Acteoside, un componente de Stachys Sieboldii MIQ, puede ser un agente antinefrítico prometedor: Efecto de Acteoside en la nefritis anti-GBM de tipo medialuna en ratas

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Kazumi Hayashi, Tadashi Nagamatsu, Mikio Ito, Tomohisa Hattorian y Yoshio Suzuki

Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, Universidad Meijo, 150 Yagotoyama, Tenpaku-Ku, Nagoya 468, Japón

RESUMEN

Efectos deacteósido(ACT) sobre anti-GBM de tipo media lunanefritisen ratas fueron investigados. Cuando las ratas fueron tratadas conActeósidodesde el primer día después de la inyección iv de suero anti-GBM,Acteósidoinhibió la elevación de la excreción de proteínas en la orina. En elActeósidoEn las ratas tratadas, los contenidos de colesterol y creatinina y la producción de anticuerpos contra la r-globulina de conejo en los plasmas fueron más bajos que los de las ratas nefríticas de control. La observación histológica demostró que este agente suprimía la hipercelularidad y la incidencia de formación de medias lunas, adhesión de la pared capilar a la cápsula de Bowman y necrosis fibrinoide en los glomérulos. Además, los depósitos de rat-IgG y C3 en el GBM fueron significativamente menores en elActeósidogrupo tratado que en el grupo control nefrítico. Cuando el tratamiento se inició a partir del día 20 después de la inyección iv de suero anti-GBM, por el cual se había establecido la enfermedad,Acteósidoprodujo un efecto similar en elnefríticoratas como se indicó anteriormente. Estos resultados sugieren que Acteoside puede ser un medicamento útil contra la glomerulonefritis rápidamente progresiva, que se caracteriza por lesiones glomerulares graves con semilunas difusas.

Palabras clave: anti-GBM tipo medialunanefritis,Acteósido, Rata-IgG,Rata-C3

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Chyorogi Stachys sieboldii MIQ (Labiatae) se prescribe para muchas enfermedades, y los chinos, rusos y japoneses utilizan este tubérculo como alimento. Investigaciones recientes han demostrado que chyrogi tiene acción anti-anoxia (1), acción inhibidora de la actividad hialuronidasa (2) y acción inmunosupresora (3).

Por otro lado, se ha mencionado que la respuesta inmune participa en el desarrollo de la nefritis. Para decirlo de manera más concreta, la lesión glomerular está mediada por el depósito de inmunocomplejos en los glomérulos, seguido de una reacción inmunoinflamatoria, que incluye la activación del complemento y la liberación de otros mediadores inflamatorios. En estudios recientes se ha prestado mucha atención a la contribución de la respuesta inmunitaria mediada por células en el desarrollo de la glomerulonefritis (4, 5). Además, Neild et al. (6) informaron que la supresión de la función de las células T por la ciclosporina A (CyA) bloqueó el desarrollo posterior de lesiones glomerulares en la nefritis por enfermedad aguda. Informamos que la mizoribina (7), la azatioprina (7), CyA (8), la metilprednisolona (9) y algunos componentes vegetales (10) tienen una acción inmunosupresora que mostró un efecto saludable sobre la nefritis anti-GBM. Aunque estos agentes inmunosupresores ejercen acción antinefrítica, es difícil usarlos en ensayos clínicos debido a sus efectos secundarios (11). Por lo tanto, se espera desarrollar un nuevo agente inmunosupresor para el tratamiento de la nefritis en la etapa clínica.

El propósito del presente estudio fue dilucidar laefecto antinefrítico del acteósido, un componente de chyorogi, en la nefritis anti-GBM de tipo medialuna en ratas.

MATERIALES Y MÉTODOS

animales

Ratas macho de la cepa Sprague-Dawley, que pesan aprox. Se usaron 160 g (Nihon SLC, Hamamatsu) para todos los experimentos. Estos animales se alojaron en una habitación con aire acondicionado a 23 ± 1 C durante el período experimental.

drogas

La estructura química del acteósido (ACT) (Tsumura Co., Ltd., Tokio) se muestra en la Fig. 1. Este componente se extrajo de la parte aérea de chyorogi (Stachys sieboldii MIQ). La pureza de ACT fue verificada por HPLC (Columna: TSK gel ODS-80TM (4.0 id x 250 mm); Fase móvil: 20 por ciento CH3CN/H2O, que contiene 10 AcOH; Caudal: 0,7 ml/min; Temp.: temperatura ambiente; Detección: UV 254 nm) en Tsumura Co., Ltd. La ACT empleada en estos experimentos tenía una pureza superior a 9970. La ACT se disolvió en agua destilada. También se utilizaron dipiridamol (Dip) (Boehringer Ingelheim, Alemania) y azatioprina (Aza) (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.); Estos medicamentos se suspendieron en 1070 goma arábiga.

Inducción de nefritis anti-GBM tipo medialuna

La nefritis anti-GBM de tipo medialuna se indujo mediante la inmunización de las ratas que habían recibido una dosis nefritogénica de suero de conejo anti-GBM de rata (anti-GBM) con r-globulina (rG) de conejo de acuerdo con una ligera modificación del método informado anteriormente ( 12). En este experimento, las ratas pesaron aprox. Se administraron 160 g de 0,6 ml/animal de suero anti-GBM en la vena de la cola.

El efecto de los fármacos de prueba se estimó administrándolos desde el primer día después de la inyección de suero anti-GBM (fase heteróloga) o el vigésimo día después de la inyección de suero anti-GBM (fases autólogas). En los experimentos, se recogieron muestras de orina de 24- horas y luego se dividieron las ratas en 5 o 6 grupos de 8 ratas para que el contenido promedio de proteína en la orina de 24- horas en cada grupo fuera de un nivel similar.

Evaluación del efecto antinefrítico de los fármacos de prueba

En el experimento de tratamiento farmacológico de la fase heteróloga, cuatro grupos recibieron por vía oral 3, 10 o 30 mg/kg/día de ACT o 100 mg/kg/día de Dip, respectivamente, en un volumen de 1 ml por 100 g. de peso corporal, diariamente desde el primer día o el día después de la inyección iv de suero anti-GBM hasta el día 40. En los experimentos de tratamiento farmacológico desde la fase autóloga, a tres o cuatro grupos se les administraron por vía oral 3, 10 ó 30 mg/kg día de ACT (A) o 30 mg/kg/día de ACT, 100 mg/kg/día de Inmersión de 50 mg/kg/día de Aza (B), respectivamente, en un volumen de 1 ml por 100 g de peso corporal, diariamente desde el día 20 después de la inyección iv de suero anti-GBM hasta el 40 (A) o el 45 (B) día. Al grupo restante se le administró por vía oral el vehículo (agua destilada) en lugar de los fármacos de prueba y sirvió como control nefrítico. Además, se utilizó un grupo no tratado (normal) para la comparación con los grupos nefríticos.

Recolecciones de orina y sangre.

Las muestras de orina de {{0}h se obtuvieron manteniendo a cada animal en una jaula metabólica individual durante 24 h. Al inicio de la recolección de orina, cada animal recibió 8 ml de agua destilada por vía oral sin alimentación. A continuación, la orina se centrifugó a 3,000 rpm durante 15 min a 41ºC y el sobrenadante se utilizó para la determinación de proteína. El último día del experimento, se extrajeron 2,0 ml de sangre de la vena renal de cada rata anestesiada con una jeringa desechable y se colocaron en un tubo que contenía 0,125 ml de heparina. La sangre se centrifugó a 5,000 rpm para obtener plasma para la determinación de algunos parámetros.

Determinaciones de proteína urinaria y contenido plasmático de colesterol y creatinina

La excreción urinaria de proteínas se determinó por el método de Kingsbury et al. (13) y expresado como mg/orina de 24 horas. El contenido de colesterol se determinó con un kit de ensayo comercial (Determine TC-5; Kyouwa Medix Co., Ltd, Tokyo) (14) y se expresó como mg/dl de plasma. El contenido de creatinina se determinó utilizando un kit de determinación de creatinina (CRE-EN; Kainos, Inc., Tokio) y se expresó como mg/dl de plasma/100 g de peso corporal.

Medición del título de anticuerpos en plasma contra -G

El título de anticuerpos en plasma contra rG se determinó por hemaglutinación indirecta utilizando glóbulos rojos de oveja sensibilizados (15).

Medición del nivel de CH50 del complemento plasmático

El nivel de CH50 del complemento plasmático se determinó por el método de Mayer (16).

Evaluación de parámetros histopatológicos

Para el estudio microscópico de luz, se aislaron riñones de ratas anestesiadas con pentobarbital, luego se deshidrataron y se fijaron sumergiendo los tejidos paso a paso en varias tradiciones preocupantes de alcohol etílico de bajo a alto. A continuación, los tejidos se incluyeron en parafina y se seccionaron en rodajas de 2 a 3 em de espesor. En los estudios de nefritis anti-GBM de tipo media luna, las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina y tricrómico de Masson. El número de núcleos (hipercelularidad), la formación de medias lunas, la adhesión de la cápsula de Bowman a la pared capilar (adhesión) y la necrosis fibrinoide en los glomérulos se observaron bajo un microscopio óptico. Para evaluar estos parámetros, se seleccionó una sección transversal ecuatorial mediante métodos de muestreo aleatorio. Se observaron cincuenta glomérulos/cortes transversales, y la tasa de aparición de formación de semilunas, adherencias y necrosis fibrinoide se expresó como los porcentajes de los glomérulos (incidencia) que presentaban estas alteraciones morfológicas como se describió previamente (17). La evaluación fue realizada por una persona diferente que desconocía la identidad de cada muestra. Para evaluar la hipercelularidad, se seleccionó una sección transversal ecuatorial mediante un método de muestreo aleatorio. Se contó el número de núcleos (incluyendo núcleos de células glomerulares y leucocitos exudativos) y se expresó como el número medio por sección transversal glomerular en 10 glomérulos/sección.

inmunohistoquímica

En los tejidos para la tinción inmunoenzimática de IgG de rata, las secciones de parafina se cortaron como se describió anteriormente y las secciones se trataron con 0.1 por ciento de proteasa en 0.05 M Tris- tampón HCl durante 7 minutos y luego se lavó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0.01 M enfriada, pH 7.4. Luego, las secciones se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) anti-IgG de rata (Cappel, West Clester, PA, EE. UU.) a una dilución de 1:100 durante 90 min. Las secciones se lavaron de nuevo con PBS, se trataron con peróxido de hidrógeno al 0,3 % en metanol durante 20 min para bloquear la peroxidasa endógena y se incubaron con IgG anti-ratón purificada por afinidad biotinilada y peroxidasa de rábano picante avidinada con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) (Vecta stain ABC Kit; institución Vector, Burlingame, CA, EE. UU.). Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente.

Los tejidos para la tinción inmunoenzimática del antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA), que es un marcador de la proliferación celular, se fijaron en formalina al 10 % en PBS, y los tejidos incluidos en parafina se tiñeron con el mismo procedimiento que para la IgG de rata excepto por el uso de un mAb (19A2; Coulter Immunology, Hialeah, FL, EE. UU.) para el PCNA.

Cuantificación de rat-IgG, C3 y PCNA en secciones de tejido

El área total de IgG de rata inmunorreactiva y C3 en el glomérulo se midió en 30 glomérulos por sección utilizando un analizador de imágenes (Toyobo Image Analyzer V1; Toyobo Co., Ltd., Tokio) y se presentó como mm2/sección transversal glomerular (GCS). ). Las células positivas para PCNA en el glomérulo se contaron con el analizador de imágenes y los resultados se expresaron como el número de células/GCS

Análisis estadístico

Los datos representan la media ± DE y los resultados se evaluaron estadísticamente mediante ANOVA. Cuando estos resultados fueron paramétricos, estos fueron evaluados estadísticamente por la prueba de Duncan. Cuando los resultados fueron no paramétricos, se evaluaron estadísticamente mediante la prueba de Kruskal-Wallis. El porcentaje inhibitorio se calculó de la siguiente manera:

Porcentaje inhibitorio (porcentaje)=(Control - Medicamento de prueba) x 100 / (Control - Normal)

RESULTADOS

Efecto de Acteoside en la nefritis anti-GBM de tipo media luna

Excreción urinaria de proteínas (Figs. 2 y 3): Cuando el tratamiento con ACT se inició a partir del día siguiente de la inyección de suero anti-GBM (fase heteróloga), la primera supresión significativa de la proteína urinaria se observó al 5º día a 30 mg. /kg, po; el día 20 a 3 y 10 mg/kg, po; y el día 40 con Dip a 100 mg/kg, po

Cuando se administró ACT a partir del día 20 después de la inyección de suero antiGBM (fase autóloga), ACT a 10 y 30 mg/día inhibió la elevación de la excreción de proteínas en la orina para el día 30. Por otro lado, Aza a 50 mg/kg fue más débil que ACT a 30 mg/kg, aunque no significativamente, y Dip no tuvo efecto.

Contenidos de colesterol y creatinina en plasma (Tabla 1): Los contenidos de colesterol y creatinina en plasma se determinaron el día 40 o 45. Los contenidos de colesterol en plasma en las ratas de control nefríticas estaban marcadamente elevados. Por el contrario, la elevación del contenido de colesterol se redujo con ACT (30 mg/kg) de la fase heteróloga en un 60 por ciento del nivel de control y con ACT (30 mg/kg) de la fase autóloga en un 62% del nivel de control. nivel. Los contenidos de creatinina en plasma en las ratas nefríticas también estaban elevados. Por otro lado, en el ACT (30 mg/kg) de ratas tratadas en ambas fases, el contenido de creatinina en plasma fue similar al de las ratas normales.

Título de anticuerpos en plasma contra rG: las ratas nefríticas habían mostrado una producción de anticuerpos marcadamente acelerada. La producción acelerada de anticuerpos fue suprimida al 72 por ciento del nivel de control por el tratamiento con ACT (10 y 30 mg/kg) de la fase heteróloga (Tabla 2), ACT (30 mg/kg) de la fase autóloga y Aza a 70 y 51 por ciento del nivel de control, respectivamente (datos no mostrados), y no fue afectado por Dip.

Observación histológica (Tabla 3, Figs. 4 y 5): El examen con microscopio óptico de los glomérulos nefríticos reveló lesiones caracterizadas por formación de media luna severa, adherencia, necrosis fibrinoide y proliferación de células mesangiales. La observación histológica demostró que ACT (tanto de la fase heteróloga como de la autóloga) inhibió la hipercelularidad y la incidencia de formación de medias lunas, adhesión y necrosis fibrinoide en los glomérulos en el día 40 o 45. Las lesiones de las ratas nefríticas tratadas con Dip y Aza también fueron menores que las de las ratas nefríticas de control. Sin embargo, cuando las ratas nefríticas se trataron con Dip desde la fase autóloga, los cambios histológicos se vieron poco afectados por Dip (datos no mostrados).

La proliferación de células glomerulares, es decir, el aumento de células positivas para PCNA en los glomérulos, se observó enratas nefríticas. Por el contrario, en el día 30, una reducción del 52 por cientoción en la proliferación celular, y esto se asoció wcon una reducción significativa de las células glomerulareslularidad en comparación con el control (Tabla 3).

Depósito de reactivo inmune (Tabla 2 y Fig. 6): Fue posible observar depósitos de IgG y C3 de rata en el GBM en las ratas de control nefríticas; sin embargo, no se encontraron en ratas normales. ACT (30 mg/kg) de la fase heteróloga redujo la deposición de IgG de rata en el GBM en un 72 por ciento del nivel de control. Además, ACT (3, 10 y 30 mg/kg) de la fase heteróloga redujo la deposición de C3 de rata en el GBM en un 60 a 69 por ciento para el día 40. Incluso cuando se administró ACT desde la fase autóloga, la inhibición de la deposición de C3 e IgG de rata fue similar a los resultados anteriores. La inmersión no afectó a la deposición de IgG y C3 de rata. Aza, sin embargo, redujo la deposición de IgG y C3 de rata en el GBM en un 67 y un 68 por ciento, respectivamente (datos no mostrados).

Efecto de ACT sobre la actividad del complemento y los depósitos de C3 en la GBM en la nefritis anti-GBM de tipo original (Fig. 7)

Se indujo nefritis anti-GBM de tipo original en ratas mediante la inyección de 0,6 ml de suero anti-GBM en las venas de la cola, como se describió anteriormente (18). Las ratas nefríticas se trataron previamente y después con ACT a 30 mg/kg, po y factor de veneno de cobra (CVF) (Sigma) a 10 µg/rata, ip, tres veces, cada 8 horas. Los tratamientos ACT y CVF redujeron la excreción urinaria de proteínas con un porcentaje inhibitorio de aprox. 35 grados y 71 por ciento, respectivamente. El CH50 en las ratas de control nefríticas fue notablemente inferior al de las ratas normales 24 horas después de la inducción de la nefritis. ACT inhibió la disminución de CH50 y aumentó la deposición de C3 en GBM en ratas de control nefríticas. CVF abolió la deposición CH50 y C3. Además, en el experimento in vitro, ACT inhibió la activación del complemento en un 37 por ciento. Cuando se administró ACT a ratas normales, ACT redujo la activación del complemento en el experimento ex vivo (datos no mostrados).

DISCUSIÓN

La glomerulonefritis rápidamente progresiva y las enfermedades renales en el síndrome de Goodpasture son enfermedades malignas que desembocan en insuficiencia renal a los 2 o 3 meses del desarrollo de la enfermedad (19). Las características de esta nefritis incluían hipercelularidad, marcada infiltración de neutrófilos y monocitos y formación de medias lunas en los glomérulos. La terapia combinada con agentes inmunosupresores, antiplaquetarios y esteroides se ha aplicado principalmente a esta enfermedad. Por otro lado, aunque CyA es un inmunosupresor superior que ejerce un efecto beneficioso sobre la nefritis experimental (6, 8), se ha informado que CyA causa disfunción renal y provoca una alteración histológica irreversible en los glomérulos (11). La metilprednisolona posee muchos efectos secundarios. Además, el fenómeno de rebote y el síndrome de abstinencia tras un tratamiento prolongado con este medicamento son dos de los problemas. Por lo tanto, se debe desarrollar un nuevo agente inmunosupresor para el tratamiento de la nefritis que tenga menos efectos secundarios.

La nefritis anti-GBM de tipo crescentic es un modelo experimental que muestra alteraciones histológicas y patológicas similares a las de la glomerulonefritis rápidamente progresiva y la enfermedad renal del síndrome de Goodpasture (20). El desarrollo y progresión de esta nefritis consta de 2 fases que están mediadas por respuestas inmunes. La primera reacción, denominada fase heteróloga, se debe al depósito de anticuerpos anti-GBM, seguida de una acumulación dependiente del complemento de granulocitos polimorfonucleares (21, 22). La fase tardía (fase autóloga) se desarrolla por la unión de anticuerpos autólogos depositados a lo largo del GBM y la entrada de monocitos/macrófagos a los glomérulos después de esta reacción (22, 23). Esta nefritis se caracteriza por proteína urinaria bifásica e hipercelularidad que involucra la formación de media luna y necrosis fibrinoide. Se cree que la formación de la media luna está mediada por macrófagos migrados y células epiteliales proliferadas (22, 24).

Anteriormente informamos que la mizoribina y Aza, un agente inmunosupresor (7), inhibieron la elevación de anticuerpos plasmáticos contra IgG de conejo y Pachyman, el componente principal de Poria cocos (18), disminuyeron el grado de depósito de C3 en GBM, y ambos fueron marcadamente eficaz contra la nefritis anti-GBM.

Los tratamientos con ACT suprimieron el desarrollo de glomerulonefritis anti-GBM según lo evaluado por la reducción de la proteinuria y el colesterol plasmático, la prevención del deterioro de la función renal y la prevención de cambios histológicos progresivos, incluido el desarrollo de semilunas glomerulares e hipercelularidad. En el día 40, ACT a 30 mg/kg solo redujo significativamente la cantidad de depósito de IgG de rata en la GBM mediada por la supresión de la producción de anticuerpos en este modelo nefrítico. Por otro lado, la cantidad de depósitos de C3 en el GBM disminuyó con ACT a 3, 10 o 30 mg/kg. Además, ACT inhibió significativamente la activación del complemento tanto en experimentos in vitro como ex vivo. La reducción de CH50 en ratas control nefríticas fue inhibida por ACT. Los datos anteriores sugieren que la ACT inhibe la lesión renal al suprimir la activación del complemento, porque el complejo de ataque a la membrana del complemento (MAC) está involucrado en la patogenia de la lesión glomerular (25), y el MAC sublítico tiene mediadores inflamatorios potenciales que podrían estar asociados con el daño glomerular. proliferación de células mesangiales y difusiones de matriz extracelular, como especies reactivas de oxígeno (26), proteasa (27), prostaglandinas (28) e interleucina-1 como citocinas (29), así como colágeno (30).

Se cree que la activación del complemento está estrechamente relacionada con la infiltración de leucocitos. En estudios recientes, se informó que C5a provocó la adhesión de monocitos y neutrófilos a las células mesangiales y endoteliales, respectivamente (31, 32). Por lo tanto, en un estudio posterior, investigaremos el efecto de ACT sobre la acumulación de leucocitos en los glomérulos.

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