciones de posición de todas las cadenas laterales para la simulación de equilibrio final 5-ns. Se generaron tres estructuras iniciales a partir de la etapa final de equilibrio para simulaciones de producción independientes de los sistemas WT y R431W con todas las restricciones de posición eliminadas. Cada réplica de producción se simuló durante 1,1 µs; los primeros 0,1 µs se eliminaron del análisis.
Para evaluar la estabilidad estructural durante el transcurso de las simulaciones, se calcularon las desviaciones cuadráticas medias (RMSD) de la estructura cristalina para los átomos de C de toda la proteína, así como la interfaz K3-K4 (residuos 425-465) y la Bolsillo de encuadernación WNK4- (residuos 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 y 577). Se calcularon los promedios móviles de las trazas de RMSD y se superpusieron con los datos sin procesar.
El efecto de la mutación sobre la estabilidad estructural se visualizó calculando la diferencia en las fluctuaciones cuadráticas medias de los átomos de la proteína C, promediadas sobre marcos y réplicas y mapeando la estructura de la proteína WT. Todas las visualizaciones de proteínas se generaron utilizando ChimeraX [38]. El efecto de la mutación R431W en la interfaz K3 (residuos 425–441) a K4 (residuos 442–465) se caracterizó mediante el análisis del enlace de hidrógeno (enlace H) y la distancia COM entre los dos grupos. Los enlaces H se evaluaron en cada cuadro utilizando la herramienta GROMACS gmx hbond, con límites de distancia y ángulo de 3,5 Å y 30 grados, respectivamente. Las distancias COM se evaluaron de manera similar en cada cuadro: las distribuciones de las distancias Hbonds y COM se visualizaron como gráficos de violín. Se calcularon promedios sobre trayectorias y réplicas.
La electrostática del bolsillo de unión WNK4-se calculó utilizando g_elpot [39]. El curso temporal del potencial electrostático en la bolsa de unión se evaluó definiendo un volumen esférico con un radio de 8 Å, centrado en el centro geométrico de los residuos que componen la bolsa de unión. Para evaluar la varianza en la electrostática, se calcularon los promedios de bloques 50-ns. La distribución del potencial electrostático dentro del bolsillo de unión para el mutante WT y R431W se visualizó como gráficos de violín, con promedios calculados sobre 50-ns bloques y trayectorias.
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