ACKR4a induce la autofagia para bloquear la señalización y la apoptosis de NF-kB para facilitar la infección por Vibrio Harveyi

RESUMEN

La autofagia y la apoptosis son dos mecanismos reconocidos de resistencia a la invasión bacteriana. Sin embargo, las bacterias también han desarrollado la capacidad de evadir la inmunidad. En este estudio, identificamos ACKR4a, un miembro de una familia de receptores de quimiocinas atípicos, como un supresor de la vía NF-kB, que coopera con Beclin-1 para inducir la autofagia para inhibir la señalización de NF-kB y bloquear la apoptosis, facilitando Infección por Vibrio harveyi. Mecánicamente, Ap-1 inducido por V. harveyi activa la transcripción y expresión de ACKR4a. ACKR4a forma un complejo con Beclin-1 y MyD88, respectivamente, lo que induce la autofagia y transporta MyD88 al lisosoma para su degradación y supresión de la producción de citocinas inflamatorias. Mientras tanto, la autofagia inducida por ACKR4a bloquea la apoptosis al inhibir la caspasa8. Este estudio demuestra por primera vez que V. harveyi utiliza tanto la autofagia como la apoptosis para evadir la inmunidad innata, lo que sugiere que V. harveyi ha desarrollado la capacidad contra la inmunidad de los peces. 

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INTRODUCCIÓN

El sistema inmunológico generalmente se divide en inmunidad innata y adquirida, y la mayoría de los organismos dependen principalmente de la inmunidad innata para sobrevivir.1 La inmunidad innata es un mecanismo de defensa formado en los organismos. Reconoce el patrón molecular asociado a patógenos (PAMP) a través de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR), genera una respuesta rápida a la infección patógena y protege al huésped de la infección.2,3 Como PRR importante, los receptores tipo peaje (TLR) puede iniciar una amplia gama de respuestas, desde la fagocitosis hasta la producción de citoquinas, mejorando así aún más las respuestas inflamatorias e inmunes innatas.4 En la mayoría de los casos, los TLR envían señales principalmente a través de una vía dependiente de MyD88-, que transmite señales a través de reacciones en cascada para activar las células nucleares. factor kappa B (NF-kB).5 NF-kB es uno de los factores clave en el inicio de la inmunidad innata y es esencial para la coordinación de la respuesta inflamatoria, la inmunidad innata, la diferenciación celular, la proliferación y la supervivencia, y es Se considera el principal iniciador de la respuesta inflamatoria.6 Cuando las bacterias infectan al huésped, se sintetizan efectores posteriores de la respuesta inmune innata, como citocinas y quimiocinas, que en última instancia conducen a una respuesta inflamatoria para bloquear el crecimiento de las bacterias. Sin embargo, en coevolución con sus huéspedes, las bacterias también han desarrollado varias estrategias regulatorias para evadir y subvertir las defensas de sus huéspedes.

Se cree que la autofagia y la apoptosis son dos vías importantes contra la invasión bacteriana.7 La autofagia es un proceso conservador que transporta proteínas anormales a los lisosomas para su degradación y desempeña un papel importante en la inmunidad innata de los eucariotas contra la invasión bacteriana.8,9 Sin embargo, algunos Las bacterias evaden la inmunidad mediante el uso de la autofagia en los mamíferos. Normalmente, las células intentan eliminar las bacterias extracelulares invasoras y las bacterias colonizadoras en el citoplasma mediante la autofagia,10 pero algunas bacterias pueden "secuestrar" la autofagia para completar el autocrecimiento y la reproducción.11–13 Por ejemplo, la Unc-51-como la quinasa 1 (ULK1), Beclin1, la cadena ligera 3 de la proteína asociada a microtúbulos (LC3) y las proteínas relacionadas con la autofagia (ATG) cooperan para formar autofagosomas, que encapsulan los microorganismos invasores y los transportan a los lisosomas para su degradación.14–16 Sin embargo, Mycobacterium tuberculosis disminuye -regula Beclin-1 para prevenir la formación de autofagosomas, lo que en última instancia inhibe la autofagia y promueve la infección.17 En contraste con la inhibición de la formación de autofagosomas, algunas bacterias usan autofagosomas para completar sitios de autorreplicación para promover la proliferación.11,18 En la autofagia, la apoptosis también es un medio de defensa del huésped contra patógenos invasores.7 La apoptosis es un patrón de muerte celular utilizado para eliminar las células dañadas para mantener la estabilidad del entorno sistémico.19 Al recibir una señal de invasión bacteriana, el huésped induce la apoptosis de las bacterias infectadas. células para inhibir la infección bacteriana.20 Por lo tanto, la colonización bacteriana exitosa depende de su capacidad para prevenir la apoptosis y proteger la replicación bacteriana. Por ejemplo, Edwardsiella tarda asegura su supervivencia al inhibir la apoptosis después de la infección de las células ZF4 del pez cebra,21 Shigella logra una colonización exitosa al inhibir la apoptosis,22 y la proteína S producida por el estreptococo del grupo A (GAS) se une a la membrana de los eritrocitos para evadir la detección del sistema inmunológico del huésped. sistema.23 Aunque se ha demostrado que muchas bacterias han desarrollado la capacidad de evadir la inmunidad, hay algunos informes sobre patógenos marinos. Vibrio harveyi pertenece a la familia Vibrionaceae, la cual es reconocida como un agente altamente patógeno de peces marinos; causa gastroenteritis, necrosis muscular y úlceras cutáneas, y es una de las principales causas de mortalidad de peces marinos.24

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Excepto por la autofagia y la apoptosis, algunas bacterias (p. ej., Staphylococcus aureus) pueden incluso utilizar los receptores de quimiocinas de su huésped para evadir la inmunidad.25 Los receptores de quimiocinas son receptores acoplados a proteína G (GPCR) que se encuentran principalmente en la superficie de los leucocitos. Contienen siete estructuras transmembrana, que participan en la unión y señalización de ligandos, y desempeñan un papel clave en el inicio y mantenimiento de respuestas inmunitarias e inflamatorias.26 A medida que avanzaba la investigación sobre quimiocinas, se descubrieron receptores de quimiocinas atípicos (ACKR).27 Aunque los ACKR son estructuralmente similares a otros receptores de quimiocinas y pueden internalizar ligandos, no pueden activar la vía de transducción de señales debido a la falta del dominio DRYLAIV, que también se llama "receptor silencioso".28 La función de los ACKR puede reflejarse de las siguientes maneras : 1. Pueden competir con receptores típicos para unirse a quimiocinas y, por lo tanto, regular la transducción de señales de la quimiotaxis celular; 2. Al internalizar las quimiocinas en las células, la concentración de quimiocinas en el medio ambiente se reduce para afectar el reclutamiento celular y actuar como eliminador de quimiocinas. 3. Ayudan a las quimiocinas a completar el transporte entre células a través de la barrera de las células estromales.29 La familia ACKR incluye principalmente DARC,30 D6 31,32, CXCR7,33 y CCRL1,34 CCRL1 también se conoce como receptor de quimiocinas atípico. 4 (ACKR4). En la actualidad, algunos estudios han demostrado que ACKR4 parece realizar la transducción de señales a través de la vía independiente de la proteína G,35–37 y tiene funciones no redundantes en el control de la inflamación y la respuesta inmune.38 Su papel en la inmunidad adaptativa es bien conocido, pero su Rara vez se estudia su función en la inmunidad innata.

En la inmunidad innata, la transducción de señales de la vía TLR está altamente conservada desde los invertebrados hasta los mamíferos. Como proteína central de la señalización de TLR, MyD88 se ha estudiado ampliamente en vertebrados. Además, debido a la estructura altamente conservada de MyD88, sus homólogos en peces pueden tener funciones similares a las de los mamíferos.39,40 En el pez cebra, MyD88 participa en la eliminación de infecciones bacterianas.41 Estudios anteriores también han confirmado que V. harveyi evade la inmunidad al destruir la transducción de señales de MyD88.42 Sin embargo, los mecanismos por los que V. harveyi evade la inmunidad siguen siendo poco conocidos en los peces teleósteos. En este estudio, ACKR4a se reguló rápidamente en Miichthys muy estimulado por V. harveyi. El ACKR4a regulado positivamente suprimió la inmunidad innata al inducir la autofagia para bloquear la vía NF-kB mediada por MyD88- e inducir la autofagia para bloquear la apoptosis, para mejorar la infección por V. harveyi. Hasta donde sabemos, este informe es el primero en dilucidar que se ha descubierto que V. harveyi utiliza tanto la autofagia como la apoptosis para evadir la inmunidad innata.

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RESULTADOS

La infección por V. harveyi induce la expresión de ACKR4a para promover la autoproliferación

Para identificar genes que están potencialmente involucrados en la regulación de la infección por V. harveyi, tratamos miiuy corvina con V. harveyi durante 48 h, luego usamos análisis de secuencia de ARN para detectar los diferentes genes de expresión (DEG) entre V. harveyi tratados y no tratados. muestras de bazo. A partir de los datos de secuenciación profunda, identificamos 145 genes regulados positivamente y 280 genes regulados negativamente (Figura 1A). Sobre esta base, seleccionamos los 10 DEG más grandes y los 10 menores (log2 del cambio de veces fue 1,0) para agrupar el mapa de calor, y el resultado mostró que las muestras respectivas tanto en las muestras tratadas como en las no tratadas con V. harveyi estaban bien replicadas (Figura 1B). . Se examinaron los ARNm de ACKR4a y se descubrió que estaban altamente expresados ​​en el cerebro musical M después de la infección por V. harveyi (Figura S1A). Por tanto, se utilizó la línea de células cerebrales M. muiiy (MBrC) para experimentos posteriores. La eficiencia de eliminación de ACKR4a-si1 es del 46,1 % y de ACKR4a-si2 es del 63,7 % en MBrC (Figura S1B), por lo que se utilizó ACKR4a-si2 (llamado ACKR4a-si) para experimentos posteriores. Posteriormente, nos centramos en el gen ACKR4a, que puede tener una función inmune, y los resultados del ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC) revelaron que ACKR4a promovió la proliferación de V. harveyi (Figuras 1C, 1D y S1C). Para investigar más a fondo el mecanismo por el cual ACKR4a promueve la proliferación de V. harveyi, se analizó el patrón de expresión de ACKR4a. ACKR4a en células MBrC fue regulado por V. harveyi. Los resultados mostraron una forma dependiente del tiempo con la infección por V. harveyi tanto a nivel de ARNm como de proteína (Figuras 1E y 1F). Además, el silenciamiento de ACKR4a suprimió eficazmente la expresión de ACKR4a tanto a nivel de ARNm como de proteína (Figuras 1E y 1G). Los resultados anteriores indicaron que la regulación positiva de ACKR4a puede facilitar la infección por V. harveyi.

Figura 1. ACKR4a inducida por V. harveyi facilita su autoproliferación

ACKR4a inhibe la señalización de NF-kB activada por V. harveyi 

Descubrimos que la tasa de proliferación celular se vio afectada cuando MBrC se infectó con V. harveyi y, para verificar este hallazgo, realizamos ensayos de proliferación celular. Los resultados mostraron que la infección por V. harveyi redujo la proliferación de MBrC (Figura S1D). Experimentos posteriores han confirmado que la sobreexpresión de ACKR4a redujo la proliferación celular, mientras que el silenciamiento de ACKR4a mejoró la proliferación celular (Figura 2A y S1E). Varios estudios han demostrado que la activación de NF-kB promueve la proliferación celular. Se descubrió que BAY 11–7082, el inhibidor de NF-kB, también podría reducir la proliferación de MBrC (Figura 2A y S1E). Al igual que en informes anteriores,43 el aumento de NF-kB-luc se asoció con la infección por V. harveyi de manera dependiente del tiempo (Figura S1F).

Figura 2. ACKR4a inhibe la señalización de NF-kB activada por V. harveyi

Para determinar más a fondo el efecto de ACKR4a sobre la señalización de NF-kB activada por V. harveyi, se realizó un ensayo indicador de luciferasa. ACKR4a inhibió significativamente la actividad luciferasa NF-kB desencadenada por V. harveyi y LPS; ACKR4a también inhibió la actividad de IL-1b y TNFa luciferasa activada por V. harveyi (Figuras 2B-2D). El ACKR4a endógeno fue silenciado para validar su papel en la inmunidad innata. Luego se detectaron aún más los patrones de expresión de p65 y las citocinas proinflamatorias (IL-1b y TNFa), y el silenciamiento de ACKR4a aumentó drásticamente los ARNm de p65, los ARNm de IL-1b y los ARNm de TNFa (Figuras 2E-2G). ). Los resultados en MLC y MKC también indicaron que ACKR4a podría inhibir la señalización de NF-kB (Figuras S1G-S1J). Los resultados de ELISA también fueron similares; El silenciamiento de ACKR4a aumentó significativamente el TNFa y la sobreexpresión de ACKR4a inhibió el TNFa (Figura 2H). Para evaluar la activación de NF-kB, es más necesario analizar la forma transliterada, es decir, NF-kB fosforilada, y es una medida de la actividad de NF-kB en genes diana. Tras la estimulación de NF-kB, p65 se fosforila y ingresa al núcleo para regular la transcripción de citoquinas proinflamatorias. Para explorar la regulación de la fosforilación de p65 por ACKR4a, medimos el nivel de fosforilación de p65 después del silenciamiento de ACKR4a y la sobreexpresión de ACKR4a mediante inmunotransferencia. La infección por V. harveyi mejoró la fosforilación de p65, lo que demostró que V. harveyi activaba eficazmente NF-kB. Sobre esta base, el silenciamiento de ACKR4a mejoró la fosforilación de p65, mientras que la sobreexpresión de ACKR4a disminuyó la fosforilación de p65, lo que indica que ACKR4a es un inhibidor de la señalización de NF-kB (Figuras 2I y 2J). En el pez cebra, la eliminación de ACKR4a aumentó la fosforilación de p65. Además, el ensayo de UFC mostró que BAY 11–7082 aumentó significativamente la proliferación de MBrC (Figura 2K). En general, estos datos sugieren que ACKR4a funciona como un regulador negativo de la señalización de NF-kB para inhibir la inmunidad innata durante la infección por V. harveyi.

Figura 3. ACKR4a interactúa con MyD88 y promueve la degradación de MyD88 en autofagia

ACKR4a interactúa con MyD88 y promueve MyD88 para la degradación autofágica

A continuación, intentamos determinar qué objetivo en la señalización de NF-kB media la función supresora de ACKR4a0. El ensayo indicador de NF-kB-luciferasa reveló que la sobreexpresión de ACKR4a provocó una reducción de la actividad de la luciferasa, que fue inducida por MyD88 de una manera dependiente de la dosis (Figura 3A). Sin embargo, la sobreexpresión de ACKR4a no mostró ningún efecto sobre la actividad luciferasa impulsada por TRAF6 o TAK1 (Figuras 3B y 3C). El resultado de la inmunotransferencia fue similar al ensayo indicador de luciferasa; la sobreexpresión de ACKR4a inhibió MyD88 de una manera dependiente de la dosis, pero no hubo efecto sobre TRAF6 y TAK1 (Figura 3D). Estos resultados sugieren que ACKR4a funciona en el nivel MyD88.

Todos los TLR de mamíferos, excepto el TLR3, dependen al menos en parte del adaptador MyD88 para transmitir señales, lo que hace que la regulación directa de MyD88 sea más efectiva.44 Luego examinamos la expresión de MyD88 en diferentes momentos de la infección por V. harveyi y encontramos silenciamiento de ACKR4a. mejoró la expresión de MyD88 (Figura 3E), y la sobreexpresión de ACKR4a inhibió la expresión de MyD88 de una manera dependiente del tiempo (Figura 3F). Se encontró un resultado interesante: aunque el silenciamiento de ACKR4a mejoró la expresión de MyD88 desencadenada por V. harveyi, esta mejora no estaba presente cuando las células estaban en reposo (Figuras 3G y 3H). Para comprender mejor el mecanismo molecular subyacente a la acción de ACKR4a en la señalización de NF-kB mediada por MyD88-, llevamos a cabo ensayos de co-inmunoprecipitación (Co-IP) para determinar si ACKR4a interactúa con MyD88. Flag-ACKR4a podría inmunoprecipitar con Myc-MyD88 (Figuras 3I y S1K). De acuerdo con eso, encontramos que Flag-MyD88 podría interactuar con ACKR4a endógeno (Figura 3J). Los experimentos posteriores de localización subcelular mostraron que ACKR4a no tenía una co-localización significativa con MyD88 (Figura S1L). Por lo tanto, estos hallazgos respaldan el concepto de que ACKR4a interactúa físicamente con MyD88 y que su interacción probablemente ocurre en el citoplasma. A continuación, investigamos el mecanismo por el cual ACKR4a suprimió la expresión de MyD88. Tanto el NH4Cl como la 3-metiladenina (3-MA), inhibidores de la vía de degradación dependiente de la autofagia-lisosoma, dieron como resultado una acumulación significativa de MyD88 en presencia de ACKR4a, y MG132 no afectó la degradación de MyD88 (Figura 3K). Además, resultados similares mostraron que 3-MA y NH4Cl bloquearon significativamente la degradación de MyD88 de una manera dependiente de la dosis (Figuras 3L y 3M). Estos hallazgos parecen sugerir que el bloqueo de la autofagia previene eficazmente la degradación de MyD88 dirigida a ACKR4a. El flujo autofágico denota el proceso dinámico de la autofagia, que es un indicador confiable de la actividad autofágica. Debido a que la fluorescencia de GFP se apaga en el lisosoma, la etapa de autofagia se puede determinar a partir de la fluorescencia de GFP y RFP.42 La observación de la fluorescencia amarilla en el panel Merge mostró más fluorescencia roja en presencia de ACKR4a, lo que indica que ACKR4a promovió la fusión de autofagosomas y lisosomas; mientras que el inhibidor de la autofagia cloroquina (CQ) impidió la fusión de autofagosomas y lisosomas, mostrando más fluorescencia amarilla (Figura 3N). Para validar aún más que ACKR4a se dirige a MyD88 para la degradación autofágica, se realizó un ensayo de localización lisosomal, MyD88 (verde) y los lisosomas (rojo) se co-localizaron en células MBrC (Figura 3O), lo que sugiere que MyD88 fue transportado a los lisosomas. En conjunto, estos resultados sugieren que ACKR4a interactúa con MyD88 y se dirige a MyD88 para la degradación autofágica.

Figura 4. ACKR4a participa en la regulación de la autofagia vía Beclin-1

ACKR4a participa en la regulación de la autofagia a través de Beclin-1

Algunas bacterias utilizan la autofagia para promover su crecimiento e infección; su replicación se reducirá cuando la autofagia esté ausente.13 Para probar si V. harveyi participa en la regulación de la autofagia en células MBrC, las células se infectaron con V. harveyi y luego se evaluó el patrón de expresión. de LC3 fue examinado. En las células MBrC, la exposición a V. harveyi aumentó la autofagia como lo indica la acumulación de puntos GFP-LC3, que estuvo acompañada por un aumento dependiente del tiempo de la infección por V. harveyi (Figura 4A). La sobreexpresión de ACKR4a mejoró la autofagia inducida por V. harveyi, como lo muestra un aumento notable en las acumulaciones de puntos de RFP-LC3, en contraste con el silenciamiento de ACKR4a que redujo significativamente la autofagia inducida por V. harveyi (Figuras 4B y 4C). Además, el silenciamiento de ACKR4a dio como resultado una reducción en la expresión de LC3-II inducida por V. harveyi (Figura 4D).

ULK1, Beclin-1 y ATG5 fueron las proteínas reguladoras clave de la autofagia. Los resultados de qPCR mostraron que ACKR4a mejoró significativamente la expresión de Beclin-1, pero no ULK1 y ATG5 (Figura 4E). El ensayo indicador de luciferasa de ULK1, ATG5 y Beclin-1 reveló que la sobreexpresión de ACKR4a solo provocó un aumento de la actividad de la luciferasa de Beclin-1 (Figura 4F). A continuación, detectamos que la sobreexpresión de ACKR4a mejoraba la expresión de Beclin-1, pero no ULK1 y ATG5 (Figura 4G). Además, Beclin-1-si inhibió la autofagia inducida por ACKR4a, mientras que ATG5-si solo tuvo una inhibición parcial (Figura 4H). Los resultados anteriores indicaron que ACKR4a estaba dirigido a Beclin-1. Por lo tanto, se investigaron la función y el mecanismo de Beclin-1 en la degradación autofágica de MyD88 mediada por ACKR4a. En el pez cebra infectado con V. harveyi, la eliminación de ACKR4a no produjo cambios significativos en ULK1, aunque redujo significativamente Beclin-1 y ATG5 (Figuras S2B-S2D). Beclin-1 mejoró aún más el flujo autofágico inducido por ACKR4a con Baf1A y CQ tratados (Figura 4I), y Beclin-1 mejoró la degradación de MyD88 por ACKR4a (Figura 4J). Luego llevamos a cabo los ensayos Co-IP para determinar si ACKR4a interactúa con Beclin-1 y descubrimos que ACKR4a interactúa con Beclin-1, y la infección por V. harveyi mejoró la interacción entre ACKR4a y Beclin{{51 }} (Figura 4K). Un ensayo de localización lisosomal indicó que ACKR4a mejoró la fusión del autofagosoma con el lisosoma (Figura 4L). Posteriormente, ACKR4a aumenta la expresión endógena de Beclin-1 (Figura 4M) y el silenciamiento de ACKR4a atenúa la expresión de Beclin-1 inducida por V. harveyi (Figura 4N). Además, el silenciamiento de Beclin-1 mejoró la fosforilación de p65 desencadenada por V. harveyi, lo que sugiere además que V. harveyi induce autofagia para regular negativamente la señalización de NF-kB (Figura 4O). A continuación, intentamos determinar la importancia biológica de Beclin-1 en la infección por V. harveyi, particularmente en el control de la proliferación de V. harveyi. Se realizó el ensayo de UFC y se encontró que tanto el silenciamiento de Beclin-1 como la autofagia bloqueada por CQ redujeron la proliferación de V. harveyi, lo que demuestra que V. harveyi utiliza la autofagia para promover su proliferación (Figura 4P). Los resultados anteriores en conjunto revelan que ACKR4a induce y forma complejos con Beclin-1 para promover la autofagia y luego facilitar la infección por V. harveyi.

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ACKR4a indujo autofagia para bloquear la apoptosis

La muerte celular autofágica se considera una alternativa razonable a la apoptosis, y la apoptosis también es un mecanismo antibacteriano reconocido; las infecciones bacterianas exitosas completan la autorreplicación al inhibir la apoptosis.22 Para determinar la relación entre la autofagia y la apoptosis inducida por V. harveyi, se determinó la apoptosis de las células MBrC con diferentes tratamientos antes y después de la infección por V. harveyi, y el silenciamiento de ACKR4a aumentó la V. apoptosis inducida por harveyi (Figuras 5A y 5B, panel izquierdo). Debido a que la caspasa3 y la caspasa7 son importantes en el inicio de la apoptosis, son ampliamente aceptadas como indicadores confiables de la apoptosis. Un ensayo de caspasa Glo 3/7 mostró que la sobreexpresión de ACKR4a inhibía la actividad de caspasa3/7 inducida por V. harveyi, mientras que el silenciamiento de ACKR4a mejoraba la actividad de caspasa3/7 inducida por V. harveyi (Figura 5B, panel derecho). ACKR4a inhibió la actividad de caspasa3/7 inducida por V. harveyi y caspasa8 activa recombinante agregada exógenamente (Figura 5C), lo que sugiere que ACKR4a es capaz de bloquear eficientemente la señalización de apoptosis. Aunque se ha demostrado la autofagia inducida por ACKR4a, se necesitan más estudios para investigar el papel de la autofagia en el bloqueo de la apoptosis. Como se muestra en la Figura 5D, el silenciamiento de ACKR4a aumentó significativamente las caspasas efectoras (caspasa7) y las caspasas iniciadoras (caspasa8). Además, la sobreexpresión de ACKR4a inhibió los ARNm de caspasa7 y caspasa8 (Figura 5E) y la eliminación de ACKR4a aumentó significativamente la caspasa7 y la caspasa8 en el pez cebra (Figuras S2E y S2F). Estudios anteriores han demostrado que Beclin-1 es un interruptor molecular que media en los procesos de apoptosis y autofagia,45 por lo que se exploró la participación de Beclin-1 en la regulación de la apoptosis. En nuestro estudio, la sobreexpresión de Beclin -1 reguló negativamente la caspasa8 inducida por V. harveyi, mientras que Beclin -1 silenció la caspasa8 inducida por V. harveyi regulada positivamente (Figura 5F). Se encontró un resultado interesante: la caspasa8 se reguló significativamente a las 3 h de la infección por V. harveyi; se inhibió nuevamente al aumentar la duración de la infección, y LC3-II se correlacionó negativamente con caspasa8 (Figura 5G). Según los resultados anteriores, ACKR4a indujo la autofagia para bloquear la señalización apoptótica y facilitar la infección por V. harveyi, y Beclin-1 podría ser un objetivo potencial en la cascada de autofagia y apoptosis.

Figura 5. ACKR4a induce autofagia para bloquear la apoptosis

Ap-1 mejora la autofagia inducida por ACKR4a en la infección por V. harveyi

Posteriormente, se investigó el mecanismo de expresión de ACKR4a inducida por la infección por V. harveyi. Primero se construyeron cuatro plásmidos promotores ACKR4a diferentes de acuerdo con las secuencias de predicción del promotor (Figura 6A). El ensayo de luciferasa mostró que la actividad ACKR4a-p-3 fue la más alta (Figura 6B). Para identificar el activador ascendente de la expresión de ACKR4a durante la infección por V. harveyi, se analizó la región promotora de ACKR4a y se encontró que ACKR4a tiene sitios de unión potenciales de Sp-1 y Ap-1 (Figura 6C). El ensayo ACKR4a-luc mostró que Sp-1 no podía mejorar la actividad de la luciferasa y Ap-1 mejoró la actividad de la luciferasa (Figuras 6D y 6E), lo que planteó la posibilidad de que ACKR4a pudiera ser un objetivo directo de Ap -1. Para examinar esto, se construyeron dos vectores de luciferasa que consistían en ACKR4a mutante (Figura 6F). El ensayo de luciferasa mostró que los mutantes que carecían de sitios de unión Ap-1 inhibían la actividad de la luciferasa en contraste con el tipo salvaje (Figura 6G). Para confirmar que Ap-1 promueve la expresión de ACKR4a, silenciamos o mejoramos la expresión de Ap-1 mediante sobreexpresión o eliminación, y se evaluó la expresión de ACKR4a en células MBrC transfectadas. El silenciamiento de Ap-1 redujo significativamente la expresión de ACKR4a inducida por V. harveyi (Figura 6H), mientras que la sobreexpresión de Ap-1 mejoró significativamente la expresión de ACKR4a (Figura 6I). Los resultados de la inmunotransferencia fueron consistentes con los resultados de qPCR, la sobreexpresión de Ap-1 aumentó la expresión de ACKR4a, mientras que el silenciamiento de Ap-1 disminuyó la expresión de ACKR4a (Figura 6J). El análisis de ChIP mostró que Ap-1 se une al promotor ACKR4a en células MBrC en condiciones fisiológicas normales, y la estimulación con V. harveyi mejoró la unión de Ap-1 al promotor ACKR4a (Figura 6K). Los resultados anteriores confirmaron que ACKR4a es un objetivo transcripcional potencial de Ap-1. Luego se exploró la función de Ap-1 en la autofagia; El silenciamiento de Ap-1 redujo eficazmente la acumulación de GFP-LC3 inducida por la infección por V. harveyi (Figura 6L), y también atenuó la regulación positiva de LC3-II inducida por la infección por V. harveyi (Figura 6M). ). El ensayo CFU se realizó para explorar el papel de Ap-1 en la infección por V. harveyi y se encontró que AP-1 facilita la proliferación de V. harveyi (Figura 6N). En conjunto, los resultados anteriores indicaron que Ap-1 activa la transcripción y expresión de ACKR4a y contribuye a la infección por V. harveyi.

Figura 6. Autofagia inducida por ACKR4a mejorada con Ap-1 en la infección por V. harveyi

Figura 7. Un modelo funcional de cómo ACKR4a facilita la infección por V. harveyi

DISCUSIÓN

Se ha demostrado que los ACKR están involucrados en varios procesos biológicos, como la regulación del sistema de quimiocinas, la internalización de ligandos de quimiocinas, la degradación intracelular y la respuesta inflamatoria,4,26, lo cual es importante no solo para la inmunidad adaptativa sino también como un componente importante del sistema inmunológico innato. .33,34 Sin embargo, no se ha investigado el papel de los ACKR en la respuesta inflamatoria a la infección bacteriana en peces. Este estudio demuestra por primera vez que ACKR4a, un miembro de la familia ACKR, promueve la infección de V. harveyi en peces teleósteos mediante autofagia y apoptosis. Mecánicamente, la transcripción de ACKR4a fue regulada positivamente por el factor de transcripción AP-1. Luego, el ACKR4a regulado positivamente se sinergizó con Beclin-1 para inducir la autofagia y se transportó MyD88 a los lisosomas para su degradación. Mientras tanto, ACKR4a induce la autofagia para bloquear la apoptosis y luego facilita la infección por V. harveyi (Figura 7). La inmunidad innata desempeña un papel crucial en la protección de los eucariotas de la invasión patógena endógena y exógena.46 Como resultado de la exposición prolongada a microorganismos, los peces han desarrollado una inmunidad innata más optimizada para protegerlos de la infección.47 Los TLR reconocen PAMP cuando se produce una infección bacteriana. e inició una respuesta inmune innata a través de vías independientes y dependientes de MyD88-, que indujeron la producción de citoquinas proinflamatorias para eliminar la infección bacteriana. MyD88 es un adaptador esencial en la señalización de TLR; con la excepción de TLR3, todos los TLR de mamíferos utilizan MyD88 para activar la señalización de NF-kB.48 Por lo tanto, puede ser el más eficaz para regular directamente MyD88. Por ejemplo, la S-1-acetilcisteína inhibe la producción de IL-6 al inducir la degradación de MyD88. De manera similar, en peces, se ha informado que IRF3 y eIF3k inhiben la señalización de NF-kB al atacar MyD88.42,49 La evidencia acumulada también ha sugerido que MyD88 era importante para la eliminación de infecciones bacterianas. Por ejemplo, los ratones con deficiencia de MyD88-no podían reconocer los componentes bacterianos y eran muy susceptibles a S. aureus. 50 Además, también se ha demostrado que MyD88 está implicado en la eliminación de infecciones bacterianas en el pez cebra.41 La activación del sistema inmunológico innato promueve la eliminación de bacterias, lo que constituye una presión selectiva importante, promoviendo que evolucionen la capacidad de suprimir la inmunidad innata. .51,52 Se ha demostrado que la salmonella puede regular las respuestas inmunitarias y manipular las respuestas inflamatorias después de infectar las células huésped. La virulencia de Salmonella SpvC desfosforila irreversiblemente ERK, p38 y MAPK, inhibiendo así la transcripción de citocinas proinflamatorias.53 En este estudio, el ACKR4a regulado positivamente en M. miiuy infectado con V. harveyi se combinó con MyD88 para inhibir la fosforilación de p65. y bloquear la señalización NF-kB. Esto sugiere que las bacterias también pueden suprimir la inmunidad innata de los peces al interferir con la estabilidad de los adaptadores en la señalización de TLR con el fin de evadir el sistema inmunológico.

La autofagia y la apoptosis son dos mecanismos reconocidos de resistencia a la invasión bacteriana, siendo la autofagia antimicrobiana una barrera contra los microorganismos invasores. Los PRR pueden inducir la autofagia en diferentes etapas del contacto huésped-bacteria e inhibir el crecimiento intracelular de las bacterias.54 Por el contrario, las bacterias también han desarrollado mecanismos eficientes para prevenir, combatir o controlar la autofagia. Estos mecanismos a menudo implican atacar a Beclin-1 para bloquear la autofagia,55 previniendo la maduración de los autofagosomas56 e incluso activar la autofagia en algunos casos para proporcionar nutrición para el crecimiento bacteriano.57 De manera diferente, encontramos que V. harveyi indujo Beclin{{6} } activó la autofagia a través de ACKR4a, que se dirige a MyD88 para la degradación autofágica, bloqueando así la señalización de NF-kB y promoviendo la autorreplicación. Otra estrategia de defensa es la muerte celular programada (apoptosis), que se activa cuando los patógenos utilizan las células huésped para sobrevivir y replicarse. Por ejemplo, la infección de macrófagos por micobacterias causa apoptosis, lo que contribuye a la eliminación de bacterias de las células.58 Además, la apoptosis de macrófagos mediada por TNF-a destruye el ambiente intracelular para las replicaciones de micobacterias y reduce la tasa de crecimiento de las micobacterias infectadas.59 Debido a la presión de supervivencia de la apoptosis, muchos patógenos exitosos codifican genes cuyos productos inhiben la apoptosis en las células huésped, manteniendo así la viabilidad para la replicación del patógeno.60 Aunque estos mecanismos han sido bien estudiados en mamíferos, se sabe poco sobre la inhibición bacteriana de la apoptosis en peces. En nuestro estudio, la autofagia inducida por V. harveyi juega un papel en las etapas apoptóticas y bloquea la señalización apoptótica. La apoptosis y la autofagia se promueven y antagonizan entre sí. En las etapas preapoptóticas, las células bloquean la vía apoptótica y reducen el nivel de apoptosis mediante la autofagia, manteniendo así la ventaja. La autofagia no desencadena la muerte celular en las primeras etapas de la apoptosis, pero también promueve la supervivencia celular.61 La autofagia durante la última etapa de la apoptosis puede promover la apoptosis, y luego el aumento de la apoptosis inhibe la aparición de la autofagia a través de la migración de las vías p53 y BH3.62 El proceso biológico está estrechamente regulado, incluida la interacción de la autofagia y la apoptosis. Numerosos genes reguladores están involucrados en el mecanismo de respuesta interactiva de la apoptosis y la autofagia, siendo Beclin-1 uno de ellos.63 Además de la regulación del inicio de la autofagia, Beclin-1 también participa en la regulación de la apoptosis.45 ,64 Los estudios han demostrado que Beclin-1 pierde su capacidad de resistir la apoptosis después de ser escindido por caspasas activadas.65 Esto sugiere que Beclin-1 juega un papel importante como un "interruptor molecular" en la regulación de autofagia y apoptosis.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

V. harveyi es una bacteria marina gramnegativa que representa una grave amenaza para la salud de las pesquerías de acuicultura marina. La infección por V. harveyi causa meningitis y encefalitis en los peces,66 y la infección por V. harveyi causa congestión cerebral en el mero.67 En respuesta a la infección bacteriana, las respuestas inmune e inflamatoria innatas son los principales sistemas de defensa de los peces. Sin embargo, las bacterias también han desarrollado la capacidad de evadir la inmunidad en simbiosis con sus huéspedes. En resumen, nuestros resultados revelan un mecanismo de evasión inmune de V. harveyi en peces. ACKR4a induce la autofagia para inhibir la señalización de NF-kB y bloquear la apoptosis, lo que a su vez facilita la infección por V. harveyi en peces teleósteos. Esta es también la primera vez que se descubre que las bacterias gramnegativas evaden la inmunidad regulando simultáneamente la inmunidad innata y la apoptosis mediante la autofagia. Este estudio proporciona información sobre la comprensión de los efectos de la autofagia en la interacción huésped-bacteria en peces teleósteos y proporciona una perspectiva sobre la resistencia de los mamíferos a la infección bacteriana.

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