Una estrategia novedosa para la detección de componentes activos en Cistanche tubulosa basada en el análisis de la relación espectro-efecto y la farmacología de red Ⅱ

3. Resultados y discusión

3.1. Huellas dactilares de HPLC

3.1.1. Validación del método

La validación del método HPLC mostró que la desviación estándar relativa (RSD) para la precisión, la reproducibilidad y la estabilidad del método fue inferior al 2,85 % para el área relativa del pico (n = 11) y 0,77 % para el tiempo de retención relativo (n = 11). La precisión de la misma solución de muestra apareció dentro del rango de 0.05–{{10}}.77 por ciento para el tiempo relativo y 0.28– 2,70 por ciento para el área relativa de los picos comunes. La reproducibilidad del experimento estuvo dentro del rango de 0.03–0.20 por ciento para el tiempo relativo y 0.23–2.59 por ciento para el área relativa de los picos comunes. La estabilidad de la muestra fue del 0,09 al 0,24 por ciento para el tiempo de retención relativo y del 0,75 al 2,85 por ciento para el área relativa de los picos comunes. Estos resultados indicaron que se cumplió la huella digital establecida. Las relaciones lineales para el ácido geniposídico,echinacósido, acteósido, tubulósido A, yisoactósidose muestran en la Tabla S4. El valor de R cuadrado fue 1.0000, lo que indica una buena linealidad. Los resultados de la recuperación de muestras mostraron que las recuperaciones promedio de ácido geniposídico, equinacósido,acteósido, tubulósido A, yisoactósidofueron 100,37 % , 103,59 % , 98,46 % , 100,81 % y 101,19 % , y la RSD para la recuperación de muestras fue inferior al 2,68 % .

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3.1.2. Área máxima (PA) y tiempo de retención relativo (RRT)

Las huellas dactilares de referencia y las huellas dactilares de HM, WE y HR de 11 lotes de C. tubulosa se presentan en la Figura 2. Once picos, que exhibieron una buena separación y resolución, se identificaron como picos comunes entre HM, WE y HR. Los cinco compuestos estándar se identificaron como ácido geniposídico (A2),echinacósido(A8),acteósido (A9), tubulósidoA (A10), yisoactósido(A11). El compuesto estándar,echinacósido, que estaba presente en todos los cromatogramas (tiempo de retención medio 12,86 min) con un área de pico adecuada y buena estabilidad, se seleccionó como pico de referencia y se utilizó para calcular los tiempos de retención relativos (RRT) de los otros diez picos comunes. Los RRT de estas diferentes formas están en el rango 0.16–1.51. El PA y el coeficiente de variación (porcentaje de CV) de estos picos comunes se enumeran en las tablas S5–S7. A partir de los datos, los valores porcentuales de CV para PA en varias formas son 25,78 por ciento -142,02 por ciento, 23,36 por ciento -150,38 por ciento y 28,91 por ciento -112,78 por ciento para HM, WE y HR, respectivamente. Estos resultados revelan diferencias significativas en la concentración de cadaCistanche tubulosacompuesto entre las diferentes formas. Las huellas dactilares de HM, WE y HR se muestran en la Figura 3.

Figura 2 Huellas dactilares de HPLC de muestras estándar

3.1.3. Contenido de HM, WE y HR

Cinco constituyentes estándar deC. tubulosase midieron. El contenido de los componentes principales se muestra en la Tabla 1. La comparación entre HM, WE y HR se muestra en la Tabla 2 y la Figura 4. Las PhG en C. tubulosa son biológicamente activas pero termosensibles. Los componentes sensibles al calor que se disuelven en agua se pueden extraer de manera eficiente utilizando un método razonable. Generalmente, Cistanche herba se extrae con agua y luego se evapora en una solución concentrada para el siguiente análisis químico [26, 27, 30]. Después de la extracción y concentración, se utilizó la tecnología de secado por aspersión y se modificó el procedimiento del artículo anterior. El agua se eliminó rápidamente del vapor líquido y luego se obtuvieron extractos secos de materias primas de las plantas. En este paso, la adición de maltodextrina se considera un vehículo común para mejorar la dispersión y prolongar el tiempo de almacenamiento. A través de una serie de procesos de fabricación, las plantas herbales se prensaron luego en gránulos de fórmula con aditivos. Este paso de agregar excipientes no se incluyó en el experimento. En términos generales, nuestro proceso de producción incluye extracción, concentración y secado por aspersión, como se describe en la Sección 2.2, en paralelo con un proceso de producción de gránulos de fórmula. Para producir estos productos semielaborados, se deben seguir los tres pasos anteriores. El procedimiento de formación de WE implica concentración y secado por aspersión, lo que provoca fácilmente la pérdida de componentes termosensibles, pero los HR se obtienen después de la extracción y el secado de los HM. Nos preguntamos si es posible que los componentes activos permanezcan en los HR. De acuerdo con nuestros resultados, el contenido de verbascósido se redujo significativamente de HM a WE y HR ( y , respectivamente). La estabilidad térmica del verbascósido se investiga controlando los cambios en el área del pico a través de HPLC durante el proceso de calentamiento. Después de calentar durante 4 h, queda 41,6 por ciento de verbascoside. Indica que el verbascósido es termosensible [31]. El isoactósido, el tubulosido A y el equinacósido en los WE se mantuvieron estables después de procedimientos de procesamiento complejos. Durante el proceso de secado a largo plazo, la acumulación de PhG mostró una disminución significativa, lo que podría atribuirse a la degradación térmica de estos componentes termosensibles [32]. En términos de los otros componentes objetivo, los HR y los WE no difirieron significativamente, excepto para el verbascósido. Nuestra comprensión de esta diferencia nos permitirá desarrollar mejores estándares de calidad para las heces de hierbas en el futuro y convertirlas en productos.

Cuadro 1 Contenido de 11 lotes de C. tubulosa

Tabla 2 Comparación de contenidos de componentes principales (n = 11).

,

Figura 4 Determinación del contenido de cinco componentes de diferentes formas (n = 11). , ns: no significativo.

3.1.4. Análisis de similitud de huellas dactilares

Se evaluaron las similitudes entre los tres grupos de C. tubulosa. Los valores de similitud de material herbario-extracto de agua, material herbario-residuo herbario y extracto de agua-residuo herbario estuvieron en los rangos 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995 y 0.938–1.000, respectivamente (Tabla 3).

Tabla 3 Similitudes de HM-WE, HM-HR y WE-HR para 11 lotes de C. tubulosa.

3.2. Resultados de la prueba de actividad antioxidante

Las actividades antioxidantes de las diversas formas de C. tubulosa se determinaron utilizando los ensayos de DPPH y capacidad depuradora, y los resultados relevantes se presentan en la Figura 5. En la Tabla S8, los rangos para los resultados de los ensayos de capacidad depuradora y DPPH fueron { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 y 0,32–27,65 mg/mL para las tres formas diferentes entre los 11 lotes de C. tubulosa. En tres pruebas de actividad antioxidante, los HM y los WE exhibieron una actividad de inhibición cercana, mientras que los HR mostraron la inhibición más débil.

Se encontró que los WE secados por aspersión exhibían actividades significativas incluso a bajas concentraciones. Un informe anterior indicó que Vernonia amygdalina WE secada por aspersión logró una inhibición de eliminación del 50 por ciento a 0,17 mg/mL [33]. La aplicación de largos tiempos de extracción y altas temperaturas es un arma de doble filo. Por un lado, aumentar el tiempo de extracción y la temperatura de entrada del secado por atomización mejora el rendimiento y la eficiencia. Además, los extractos logran una fuerte actividad antioxidante y concentraciones más altas de componentes biológicos que esas plantas [34]. Por otro lado, el aire de entrada excesivamente caliente degrada los compuestos bioactivos. Tales temperaturas elevadas de entrada de aire condujeron a pérdidas de la actividad del extracto antioxidante de Bidens pilosa y se atribuyeron a disminuciones en los compuestos fenólicos [35]. Los presentes resultados son consistentes con el informe antes mencionado. Por ejemplo, WE en S6 exhibió capacidades inhibidoras de radicales más débiles que HM y HR. Además, HR en S5 exhibió capacidades de eliminación de aniones superóxido y DPPH más fuertes que HM y WE. La estructura de las PhG consiste en enlaces glucosídicos y grupos acetilo que se hidrolizan fácilmente bajo la acción enzimática o se descomponen a altas temperaturas. Estas reacciones pueden explicar la disminución de algunos componentes principales durante la producción a gran escala. Sin embargo, la hidrólisis o isomerización de ciertos componentes podría acelerar la síntesis de otros componentes. Tales transformaciones son comunes cuando se procesan hierbas Cistanches [36–38]. El hecho de que los PhG sean solubles en agua implica que la mayoría de los componentes biológicos se pueden utilizar a través de la extracción con agua. La afirmación de que la mayoría de los componentes activos permanecen en los WE ha persistido durante décadas, por lo que parece razonable suponer que los materiales residuales húmedos se pueden desechar después de la extracción. Sin embargo, es incorrecto considerar los HR de C. tubulosa como desechos. Los investigadores señalan que las PhG son inestables y susceptibles a la degradación enzimática o hidrolítica [39]. Las reacciones de hidrólisis o isomerización que contribuyen a la disminución de los ingredientes biológicos dentro de los fitomedicamentos durante el procesamiento podrían presentar al mismo tiempo nuevas oportunidades para explotar los recursos humanos. Al convertir los métodos de extracción tradicionales, los residuos medicinales se pueden desarrollar y utilizar de manera más efectiva. Se realizó hidrólisis enzimática para convertir el residuo de Panax ginseng en monoazúcares. Los rendimientos de polisacáridos y ginsenósidos aumentaron, como azúcar, ácido succínico, polisacáridos de ginseng y ginsenósidos [40]. Los residuos de Sophora flavescens se vuelven a extraer mediante ondas ultrasónicas con acetato de etilo [41]. Las tecnologías actualizadas para la utilización de residuos de hierbas están resumidas por Huang et al. [42].

En función de los resultados de PLSR y BCA, los cinco picos principales de diferentes formas se seleccionaron mediante los ensayos de eliminación de radicales hidroxilo, anión superóxido y DPPH para identificar los picos más importantes. Los resultados se ilustran en el diagrama de Venn (Figura 7). A2, A6, A8 y A10 son los picos comunes que comparten HM, WE y HR (Figuras 7(a) y 7(c)) en los ensayos de captación de radicales hidroxilo y anión superóxido, mientras que HM, WE y HR no comparte picos de ensayo DPPH. Mientras tanto, los modelos BCA muestran que A1, A2, A3 y A6 son los picos comunes compartidos por HM, WE y HR (Figuras 7(d)–7(f)). En particular, las superposiciones en el diagrama de Venn indican que el modelo BCA parece más adecuado que el modelo PLSR, exhibiendo el primero más repeticiones. Los coeficientes del modelo BCA y los valores IC50 de la capacidad antioxidante se analizaron a través de RDA. Como se muestra en la RDA de la Figura 8, A1, A3 y A6 de HM y HR se relacionan positivamente con los índices de antioxidantes, excepto que A3 se relaciona negativamente con la capacidad de captación de radicales hidroxilo. A1 y A6 de WE tienen fuertes correlaciones con DPPH y el anión superóxido. Los picos A6 observados en las diversas formas exhiben la conexión más fuerte con los radicales DPPH, anión superóxido e hidroxilo. A1 y A3 también exhiben una conexión similar.

Figura 7

Diagramas de Venn del modelo PLSR y BCA: (a) ensayo DPPH. (b) ensayo de barrido. ( c ) el ensayo de eliminación se analizó mediante el modelo PLSR. ( d ) ensayo DPPH. (e) ensayo de barrido. ( f ) el ensayo de eliminación se analizó mediante el modelo BCA. La sección superpuesta era el fragmento de picos común de HM, WE y HR.

3.4. Análisis basado en farmacología de red

3.4.1. Construcción de Red CT

Se obtuvieron un total de 4359 objetivos relacionados con la actividad antioxidante de la base de datos GeneCards y la base de datos OMIM. Al mismo tiempo, se examinaron los componentes activos de la base de datos TCMSP y la base de datos SwissTargetPrediction. Luego, 198 objetivos fueron recolectados y estandarizados a través de la base de datos UniPort. Había 159 genes diana compartidos por componentes activos y enfermedades relacionadas con los antioxidantes (ver Figura S1). La red CT se construyó para ilustrar la correlación entre los compuestos y los objetivos genéticos clave (Figura 9).

Figura 9 Red de TC. La red mostró la correlación entre los componentes activos y los objetivos genéticos clave.

3.4.2. Construcción de la Red PPI y Screening de Targets Clave

El PPI se visualizó usando la base de datos STRING (Figura 10). La red incluía 159 nodos y 2528 bordes. En toda la red de interacción, los componentes de conexión o los nodos con más puntos objetivo pueden ser el componente clave o el gen objetivo que desempeña un papel antioxidante en C. tubulosa. Los resultados se descargaron e introdujeron en Cytoscape para su visualización. Cuanto mayor sea el valor de DC, más oscuro será el color y cuanto mayor sea el valor de la puntuación combinada, más grueso será el borde. Encontramos que RAC-alfa serina/treonina-proteína quinasa (AKT1), interluquina-6 (IL6), factor de necrosis tumoral (TNF) y factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA) estaban ubicados centralmente (Figura 11), lo que indica que eran objetivos clave cuando los componentes activos ejercían un efecto antioxidante. Se informa que el equinacósido reduce la disfunción mitocondrial a través de la regulación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y AKT y sus formas fosforiladas [43]. Los investigadores especularon que el efecto antidiabético de los glucósidos de C. tubulosa podría deberse a la actividad antioxidante de las PhG al regular a la baja las citocinas proinflamatorias, como IL-6 y TNF- [44]. Además, el equinacósido podría afectar el crecimiento de las células de cáncer de ovario al regular a la baja la expresión de VEGFA para inhibir la angiogénesis [45], que está estrechamente relacionado con el sistema ROS porque ROS induce la expresión de la señalización de VEGF [46].

Figura 10 Red PPI.

3.4.3. Análisis de enriquecimiento y establecimiento de redes CTP

Los compuestos antioxidantes potenciales actuaron sobre numerosas funciones biológicas, incluidas BP, CC y MF. En la Figura 12(a), se muestran las 10 rutas principales. Los objetivos predichos de la red PPI respondieron principalmente a muchos procesos biológicos, como compuestos orgánicos cíclicos, estímulos xenobióticos, sustancias inorgánicas, niveles de oxígeno y regulación positiva del movimiento de componentes celulares. El análisis de componentes celulares mostró que los genes estaban relacionados principalmente con la balsa de membrana, la matriz extracelular, la luz del gránulo secretor, el complejo regulador de la transcripción y la parte apical de la célula. Estos objetivos también están involucrados en muchas funciones moleculares, incluida la unión del factor de transcripción de unión al ADN, la actividad de homodimerización de proteínas, la unión específica del dominio de la proteína y la unión del receptor de citoquinas.

Figura 12 Análisis de enriquecimiento: (a) Análisis de enriquecimiento GO. (b) Análisis de enriquecimiento KEGG.

Para investigar las funciones biológicas de estos centros principales, se realizó un análisis de enriquecimiento de rutas. A partir de los resultados del enriquecimiento de KEGG, se dibujó un diagrama de burbujas para mostrar las 20 vías principales. Cuanto más grande era la mancha, más genes se incluían en la vía. Como se muestra en la Figura 12(b), las vías clave de C. tubulosa estaban relacionadas con vías en cáncer, lípidos y aterosclerosis, vía de señalización AGE-RAGE en complicaciones diabéticas, carcinogénesis química: activación del receptor y vía de señalización MAPK. Se investigaron los efectos de C. tubulosa sobre la apoptosis y la homeostasis redox celular. Los datos sugieren que C. tubulosa puede ser un candidato prometedor para la terapia contra el cáncer de colon [47]. El extracto de C. deserticola se encuentra en personas de edad avanzada [48].

La Figura 13 ilustra la correlación entre las vías y sus dianas relacionadas y la relación entre los genes diana superpuestos y los componentes biológicamente activos de C. tubulosa. Se generó una visión global de la red CTP, que constaba de 12 ingredientes, 159 objetivos y 20 vías. La mayoría de los objetivos fueron compartidos por los compuestos activos candidatos. Estos ingredientes activos candidatos con altos grados de interconexión fueron los responsables de la alta interconexión de la red CTP, especialmente la quercetina (grado = 131). La mayoría de los objetivos, como AKT1, IL6, TNF y VEGFA, se asignaron a vías KEGG asociadas con vías en cáncer.

Figura 13 Red CTP.

4. Conclusiones

En este estudio, probamos principalmente situaciones complejas al considerar las relaciones de efecto de espectro entre HM, WE y HR deC. tubulosa. Las huellas dactilares de HPLC yensayos antioxidantesse utilizaron para identificar las diferencias entre Hs, WEs y HRs deC. tubulosa. Según las huellas dactilares de HPLC, 11 picos eran comunes entre los 11 lotes de Hs, WEs y HRs. ácido genipósido,echinacósido, verbascoside, tubulósido A, yisoactósidofueron identificados entre estos picos. Se determinaron los contenidos de estos cinco componentes. Además, los efectos antioxidantes de laC. tubulosaHs, WEs y HRs variaron debido a las alteraciones en las composiciones químicas causadas por las complejas condiciones de fabricación. Basado en modelos estadísticos diversificados, el estudio de la relación espectro-efecto indicó que el pico A6 podría ser el componente más decisivo entre las tres formas deC. tubulosa. El estudio se basó en la farmacología de red para explorar posibles mecanismos deC. tubulosaenantioxidacionmediante la detección de compuestos, la predicción de objetivos clave, la construcción de redes y la realización de análisis de enriquecimiento. Nuestros resultados proporcionan una base teórica para reciclar los residuos de hierbas y el potencial deC. tubulosaen el tratamiento deenfermedades relacionadas con los antioxidantes.