La estabilización simultánea del citoesqueleto de actina en múltiples células específicas de nefrona protege al riñón de diversas lesiones Ⅱ

La estabilización farmacológica de la actina cortical mediante dinamina mejora la IRA.

La pérdida del borde en cepillo de los túbulos renales debido al desmontaje de la corteza de actomiosina es una característica predominante de la IRA2,29. Un fármaco anticancerígeno ampliamente utilizado que a menudo provoca IRA es el cisplatino.30. Una consecuencia fundamental de la lesión por cisplatino en las células renales es un aumento en el nivel de especies reactivas de oxígeno (ROS).31. Además, los niveles elevados de ROS conducen a una disminución en la dinámica de la actina.32, que provoca la alteración de la membrana mitocondrial; esto másexacerba ROSproducción33,34. Por lo tanto, examinamos si la estimulación farmacológica de la dinamina'La capacidad de reticulación es suficiente.Fieficaz para contrarrestar la lesión inducida por cisplatino.

Como se vio antes de 35, el cisplatino disminuyó la altura de las células MDCK, el número de microvellosidades y la longitud, y afectó la polaridad celular sin afectar la endocitosis (Tabla 1, Figuras complementarias 7a-d). El análisis TEM sugirió que estos fenotipos podrían atribuirse a la pérdida de actina F inducida por cisplatino (Fig. 4a). La adición de Bis-T - 23 antes del cisplatino anuló sus efectos al estabilizar la corteza de actomiosina contra la lesión inducida por cisplatino (Fig. 4a-c). Se observaron fenotipos similares en porcinos.túbulo proximal del riñón(LLC-PK1) (Figura complementaria 8). En conjunto, estos datos proporcionan evidencia de que Bis-T-23 preserva la corteza de actomiosina del desmontaje inducido por cisplatino.

En un enfoque complementario fisiológicamente relevante36, Bis T-23 contrarrestó la capacidad del cisplatino para reducir la resistencia eléctrica transepitelial (TER) medida a través de la monocapa epitelial viva utilizando un sistema de cultivo Transwell (Fig. 4d). Dado que TER mide la integridad de las uniones estrechas en cultivos celulares, estos datos establecen aún más el efecto beneficioso de Bis-T-23 sobre la integridad de las células epiteliales tras una lesión.

HAGA CLIC AQUÍ PARA OBTENER CISTANCHE PARA ERC

Como la dinámica alterada de la actina puede mejorar aún más la producción de ROS, a continuación examinamos si la estabilización de la red de actina por Bis-T-23 puede contrarrestar el estrés oxidativo en las células dañadas por cisplatino. Elegimos evaluar el estado de los carbonilos de biomoléculas celulares, un biomarcador estable de daño oxidativo producido por altos niveles de ROS, utilizando nuestro sensor fluorescente TFCH37 recientemente desarrollado (Fig. 4e). De hecho, la adición de Bis-T -23 antes del cisplatino disminuyó parcialmente el aumento de la carbonilación inducido por el cisplatino (Fig. 4f). Se observaron tendencias similares con respecto a la carbonilación después del tratamiento con Bis-T-23 y el despolimerizador de actina LatA (Figura complementaria 9a). En conjunto, estos datos proporcionan evidencia de que la estabilización de las redes de actina puede contrarrestar el circuito de retroalimentación entre el estrés oxidativo y el estado de la actina en las células lesionadas.

Una rata ex vivomodelo de riñónA continuación se utilizó para visualizar la preservación impulsada por BisT-23-de la corteza de actomiosina en el borde en cepillo. El cisplatino indujo una pérdida significativa de la tinción de actina F en el borde en cepillo de los túbulos proximales (Fig. 4g). Recientemente se observó mediante imágenes intravirales una pérdida similar de actina F en el borde en cepillo tras la aparición de una lesión grave por isquemia-reperfusión38. El tratamiento previo con Bis-T-23 protegió parcialmente la pérdida de actina F inducida por cisplatino en el borde en cepillo de los túbulos renales (Fig. 4g), lo que demuestra aún más el efecto de Bis-T-23 sobre la actomiosina. corteza en la membrana apical de las células epiteliales renales. Como se observa en el cultivo celular, Bis-T-23 no afectó la endocitosis en los cortes de tejido (Figura complementaria 9b), lo que demuestra además que Bis-T-23 no afecta el papel de la dinamina en la endocitosis en pacientes renales. túbulos proximales.

Finalmente, examinamos el efecto renoprotector de Bis-T-23 en un modelo de ratón con IRA39 inducida por cisplatino. A los ratones BL6 se les inyectó Bis-T-23 o DMSO una vez al día comenzando 24 h antes de la inyección de cisplatino. Como se vio antes40, los niveles de creatinina sérica (SCr) y nitrógeno en orina en sangre (BUN) aumentaron significativamente 3 días después de la inyección de cisplatino (Fig. 4h). El DMSO exhibió una leve protección contra la reno como se vio antes41, debido a su capacidad de eliminación de oxidantes42. La administración diaria de Bis-T-23 superó al DMSO con respecto a la renoprotección (Fig. 4h). Como todos los animales fueron sacrificados el día 5 debido a la toxicidad sistémica del cisplatino (Figura complementaria 9c), no pudimos examinar los beneficios a largo plazo de Bis-T-23 enFunción del riñón. En conjunto, estos estudios demuestran de manera convincente que la preservación de la integridad de las células renales mediante la estabilización de la corteza de actomiosina en la membrana apical contrarresta la nefrotoxicidad inducida por el cisplatino.

La estabilización de las redes de actina contrarresta la IRA inducida por iohexol.

Si bien el mecanismo exacto de la IRA inducida por medio de contraste no está completamente descifrado, sigue siendo una causa principal de IRA adquirida en el hospital43. Fisiológicamente, el medio de contraste aumenta la carga osmótica, disminuye el flujo sanguíneo renal e induce constricción de la arteria renal44. A nivel celular, ROS es un actor fundamental en contraste con la AKI45 inducida por colorantes. Dado el papel de las ROS en la regulación del citoesqueleto de actina y nuestra hipótesis de que la estabilización de la corteza de actomiosina puede contrarrestar el daño oxidativo, examinamos los efectos de Bis-T-23 en una IRA inducida por iohexol y un tinte de contraste46.

Los efectos celulares del iohexol se examinaron en humanos.túbulo proximal del riñón(HK-2) celdas. Como se observó con el cisplatino, el iohexol indujo la pérdida de actina F, que estuvo acompañada por un aumento significativo en el nivel de moléculas carboniladas, una consecuencia irreversible de los niveles elevados de ROS (Fig. 5a, b). Ambos fenotipos fueron parcialmente contrarrestados por el tratamiento previo con Bis-T-23, estableciendo aún más la sinergia entre el estado del citoesqueleto de actina y el nivel de estrés oxidativo en estas células. Como complemento a los ensayos basados ​​en células, la administración diaria de Bis T-23 conservó la función renal según los niveles de Scr y BUN en ratones BL6 expuestos a tinte de contraste (Fig. 5c). También se observó una respuesta muy codiciada de mejora de la tasa de supervivencia en los animales que recibieron Bis-T-23 junto con el tinte de contraste (Fig. 5d).

Recientemente hemos demostrado que los niveles séricos elevados del receptor activador del plasminógeno de tipo uroquinasa soluble (suPAR) sensibilizan el riñón a la IRA inducida por iohexol47. A continuación, investigamos si la protección de las células tubulares mediada por dinamina también puede proporcionar renoprotección en ratones BL6 que expresan altos niveles de suPAR del tejido adiposo (suPAR-Tg)48. Como se esperaba47, los ratones suPAR-Tg mostraron una disminución en la función renal 24 a 48 h después de la inyección de iohexol (Fig. 5e). Por el contrario, los animales que recibieron una dosis diaria de Bis-T-23 exhibieronfunción renal significativamente mejora pesar del desafío del tinte de contraste (Fig. 5e). En particular, se observó una disminución significativa en la tasa de mortalidad en la cohorte de ratones que recibió Bis-T-23 (Fig. 5f). Como se anticipó, el grado de daño oxidativo (carbonilación de biomoléculas) en células HK-2 tratadas concomitantemente con Bis-T-23 fue significativamente menor que en las células que recibieron solo una combinación de suPAR e Iohexol (Fig. 9d).

Fig. 4 El agonista de la dinamina protege los túbulos renales de la lesión inducida por el cisplatino al estabilizar la corteza de actomiosina en la membrana apical. una imagen PR-EM de lamellipodio en células MDCK tratadas con DMSO (0.1%) o Bis-T-23 (5 µM, 0.1% DMSO) durante 1 h antes a la adición de cisplatino (35 µM) durante 23 h. La corteza de actomiosina estaba coloreada de amarillo. b Imágenes de mayor aumento de las regiones encuadradas en (a). Los distintos niveles de espesor están codificados por colores. Los paneles superior e inferior muestran redes formadas por filamentos más cortos y filamentos más largos, respectivamente. c Gráfico que representa la densidad de los filamentos de actina en el borde anterior (cuadro amarillo en (a); 18–20 áreas contadas). d Gráfico de barras que representa la resistencia eléctrica transepitelial relativa (%) en células MDCK vivas tratadas como se indica en (a), excepto para las concentraciones de cisplatino (50 µM) y Bis-T-23 (30 µM) (12 lecturas por muestra). Los datos se representan como media ± SEM (***P <0,001, ****P <0,0001, prueba t de dos colas no apareada). ns, no significativo. e Representación esquemática de la detección de carbonilación inducida por estrés oxidativo mediante el ensayo TFCH. f Imágenes que muestran los niveles de carbonilos de biomoléculas determinados por TFCH. Las células se trataron como se describe en (a) excepto por la concentración de cisplatino (5 µM). Barra de escala, 20 µm. Gráfico que muestra los niveles relativos de fluorescencia de TFCH asociados con carbonilos de biomoléculas por célula (puntos de datos (n)=83–116; cada punto representa la intensidad promedio de 4 a 9 células). g Ratarodajas de riñónTeñido con anticuerpo anti-actina.rodajas de riñónse incubaron en tampón, DMSO (0.1%) o Bis-T-23 (30 µM) durante 1 h antes de agregar cisplatino (200 µM) o tampón durante 8 h. Se ampliaron las regiones de cuadrados blancos. Barras de escala, 40 µm. Gráfico que muestra la intensidad de actina F en el borde en cepillo por túbulo (100-236). Para c, f, g, los datos se representan como media ± DE (los valores de P se informan en la Figura, ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey). h Gráficos de puntos de dispersión que muestran la IRA inducida por cisplatino determinada por el nivel de nitrógeno ureico en sangre (BUN) o creatinina sérica (SCr). A los animales se les inyectó DMSO (1%) o Bis-T-23 (20 mg/kg) (n=12, por condición para SCr; n=17, por condición para BUN) una vez al día comenzando 24 h antes de la inyección de cisplatino (15 mg/kg). Las mediciones se realizaron en los tiempos indicados. Los datos se representan como media ± SEM (los valores de P se informan en la Figura, prueba t de dos colas no apareada). ns, no significativo.

A diferencia de la lesión celular mediada por ROS causada por cisplatino e iohexol, suPAR promueve la lesión de las células tubulares en parte al aumentar la tasa de consumo de oxígeno (OCR)47. Para vincular el efecto fisiológico de Bis-T-23 en ratones transgénicos suPAR con su efecto sobre el metabolismo celular, examinamos si la estabilización de la red de actina a través de dinamina disminuye el OCR impulsado por suPAR. La OCR se midió en tiempo real en células HK-2 en condiciones basales y en respuesta a inyecciones secuenciales de inhibidores mitocondriales utilizando un analizador de flujo extracelular Seahorse XFe24 (Fig. 5g). La adición de un anticuerpo anti-suPAR o Bis-T -23 mejoró los aumentos impulsados ​​por suPAR en la respiración basal mitocondrial, la producción de ATP, la tasa máxima de respiración y la capacidad respiratoria libre (Fig. 5f). Estos datos demuestran los efectos positivos de Bis-T-23 sobre el metabolismo celular tras una lesión. En conjunto, estos estudios afirman aún más la viabilidad de proteger contra múltiples tipos de IRA y, por lo tanto, mejorar la tasa de supervivencia en modelos de roedores mediante dinamina como sustituto.

Estabilización simultánea de actina encélulas renales distintasAtenúa la lesión de la nefrona. Anteriormente hemos demostrado que la activación farmacológica de la polimerización de actina impulsada por dinamina restableció la estructura y función de los podocitos en diversos modelos murinos de CKD12. En este estudio, demostramos la capacidad de la dinamina para preservar la integridad de las células tubulares tras una lesión aguda mediante la reticulación del citoesqueleto de actina. En conjunto, estos conocimientos nos llevaron a imaginar la posibilidad de contrarrestar simultáneamente tanto la lesión glomerular como la tubular, dirigiéndonos farmacológicamente a la dinamina.

Para probar esta hipótesis, examinamos si Bis-T-23 podría retrasar la pérdida deFunción del riñónen el modelo de ratón del síndrome de Alport (AS). AS es una forma hereditaria deinsuficiencia renal progresivadebido a mutaciones en los genes COL4A3, COL4A4 o COL4A5 que juntos codifican el colágeno tipo IV, un componente importante de la membrana basal glomerular (GBM)49,50. Aunque el defecto principal en la EA es el borramiento de la apófisis del pie y la proteinuria.

Para probar esta hipótesis, examinamos si Bis-T-23 podría retrasar la pérdida deFunción del riñónen el modelo de ratón del síndrome de Alport (AS). AS es una forma hereditaria deinsuficiencia renal progresivadebido a mutaciones en los genes COL4A3, COL4A4 o COL4A5 que juntos codifican el colágeno tipo IV, un componente importante de la membrana basal glomerular (GBM)49,50. Aunque el defecto principal en la EA es el borramiento de la apófisis del pie y la proteinuria.

Discusión Desde la identificación de las interacciones directas dinamina-actina10, un creciente conjunto de evidencia establece que esta GTPasa es uno de los principales reguladores del citoesqueleto de actina en la célula. A diferencia de los ABP canónicos, los mecanismos por los cuales la dinamina influye en la actina son muy versátiles y específicos del tipo de célula. Esto se debe a la combinación de los múltiples estados de oligomerización de la dinamina y su capacidad para unirse a la actina F mediante dos sitios de unión diferentes. Las interacciones de actina F con anillos y hélices de dinamina a través de su PRD C-terminal dan como resultado haces e hiperhaces de actina, que se han implicado en la formación de filopodios56 y protuberancias de membrana durante la fusión de mioblastos28. Las interacciones entre el dominio medio de la dinamina y la actina F se han implicado en la regulación de las redes de actina en los lamellipodios26, la organización del citoesqueleto postsináptico y el desarrollo de la unión neuromuscular27, la rigidez del haz de actina en los endosomas durante la fusión de mioblastos25 y la formación de procesos podocitarios en los pies12. Si bien la formación de procesos en los pies está impulsada por la polimerización de actina estimulada por dinamina, este estudio sugiere que el mecanismo molecular por el cual la dinamina influye en estos otros procesos impulsados ​​por actina podría deberse en parte a su capacidad para entrecruzar la actina F en redes ramificadas. . Nuestro estudio actual amplía el papel de la formación de redes dependientes de dinamina para incluir la formación de la corteza de actomiosina en la membrana apical de las células epiteliales polarizadas y el establecimiento de la rigidez celular.

Discusión Desde la identificación de las interacciones directas dinamina-actina10, un creciente conjunto de evidencia establece que esta GTPasa es uno de los principales reguladores del citoesqueleto de actina en la célula. A diferencia de los ABP canónicos, los mecanismos por los cuales la dinamina influye en la actina son muy versátiles y específicos del tipo de célula. Esto se debe a la combinación de los múltiples estados de oligomerización de la dinamina y su capacidad para unirse a la actina F mediante dos sitios de unión diferentes. Las interacciones de actina F con anillos y hélices de dinamina a través de su PRD C-terminal dan como resultado haces e hiperhaces de actina, que se han implicado en la formación de filopodios56 y protuberancias de membrana durante la fusión de mioblastos28. Las interacciones entre el dominio medio de la dinamina y la actina F se han implicado en la regulación de las redes de actina en los lamellipodios26, la organización del citoesqueleto postsináptico y el desarrollo de la unión neuromuscular27, la rigidez del haz de actina en los endosomas durante la fusión de mioblastos25 y la formación de procesos podocitarios en los pies12. Si bien la formación de procesos en los pies está impulsada por la polimerización de actina estimulada por dinamina, este estudio sugiere que el mecanismo molecular por el cual la dinamina influye en estos otros procesos impulsados ​​por actina podría deberse en parte a su capacidad para entrecruzar la actina F en redes ramificadas. . Nuestro estudio actual amplía el papel de la formación de redes dependientes de dinamina para incluir la formación de la corteza de actomiosina en la membrana apical de las células epiteliales polarizadas y el establecimiento de la rigidez celular.

Está bien establecido queERC y IRA, aunque mecánicamente distintos, están estrechamente interconectados, y la IRA se reconoce como un factor de riesgo para el desarrollo y la progresión de la ERC 66. Hasta ahora, la IRA sigue siendo no farmacológica67. Esto es particularmente relevante a la luz de la actual pandemia de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), donde los pacientes hospitalizados con COVID-19 y un nivel plasmático elevado de suPAR desarrollan IRA a tasas alarmantes. Los niveles elevados de suPAR se han relacionado tanto con AKI47 como con CKD69, lo que refuerza aún más el vínculo molecular entre estos dosdistintas enfermedades renales. Por lo tanto, se vuelve cada vez más esencial desarrollar terapias que puedan proteger contra una serie de agresiones renales en múltiples tipos de células70. Aquí informamos el efecto renoprotector de un agonista de dinamina en un modelo genético de AS, que presenta daño tanto a los podocitos como a las células tubulares. Nuestro estudio establece un enfoque integral para desarrollar terapias novedosas que interactúen con la red de actina en múltiples tipos de células dentro de la nefrona y traten innumerablesenfermedades renalesindependientemente del sitio de la lesión.

Métodos Cultivo celular. Se cultivaron células MDCK (riñón canino Madin-Darby) (ATCC CCL-34) y células del conducto colector medular interno de ratón (mIMCD-3) (ATCC CRL-2123) en DMEM/F12 (ThermoFisher Scientific) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1X Antibiótico-Antimicótico (penicilina, estreptomicina y anfotericina B; Gibco). Se cultivaron células LLC-PK1 (Lilly Laboratories Cell-Porcine Kidney 1) (ATCC CL- 101) en DMEM con 4,5 g/l de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio (Corning), 10 % de FBS y antibiótico 1X. -Antimicótico. Se cultivaron células MDCK y LLC-PK1 durante ~ 24 h y ~ 72 h, respectivamente, antes de iniciar los experimentos. Hong Kong-2 (Riñón humano 2) se cultivaron células tubulares proximales (ATCC CRL-2190) en medio DMEM/Ham's F12 (Corning) que contenía 10 % de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina cuando se usaron para experimentos bioenergéticos. Para analizar el estado del citoesqueleto de actina y la carbonilación celular, se cultivaron células HK-2 en DMEM F-12 (ATCC) que contenía 10% de FBS, 1X antibiótico-antimicótico y 1X ITS (insulina, transferrina y selenito de sodio) suplemento de medio líquido (Sigma-Aldrich). Para establecer la línea celular de eliminación de dinamina 2 (Dyn2) (mIMCD Dyn2KD), las células se infectaron con lentivirus que portaban shRNA que codifica el gen DNM2 (5'CGGCCTAGTGGACATGACAATGAACTCGAGTTCATTGTCATGTC CACTAGGTTTTTG3')10 o shRNA codificado (Sigma-Aldrich) en medio completo que contenía polibreno (8 µg/ml). Después de 24 h, los medios se reemplazaron cada dos días con medios que contenían puromicina para seleccionar transfectantes estables. El alcance de la destrucción de Dyn2 se evaluó mediante transferencia Western. Todas las líneas celulares se cultivaron en cubreobjetos de vidrio recubiertos de colágeno.

Fig. 6 La activación farmacológica de la dinamina se dirige simultáneamente al citoesqueleto de actina en dos células distintas de la nefrona. A ratones Col4a3-/- se les inyectó DMSO (1%) o Bis-T-23 (20 mg/kg) una vez al día cuando tenían 42 días de edad (día 0). Se utilizó un número igual de ratones tratados con DMSO o Bis-T-23 (n=10 para ACR; n=8 para BUN). El diagrama de puntos de dispersión muestra el nivel de proteinuria (relación albúmina/creatinina, ACR) ylesión renaldeterminado por el nivel de BUN. Barras de error, media ± DE (los valores de P se informan en la Figura, prueba t de dos colas no apareada). b Se realizó la prueba Log-Rank (Mantel-cox) para analizar las curvas de supervivencia de los dos grupos de tratamiento. c Histopatología representativa del riñón determinada mediante tinción con ácido periódico de Schiff (PAS) y H&E en muestras obtenidas de ratones Col4a3 -/- descritos en (a). Los animales tenían 62 días (día 20 de tratamiento con Bis-T-23 o DMSO). La glomerulopatía en animales tratados con Col4a3-/- DMSO se caracterizó por una expansión mesangial observada en la tinción con PAS (flecha negra), un aumento de la celularidad y un aumento en el espacio de Bowman. Los cambios degenerativos en los túbulos incluyeron la formación de cilindros (*) y la presencia de esclerosis tubular. El tratamiento con Bis-T-23 durante 20 días conservó parcialmente la morfología de los glomérulos (expansión mesangial disminuida) y los túbulos (ausencia de cilindros). d Esquemas de la nefrona (imagen acreditada al Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas yEnfermedades renales, Institutos Nacionales de Salud) y el mecanismo implicado en la renoprotección regulada por dinamina. En las células epiteliales polarizadas de los túbulos renales, la dinamina establece la polaridad celular entrecruzando los filamentos de actina en redes (este estudio). La capacidad de la dinamina para entrecruzar filamentos en haces está implicada en la formación de microvellosidades. La lesión aguda aumenta la producción de ROS, altera el metabolismo celular y perturba la dinámica de la actina, lo que mejora aún más la producción de ROS y conduce a un daño oxidativo celular más pronunciado (carbonilación de biomoléculas). Un aumento en la capacidad de reticulación de la dinamina en la corteza de actomiosina preserva la integridad de las células tubulares, lo que las protege parcialmente del ataque oxidativo. Además, la dinamina es esencial para la estructura y función de los podocitos. La activación farmacológica de la dinamina restaura los procesos del pie al inducir la polimerización de actina. Nuestro estudio muestra que la activación farmacológica de la oligomerización de dinamina exhibe un doble efecto beneficioso sobre la nefrona al apuntar a dos mecanismos moleculares distintos: preservación de la integridad de los podocitos (polimerización de actina) y células tubulares renales (entrecruzamiento de filamentos de actina).

Referencias

1. Basile, DP, Anderson, MD y Sutton, TA Fisiopatología de la lesión renal aguda.compr. Fisiol. 2, 1303–1353 (2012).

2. Bonventre, JV y Yang, L. Fisiopatología celular de la lesión renal aguda isquémica.J.Clin. Invertir. 121, 4210–4221 (2011).

3. Campanale, JP, Sun, TY & Montell, DJ Desarrollo y dinámica de la polaridad celular de un vistazo.J. Ciencia celular. 130, 1201–1207 (2017).

4. Salbreux, G., Charras, G. & Paluch, E. Mecánica de la corteza de actina y morfogénesis celular.Tendencias Cell Biol. 22, 536–545 (2012). 

5. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, RS y Horwitz, AR La miosina II no muscular ocupa un lugar central en la adhesión y migración celular.Nat. Rev. Mol. Biol celular. 10, 778–790 (2009). 

6. Chugh, P. et al. La arquitectura de la corteza de actina regula la tensión de la superficie celular.Nat. Biol celular. 19, 689–697 (2017). 7. Nguyen, LT y Hirst, LS Polimorfismo de redes de actina F altamente entrecruzadas: sondeo de múltiples escalas de longitud.Física. Rev.E Stat. Física de materia blanda de Nonlin. 83, 031910 (2011).

Servicio de apoyo de Wecistanche: el mayor exportador de cistanche de China:

Correo electrónico:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Comercio:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop