Avances en dermatología utilizando el aptámero de ADN Innovación "Aptamin C": prevención del estrés oxidativo y maximización del efecto de la vitamina C a través de la antioxidante

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Sooho Choi PhD1|Jeongmin Han Ph.D. Candidato2|Ji Hyun Kim MS Candidate1|A-Ru Kim Ph.D. Candidato3|Sang‐Heon Kim Ph.D. Candidato3|Weontae Lee Ph.D., profesor2|Moon‐Young Yoon Ph.D., profesor3|Gyuyoup Kim PhD1|Yoon‐Seong Kim Ph.D., profesor1

Resumen

Fondo:Vitamina C(también conocido como ácido L-ascórbico) juega un papel fundamental en la reducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la regeneración celular al proteger las células del estrés oxidativo. Aunque la vitamina C se usa ampliamente en los mercados cosméticos y terapéuticos, existe evidencia considerable de que la vitamina C se somete fácilmenteoxidaciónpor el aire, el pH, la temperatura y la luz ultravioleta durante el almacenamiento. Esta deficiencia de vitamina C disminuye su potencia como antioxidante y reduce la vida útil de los productos que contienen vitamina C como ingrediente. Para superar la deficiencia de vitamina C, hemos desarrollado Aptamin C, un aptámero de ADN innovador que maximiza la eficacia antioxidante de la vitamina C al unirse a la forma reducida de vitamina C y retrasar suoxidación.

Métodos:La unión de aptamina C con vitamina C se determinó mediante análisis ITC. El experimento ITC se realizó con 0.2 mmol/Lvitamina Cque se inyectó 25 veces en alícuotas de 2 µL en la celda de muestra de 1,8 mL que contenía Aptamin C a una concentración de 0.02 mmol/L. Los datos se ajustaron a una isoterma de unión de un sitio utilizando el programa de origen para ITC v.5.0.

Resultados:Para investigar el efecto de Aptamin C yvitamina Ccomplejo en pieles humanas, se realizaron pruebas tanto in vitro como clínicas. Observamos que el complejo de Aptamin C y vitamina C fue significativamente efectivo en la mejora de las arrugas, el efecto blanqueador y el aumento de la hidratación. En la prueba clínica, los sujetos tratados con el complejo mostraron una mejora espectacular en la irritación y el picor de la piel. No se presentó ninguna reacción adversa por el complejo Aptamin C en la prueba.

Conclusión:En conjunto, estos resultados mostraron que Aptamin C, un compuesto novedoso e innovador, debería servir potencialmente como un ingrediente cosmecéutico clave para una variedad de afecciones de la piel.

PALABRAS CLAVEantioxidación, aptamina C (aptámero de unión a vitamina C),oxidación, estrés oxidativo,vitamina C(ácido L-ascórbico)

cistancheposeen una fuerte capacidad de antioxidación

1|INTRODUCCIÓN

Las especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) son especies químicas químicamente reactivas que contienen oxígeno, que desempeña un papel importante en la señalización celular y la homeostasis.1-3 Estas incluyen no solo efectos positivos como la inducción de genes de defensa del huésped y la movilización de sistemas de transporte de iones, sino también también participa en la apoptosis (muerte celular programada).4,5Los niveles de ROS pueden aumentar por el estrés ambiental, lo que provoca daños en las estructuras celulares.3 Este fenómeno se denomina "estrés oxidativo". El estrés oxidativo es una de las principales causas de varias enfermedades, incluidas las enfermedades neurodegenerativas, la enfermedad de Lou Gehrig, el autismo, la esclerosis múltiple y las enfermedades de la piel.6-15 Además, el estrés oxidativo tiene una influencia directa en el proceso de envejecimiento de la piel16; las proteínas, los lípidos y el ADN reaccionan de manera sensible al estrés oxidativo causado por las ROS.17 Los antioxidantes son muy efectivos en la protección de la piel, ya que reaccionan directamente a las ROS, impidiendo que lleguen a las moléculas biológicas diana.18,19 Los antioxidantes comovitamina C, vitamina E, coenzima Q10 y compuestos polifenólicos protegen la piel del daño causado por ROS. Los antioxidantes ayudan a prevenir y tratar diversas enfermedades de la piel y ralentizan el proceso de envejecimiento de la piel.20 El uso de la vitamina C en la industria se debe principalmente a sus propiedades antioxidantes, que son el resultado devitamina C's para neutralizar los radicales libres de oxígeno, a través de un proceso llamado barrido de radicales.21,22 Sin embargo, debido a estas mismas propiedades antioxidantes, la molécula en sí misma es inherentemente susceptible a la degradación a través deoxidación. Para resolver este problema, desarrollamos Aptamin C, un aptámero de ADN que se une específicamente a la vitamina C e inhibe la oxidación de la vitamina C. Los aptámeros son oligonucleótidos basados ​​en ADN o ARN monocatenarios capaces de unirse selectivamente a una amplia gama de moléculas. Los aptámeros se identifican comúnmente mediante un método de selección in vitro denominado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial o "SELEX". Identificamos que la aptamina C inhibe laoxidaciónde vitamina C de varios agentes oxidantes y mantiene la actividad antioxidante durante el almacenamiento a largo plazo. Para confirmar la evaluación de seguridad de Aptamin C, se realizaron experimentos a nivel celular y se aplicaron directamente a humanos y no se observó toxicidad. Las enfermedades de la piel como la dermatitis atópica, la psoriasis y el acné están relacionadas con la respuesta inmune y las ROS.23Vitamina Ctiene la capacidad de eliminar las ROS y tiene un efecto antiinflamatorio.24 La aptamina C previeneoxidaciónde vitamina c y maximiza su eficacia a través de la liberación lenta. Por lo tanto, esperamos que el complejo Aptamin C‐vitamina C muestre el efecto sinérgico.

2|MATERIALES Y MÉTODOS

2.1|Detección de aptámeros contra la vitamina C con óxido de grafeno reducido

Este método se ha llevado a cabo modificando el método de la investigación previa.25 Los candidatos a ssDNA que pueden unirse específicamente avitamina Cse desarrollaron a partir de una biblioteca aleatoria de ssDNA que constaba de aproximadamente 1X1018 secuencias diferentes. Para la biblioteca de ssDNA, utilizamos una secuencia personalizada cuyo tamaño es de 60 mer y contiene 30 secuencias de nucleótidos generadas aleatoriamente y un sitio de cebador para la amplificación (5′‐ATGCGGATCCCGCGC‐(N)30‐GCGCGAAGCTTGCCC‐3′). Realizamos un total de cinco rondas mientras cambiamos la condición experimental para seleccionar una secuencia más específica. El volumen total de reacción fue de 200 μL. Alrededor de 20 μL de tampón de unión 10x (10x PBS agregado 10 mmol/L de MgCl2), 80 μL de rGO (5 mg/mL, diluido en agua) y 200 picomoles de biblioteca de ssDNA (20 μL de 100 μmol/L de stock ) se agregaron y archivaron dH2O a 200 μL. La reacción continuó durante 30 minutos para unir la biblioteca de ssDNA a rGO y, luego, la mezcla se centrifugó a 20 000 g durante 20 minutos para eliminar el sobrenadante. El sedimento de rGO se lavó 1 vez con 200 μL de tampón de unión, que tiene la misma concentración que la condición de unión objetivo de cada ronda. Para eluir a los candidatos, 200 nanomoles devitamina Cdiluidos en 200 μL de tampón de unión se agregaron al sedimento rGO y el paso de elución se realizó durante 1 hora. El ssDNA eluido se dividió por centrifugación, se hizo a 20 000 g durante 20 minutos y se amplificó. Hicimos precipitación con EtOH para eliminar las impurezas excepto el ssDNA antes de la amplificación. Hicimos PCR asimétrica para obtener ssDNA amplificado. La relación entre el cebador de reenvío y el cebador inverso de la PCR asimétrica fue de 10:1. Hicimos electroforesis en gel de agarosa al 2,5 por ciento para confirmar el producto de PCR con unos pocos microlitros. La PCR asimétrica no puede producir solo ssDNA. Entonces, hicimos el método de trituración y remojo para aislar los candidatos de ssDNA. Para el método, hicimos electroforesis en un gel nativo de poliacrilamida al 12 por ciento y teñimos el gel con bromuro de etidio (EtBr). Para separar el ADN de doble cadena (dsDNA) y el ssDNA, la parte del gel teñida con ssDNA se cortó, pulverizó y extrajo el ssDNA con tampón de trituración y remojo (500 mmol/L NH4OAc, 0,1 % SDS, 0,1 mmol/L EDTA) durante la noche. El gel pulverizado se separó por centrifugación. El sobrenadante que contiene ssDNA se concentra y purifica mediante precipitación con EtOH. El ssDNA seco se recopiló con dH2O esterilizada y se usó para la siguiente ronda como biblioteca.

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2.2|Experimento de calorimetría de titulación isotérmica (ITC)

El experimento de calorimetría de titulación isotérmica se realizó utilizando un sistema VP-ITC (MicroCal Inc Northampton) a 25 grados en una solución salina tamponada con fosfato compuesta por 1 mmol/L de cloruro de magnesio (pH 7,4). Antes de cada experimento de titulación, Aptamin C 2 mL yvitamina CSe desgasificaron muestras de 600 µL durante 30 minutos al vacío, sin agitación, a una temperatura unos grados por debajo de la del experimento. Preparamos 0,2 mmol/L de vitamina C que se inyectó 25 veces en alícuotas de 2 µL en la celda de muestra de 1,8 mL que contenía Aptamin C a una concentración de 0,02 mmol/L. Los datos se ajustaron a una isoterma de unión de un sitio utilizando el programa de origen para ITC v.5.0 (MicroCal Inc).

2.3|Ensayos de microplacas basados ​​en fluorescencia para la oxidación de vitamina C

Oxidacióndevitamina Cse midió detectando el producto oxidado dehidroascorbato (DHA) utilizando una versión modificada del método descrito por Vislisel et al.7 En este método, el DHA se detecta por reacción con o-fenilendiamina (OPDA) para formar el producto de condensación fluorescente 3‐( dihidroxietil) furo [3,4-b] quinoxalina-1-ona. El ensayo se realizó de la siguiente manera en placas negras de 384 pocillos (Greiner Bio-One). Los aptámeros se disolvieron primero en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2, que contenía MgCl2 1 mM, a una concentración de 200 µmol/L, luego se plegaron calentando a 95 grados y se dejaron enfriar lentamente a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, los aptámeros plegados se diluyeron 1:1 (v:v) en una solución recién preparada de 5 mmol/Lvitamina Cen tampón de ensayo [50 mmol/L de acetato de sodio, 1 % (p/v) de BSA, 0,05 % (v/v) de Tween 20, 1 mM MgCl2 (Sigma, todos los componentes) ajustado a pH 5,5], y la mezcla se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, para permitir que los aptámeros se unieran antes de la adición del oxidante. A continuación, se añadieron oxidantes a las soluciones de vitamina C/aptámero a concentraciones de (EM) H2O2 (Sigma). Los oxidantes se prediluyeron a sus concentraciones de trabajo en tampón de ensayo. A continuación, las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de añadir OPDA (Sigma) a una concentración de 5,5 mmol/l en el tampón de ensayo. Inmediatamente después de la adición de OPDA, se determinó la fluorescencia de las muestras a 425 nm usando un lector de placas SpectraMax® i3X (Molecular Devices) con excitación a 345 nm, durante un transcurso de tiempo de 45 minutos con mediciones realizadas cada 60 segundos. Todas las muestras y los recipientes que contenían reactivos se envolvieron en papel de aluminio para protegerlos de la luz durante todas las incubaciones realizadas para los ensayos de fluorescencia.

2.4|Medición de la reducción de vitamina C mediante DCPIP (2,6‐diclorofenolindofenol)

Para determinar la reduccin devitamina C, llevamos a cabo los experimentos utilizando la reacción DCPIP. La vitamina C reacciona con DCPIP, cambiando el color de azul a incoloro. La vitamina C preparada se trató con Aptamin CTM al 5 por ciento, y la vitamina C no tratada se incubó a temperatura ambiente durante 8 semanas. La muestra se midió después de 2, 4 y 8 semanas. Se agregaron alrededor de 2 mL de DCPIP al matraz cónico usando una pipeta, y se agregó la primera vitamina C sin tratar hasta que la solución se volvió incolora. La cantidad devitamina Cse midió y se repitió con otras muestras. El grado de reducción de cada muestra se calculó de acuerdo con estos datos.

2.5|Estudio in vitro del efecto antiarrugas en fibroblastos dérmicos humanos

Para evaluar la viabilidad celular en fibroblastos dérmicos humanos, las células se trataron con diferentes concentraciones finales de Aptamin C convitamina C(Aptamin C ug más vitamina C ug/mL) {{0}}.01 más 0.5 ug/mL, 0.1 más 5 ug/mL, 0.5 más 25 ug /ml, 1 más 50 ug/ml y 2 más 100 ug/ml. Y luego, las células se trataron a concentraciones de aptamina C con vitamina C para detectar colágeno intracelular, colagenasa intracelular (MMP-1) y actividad de elastasa.

Los fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se seleccionaron sobre la base de las "Pautas para la evaluación de la eficacia de los cosméticos funcionales (I)" de MFDS. Los HDF se cultivaron en DMEM/F12 3:1 mezcla alta en glucosa complementada con 10 % de FBS y 1 % de antibiótico-antimicótico en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 a 37 °C.

Las HDF (5 × 104 células/pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos, se incubaron durante 24 horas y se trataron con diversas concentraciones de Aptamin C convitamina Cy se incubó durante 24 horas. Después de 24 horas, se recogió el sobrenadante y se midió la cantidad de procolágeno liberado en el medio a 450 nm utilizando el kit ELISA Procollagen Type IC‐Peptide (PIP). El grado de producción de colágeno se calibró por contenido de proteína total y se comparó con TGF‐1 como control positivo. Se usaron medios sin materiales de prueba como control de solvente.

Las HDF (5 × 104 células/pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos, se incubaron durante 24 horas y se trataron con diversas concentraciones de Aptamin C convitamina Cy se incubó durante 48 horas. Después de 48 horas, la actividad de la colagenasa se midió a 450 nm utilizando el kit ELISA humano MMP-1. La actividad de MMP-1 se evaluó por el contenido de proteína total y se comparó con TGF-1 como control positivo. Se usaron medios sin materiales de prueba como control de solvente.

Todos los datos se expresaron como media ± desviación estándar y procedían de 3 experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de muestras independientes utilizando el programa de software SPSS® (IBM) en el nivel de significancia de P <>

2.6|Medición de las arrugas de la piel mediante un sistema de análisis de imágenes 3D

Veintidós mujeres (edad promedio: 50,05 ± 2,94 años) participaron en este estudio. Las arrugas de la piel de las patas de gallo se evaluaron mediante un sistema de análisis de imágenes 3D al inicio del estudio, 4 y 8 semanas. La hidratación de la piel se evaluó mediante el método de capacitancia, y la TEWL mediante el método de difusión de agua en la superficie de la piel y la elasticidad de la piel mediante el método de succión al inicio, 2, 4 y 8 semanas después del tratamiento. Además, los sujetos completaron autocuestionarios sobre la eficacia a las 2, 4 y 8 semanas, y los sujetos completaron el de usabilidad a las 8 semanas después del tratamiento. Todos los datos obtenidos fueron analizados estadísticamente por el software SPSS®. Los parámetros de arrugas de las patas de gallo se evaluaron utilizando PRIMOS® Premium (GFMesstechnik GmbH). Este sistema permitió el análisis cuantitativo de la rugosidad, profundidad, área y volumen de las arrugas que sobresalen en la piel. La imagen se analizó en la misma área en términos de parámetros de arrugas de la piel (1, profundidad promedio de las arrugas; 2, profundidad promedio de la arruga más grande; 3, profundidad máxima de la arruga más grande; 4, área total de arrugas; 5, volumen total de arrugas; 6 , factor de forma total de arrugas; 7, longitud total de las arrugas; 8, Ra; 9, Ry; y 10, Rz) al inicio del estudio, 4 y 8 semanas después del tratamiento con Primos 5.8 E ver. Software.

3|RESULTADOS

3.1|Se requirió un enfoque riguroso para la preparación del tampón para realizar con éxito rGO‐SELEX con un objetivo inestable

La biblioteca de ssDNA, que se unió a rGO a través de interacciones de apilamiento π-π entre los anillos aromáticos de la superficie de grafeno y las bases de ADN 26,27 y ssDNA no unido en rGO, se separó y eliminó por centrifugación. El ssDNA que se adsorbió en la superficie de rGO se eluyó mediante el tratamiento con el compuesto objetivo. Según los informes de la literatura, la conformación del aptámero cambia después de unirse al objetivo y al debilitar las interacciones de apilamiento π‐π con rGO.28-31 Este proceso se repitió durante cinco rondas. Cada ronda subsiguiente procedió con condiciones de tampón más severas y tiempos de elución más cortos. Este rendimiento nos permitió mantener ssDNA con una mejor especificidad para los compuestos objetivo.

Los datos NGS de la biblioteca enriquecida producida por el proceso rGO-SELEX produjeron 404071 secuencias. Seleccionamos 119 secuencias de estos datos, las clasificamos en 11 grupos según la similitud de la estructura y seleccionamos secuencias representativas para candidatos a aptámeros (Figura 1A).

3.2|Selección de aptamina C

Las estructuras secundarias de los candidatos de Aptamin C se predijeron utilizando el software gratuito M-Fold.32,33 Los candidatos se agruparon por su posición, longitud, forma y número de tallo y bucle de la estructura de mayor potencial (Figura 1B). DHA, óxido devitamina C, se detecta por su reacción con o-fenilendiamina (OPDA), que desempeña la función de indicador.34 Si el aptámero se une y evita suoxidación, a la vitamina C y previene su oxidación, la señal de fluorescencia de la 3‐(dihidroxietil)‐furo‐[3,4‐b] quinoxalina‐1‐ona, el producto de condensación de la vitamina C y OPDA, será menor que la de control sin aptámero. Una parcela de cada aptámero candidato mezclado con vitamina C y oxidante, con los controles positivos,vitamina Cmás oxidante y secuencias codificadas mezcladas con vitamina C y oxidante (Figura 1C). Se demostró que cinco aptámeros, Aptamin Cb, Cc, Cf, Cg y Ck, tienen efectos de antioxidación.

3.3|Inhibición de la oxidación de la vitamina C por Aptamin C

La aptamina C tiene una alta afinidad de unión porvitamina C. La unión de aptamina C con vitamina C se determinó mediante análisis ITC. A partir de la isoterma de unión, se pueden obtener la entalpía (ΔH), la entropía (ΔS) y la estequiometría (n) de la reacción de unión. La unión exotérmica de aptamin Cb se detectó a partir de la medición de ITC, y la entalpía (ΔH) se calculó como 302,5 ± 3,788, la entropía (ΔS) se calculó como 18,9, la estequiometría (n) se calculó como 56,7 ± {{21 }}.426, y las constantes de disociación (Kd) se calcularon como 2,13 uM para la vitamina C. La unión exotérmica de aptamin Cf se detectó a partir de la medición de ITC, y la entalpía (ΔH) se calculó como 279,2 ± 2,992, se calculó la entropía (ΔS) como 18.4, la estequiometría (n) se calculó como 167 ± 1.15, y las constantes de disociación (Kd) se calcularon como 0.89uM para la vitamina C. La unión exotérmica de aptamina Ck se detectó a partir de la medición ITC y la entalpía (ΔH ) se calculó como 250.4 ± 3.742, la entropía (ΔS) se calculó como 19.8, la estequiometría (n) se calculó como 82.2 ± 0.732 y las constantes de disociación (Kd) se calcularon como 0.90 µmol/L para vitamina C (Figura 2A). Las mediciones de ITC revelan que el cambio en la entropía tras la asociación con Aptamin C es una fuerza impulsora importante paravitamina C. Para preveniroxidaciónde vitamina C en estado líquido, todas las soluciones fueron preparadas con agua desionizada tratada con nitrógeno. La fluorescencia se expresó y analizó cuantitativamente cuando OPDA (o-fenilendiamina) se unió a DHA generado poroxidaciónde vitamina C. El grado de oxidación de la vitamina C según la concentración de aptamina C (125, 250, 500 y 1000 nmol/L) se comparó y confirmó mediante el ensayo OPDA. Los resultados demostraron que lavitamina Cla conversión a ácido dehidroascórbico fue más lenta cuando la concentración de Aptamin C fue mayor. (Figura 2B). Estos datos prueban que Aptamin C es un inhibidor de la oxidación de vitamina C dependiente de la dosis.

Realizamos experimentos para determinar si Aptamin C podría prevenir laoxidaciónde vitamina C durante un largo período de tiempo. Cotratado con aptamina Cvitamina C, y la vitamina C sin tratar se expusieron a la luz y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 8 semanas. Como resultado, cuando se dejó sola la vitamina C sin tratar, el grado de reducción disminuyó a menos de la mitad en 2 semanas, y casi todos se oxidaron después de 4 semanas. En presencia de Aptamin C, la vitamina C se redujo a aproximadamente la mitad en 8 semanas (Figura 2C). Esto sugiere que Aptamin C previene la oxidación de la vitamina C durante un largo período de tiempo.

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3.4|Análisis de la actividad de colagenasa intracelular (MMP-1) y colágeno

En el análisis de la actividad de colagenasa, la producción de metaloproteinasa-1 de matriz (MMP-1) se redujo significativamente de manera dependiente de la dosis, con un 7,06 por ciento, 9,29 por ciento y 31,81 por ciento en concentraciones de {{1{ {12}}}}.01 más 0,5 ug/ml, 0,1 más 5 ug/ml y 0,5 más 25 ug/ mL, respectivamente (Figura 3A). En el análisis de la síntesis de colágeno, el péptido carboxi-terminal (PIP) del procolágeno tipo Ι aumentó significativamente de manera dependiente de la dosis, con un aumento del 25,{{20}} por ciento a 0,01 más 0,5 ug/ml , 41,99 por ciento a 0,1 más 5 ug/mL y 71,18 por ciento a 0,5 más 25 ug/mL (Figura 3B).

3.5|Un estudio clínico de los efectos de mejora de las arrugas de la piel en la piel humana

El análisis estadístico de los parámetros de las arrugas se realizó mediante un sistema de análisis de imágenes 3D, para evaluar los efectos de mejora de las arrugas de la piel del producto de prueba en la piel humana. En comparación con el grupo de control, el parámetro "Profundidad media de las arrugas" disminuyó un 4,77 % a las 4 semanas y un 4,25 % a las 8 semanas, el parámetro "Profundidad media de las arrugas más grandes" disminuyó un 3,37 % a las 4 semanas y un 4,53 % a las 8 semanas. El parámetro "Profundidad máxima de las arrugas más grandes" se redujo un 4,36 % a las 4 semanas y un 7,19 % a las 8 semanas, el parámetro "Longitud total de las arrugas" se redujo un 1,61 % a las 4 semanas y un 2,67 % a las 8 semanas, el parámetro "Ra" se redujo un 4,22 % a las 4 semanas y un 3,90 % a las 8 semanas, el parámetro "Ry" disminuyó un 2,66 % a las 4 semanas y un 7,11 % a las 8 semanas, el parámetro "Rz" disminuyó un 3,69 % a las 4 semanas y un 6,22 % a las 8 semanas, la disminución fue de 3,69 por ciento -7.11 por ciento (Figura 4).

4|CONCLUSIÓN

Vitamina Ces una molécula comercialmente importante pero inestable, por lo que mejorar su estabilidad es de interés para varios sectores del mercado. Nuestro trabajo demuestra que Aptamin C, aptámeros de ADN, potencialmente extiende la vida útil y aumenta la potencia de dichos productos al retrasarvitamina C oxidaciónen una solución. Mostramos la eficacia clínica del complejo Aptamin C en la mejora de las arrugas y la hidratación de la piel. El complejo Aptamin C también podría ayudar a aliviar la piel áspera.

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