La nanocinta de óxido de grafeno antioxidante como nuevo agente blanqueador inhibe el mecanismo de melanogénesis relacionado con el factor de transcripción asociado a la microftalmía

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RESUMEN:En elmelaninaproceso de síntesis, las reacciones oxidativas juegan un papel esencial, y es una buena estrategia para inhibir la producción de melanina al reducir el estrés oxidativo. El fullereno y sus derivados, o los complejos, se consideraron como potentes eliminadores de radicales libres, y además aplicamos nanocarbono multicapa para descubrirmelaninainhibidores de la síntesis de mecanismos.melaninaproducción. Los resultados mostraron que los GONR tenían mejores capacidades antioxidantes en plataformas de análisis de estrés oxidativo intracelular y extracelular que otras. Propusimos que los GONR tienen grupos funcionales que contienen oxígeno. En el ensayo de diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína, descubrimos que GONR podría quelar iones metálicos para eliminar especies reactivas de oxígeno. En el punto de vista molecular, observamos que estos nanomateriales regulaban a la baja la síntesis de melanina al disminuir las expresiones génicas relacionadas con el factor de transcripción asociado a la microftalmía, y hubo consecuencias similares en las expresiones de proteínas. En resumen, GONRs es un agente potencial como novelaantioxidantey material de cosmetología para blanquear la piel.

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1. INTRODUCCIÓN

La piel es el órgano que cubre la superficie exterior del cuerpo humano. Dado que la interfaz está en contacto con el medio ambiente, la capa de la piel juega un papel importante en la protección del cuerpo contra los patógenos, evitando la pérdida excesiva de agua, regulando la temperatura corporal, etc. Los melanocitos crecen en la membrana basal de la epidermis de la piel y representan del 5 al 10 por ciento del contenido celular. Se han caracterizado como "glándulas" unicelulares que tienen dendritas delgadas, largas y ramificadas. Los melanocitos se mueven a través de las células epidérmicas en su vecindad inmediata, creando una constelación de células epidérmicas alrededor de cada melanocito. Hay muchas causas internas y externas del envejecimiento de la piel, y uno de esos factores es la radiación ultravioleta (UV) de la luz solar.1 Durante la exposición a los rayos UV, los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la piel aumentan drásticamente, lo que se conoce como estrés oxidativo. Varios factores de toxicidad ambiental también mejoran el estrés oxidativo de la piel, como pesticidas, tetracloruro de carbono, metales pesados, aminas aromáticas y partículas 2.5 (PM2.5).2 En el mecanismo bioquímico, los oxidantes intracelulares se generan a partir del sistema no enzimático, transformándolos en ROS para activar la vía de la melanogénesis.

Además de las ROS, hay muchos factores que afectan la producción de melanina, incluida la expresión génica, la inflamación, los cambios endocrinos y la captación de pigmentos.1 En los primeros pasos de la producción de melanina, la tirosinasa juega un papel en la catalización de la tirosina en feomelanina y eumelanina. Los mecanismos de fabricación de ambos pigmentos son similares, e incluyen la hidroxilación de L tirosina a 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) y la oxidación de L-DOPA a dopaquinona. En el siguiente paso, la dopamina es oxidada por la proteína 1 relacionada con la tirosinasa (TRP-1) y la proteína 2 relacionada con la tirosinasa (TRP-2) en el melanosoma, que está regulada por el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF) formarmelanina.Finalmente, la melanina madura y precipita dentro del estrato córneo.4,5 Estos penetran en los queratinocitos vecinos de la capa basal y protegen su ADN de cualquier mutación o modificación inducida por los rayos UV. el maduradomelaninadentro de los melanosomas se transfiere a los queratinocitos6−9 y finalmente conduce a una pigmentación de larga duración. Los lentigos, las pecas y las manchas marrones/negras a veces causan problemas sociales en hombres y mujeres. El bloqueo del estrés oxidativo o la supresión de la actividad de la tirosinasa es una estrategia para regular a la baja el síndrome de hiperpigmentación y los trastornos dermatológicos.Antioxidantescuran las hiperpigmentaciones y el daño celular causados ​​por ROS.10,11 Por lo tanto, los compuestos antioxidantes sintetizados tienen muchas aplicaciones biofuncionales en aplicaciones para el cuidado de la piel.

El fullereno (C60), el nanotubo de carbono (CNT), el grafeno y la nanocinta de grafeno (GNR) son cuatro tipos de nanocarbono sp2 ampliamente investigados en todo el mundo.12 Durante mucho tiempo, el fullereno y sus derivados o complejos se han considerado como potentes eliminadores de radicales libres. Yodoh et al. utilizó C60 soluble en agua como agente protector contra la degeneración inducida por el estrés catabólico. Injac et al. concluyó que C60(OH)24 es un fuerteantioxidantecompuesto cuando el estrés oxidativo es demasiado alto. Okuda et al. sugirieron que los complejos C60 pueden prevenir la lesión celular mediada por NO.13,14 Tong et al. mostró que los complejos C60 podrían ser candidatos prometedores para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el cerebro causadas por niveles elevados de superóxido. De hecho, una empresa japonesa identificó fullerenos con una fuerte actividad antioxidante para uso cosmético en 2006. Lucente Schultz et al. demostraron que la capacidad de eliminación de radicales de oxígeno de los CNT de pared simple funcionalizados (SWCNT) es casi 40 veces mayor que la de C60.15-19 dendrítico Fenoglio et al. observaron que los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNT) poseen una notable capacidad de captación de radicales en contacto con una fuente externa de radicales hidroxilo o superóxido.20 Los cálculos de la teoría funcional de la densidad también revelaron un modelo de SWCNT como captadores de radicales libres. En 2004, Novoselov et al. demostraron por primera vez que el grafeno exhibía un fuerte efecto ambipolar eléctrico y podría ser prometedor para aplicaciones electrónicas.21 Después de eso, continuaron demostrando que el grafeno tiene propiedades electrónicas que son distintivas para un gas 2D de partículas descrito por la ecuación de Dirac. 22,23 Desde estos dos artículos innovadores, se ha prestado cada vez más atención a la investigación basada en el grafeno.24-30 Por ejemplo, Qiu et al. en 2014 mostró que el óxido de grafeno y el grafeno de pocas capas exhibenantioxidanteactividad y puede proteger varias moléculas biomoleculares de la oxidación.31Han et al. demostró experimentalmente en 2007 que la brecha de energía de los GNR se puede controlar durante el proceso de litografía cambiando el ancho de la cinta.32 Entre los cuatro nanocarbonos, los GNR han recibido la menor atención. Hasta donde sabemos, hay poca investigación sobre las propiedades antioxidantes de las nanocintas de óxido de grafeno (GONR).31,33 Por lo tanto, en este estudio, preparamos cuidadosamente MWCNT, MWCNT cortos, GONR y GONR cortos y buscamos comparar sus propiedades antioxidantes y los resultados relacionados sistemáticamente. .

2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2.1. Morfología de MWCNTs y GONRs.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm a 2−3 μm. Simultáneamente, se observó que el tratamiento con ácido nítrico vuelve rugosas las superficies lisas de los tubos. Algunas muescas y formas irregulares se muestran en la imagen de gran aumento. Además, el uso de MWCNT y MWCNT cortos a través de reacciones de microondas obtiene GONR y shortGONR, respectivamente. También ilustramos las imágenes TEM de bajo y alto aumento de GONR y GONR corto. Debido a la gran apertura longitudinal y al corte horizontal menor, parece que los GONR eran más cortos que los MWCNT. Por otro lado, las imágenes de gran aumento mostraron diámetros más grandes, es decir, 0.11−0.18 μm, de GONR que los de MWCNT, lo que indica que el proceso de descompresión fue exitoso. De manera similar, los GONR cortos exhibieron una longitud más corta y un diámetro mayor que los MWCNT cortos. En el compresor de aire de nuestro nuevo proceso de descompresión, las estructuras de capas delgadas de los GONR eran menores que las que obtuvimos en el informe anterior para la misma potencia de microondas de 250 W mientras se mantenían los MWCNT centrales más gruesos. aparecen en lugar de la estructura de nanocintas completamente descomprimida a través de todas las potencias de microondas en el nuevo proceso. Para comparar con el GONR corto en nuestros estudios anteriores,34 la potencia de microondas más alta generó más muescas en el costado de las cintas y no formó bordes de cinta agradables y suaves. Tenga en cuenta que usamos dos tipos diferentes de rejillas de Cu en la Figura 1a. Para MWCNT y GONR con longitud suficiente, se utilizó la rejilla Gu con un formvar de encaje estabilizado con carbono (n.º de producto 01881-F, Ted Pella, Inc., EE. UU.). Los orificios abiertos en una película de carbono de encaje impidieron una imagen de transmisión superpuesta entre los nanocarbonos y la película de carbono. Las redes de color gris oscuro pertenecen a la película de carbono lacey. Sin embargo, se necesitaba la rejilla Gu con formvar estabilizada con carbono (producto n.º 01800-F, Ted Pella, Inc., EE. UU.) para MWCNT corto y GONR corto. Esto se debió a que los grandes agujeros en la película de carbono de encaje causaron problemas para mantener el MWCNT corto y el GONR corto de manera eficiente. Como se ilustra en la Figura 1, el contraste gris claro debajo de los MWCNT cortos y los GONR cortos es una capa ligera de carbono. Esta capa de carbono estabilizó la película de formvar expuesta al haz de electrones a través de sus propiedades conductoras de calor y electricidad.

2.2. Configuraciones de unión de MWCNT y GONR.

Los espectros Raman de los cuatro nanocarbonos se presentan en la Figura 1b; la banda D de GONR fue más alta que la de MWCNT después del proceso de descompresión. Esto se atribuyó al mayor nivel de oxidación y un mayor número de estructuras de borde de GONR en comparación con MWCNT. Este fenómeno también es similar a lo que observamos en 2011.12 Debido al alto nivel de grafitización, la banda G de MWCNT tenía el número más bajo de ancho completo a la mitad del máximo. Las proporciones ID/IG de los cuatro nanocarbonos fueron 0.076, 0.502, 0.483 y 0.700, respectivamente. Brevemente, la disminución de la longitud y la oxidación de la superficie aumentaron el nivel de defecto y, por lo tanto, hicieron que las proporciones ID/IG fueran más altas. El pico D′ está presente en todos los grafenos defectuosos y se considera una medida de calidad.35 Como se ilustra en la Figura 1b, los picos D′ en los cuatro espectros se vuelven más prominentes después del proceso de corte o descompresión, lo que sugiere que son procesos destructivos que introducen muchos defectos. La Figura 1c,d muestra los espectros de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X de los cuatro nanocarbonos. Aparentemente, el pico D' es el más claro para los GONR cortos. Como se muestra en la Figura 1c, el nivel de O aumentó significativamente del 7,6 % (MWCNT) al 19,9 % (GONR) debido a la fuerte capacidad de oxidación del KMnO4 en un entorno ácido. Por otro lado, el nivel de O aumentó ligeramente en un 0,8 por ciento desde MWCNT hasta los MWCNT cortos. Es importante destacar que el nivel más alto de O es del 38,3 por ciento para el GONR corto, lo que implica que los extremos de las nanocintas serían más fáciles de unir a los grupos funcionales de oxígeno que las superficies planas sp2. El número más grande de ancho completo a la mitad del máximo y el cambio a la energía de unión alta de los picos C 1s después del proceso de descompresión de ambos MWCNT y MWCNT cortos se ilustran en la Figura 1d. podría asignarse a los enlaces C−C(CC), C−O,CO y COOH.36 Caracterizamos GONR (200W) en 2013,37 y los resultados fueron similares a los resultados de este estudio. Este estudio concluyó los fenómenos de los espectros Raman, lo que significa que se generaron más grupos funcionales que contienen oxígeno durante la transformación de tubo a cinta (Figura 2).

2.3. Propiedades antioxidantes de MWCNT y GONR.

2.3.1. Determinación de ensayos de actividad de captación de radicales libres de 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo.

La actividad secuestrante de radicales libres de 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) es unantioxidanteplataforma aplicada para detectar la capacidad antioxidante; los resultados para los cuatro nanocarbonos se describen en la Tabla 2. En el ensayo DPPH, se usó vitamina C en una concentración de 100 μM como control positivo. Para probar las actividades antioxidantes de MWCNT, MWCNT cortos, GONR y GONR cortos, se incubaron dosis de 1, 5 y 10 mg/L en la solución de reacción para medir las propiedades. Los MWCNT, MWCNT cortos, GONR y GONR cortos tenían capacidades inhibidoras moderadas a 1{{20}} mg/L (19,2 ±0,3, 12,1 ± 0,3, 26,8 ± 0,3 y 30,0 ± 0,4 por ciento), mientras que la vitamina Chad presentaba una condición similar a 100 μM (93,4 ± 0,1 por ciento) para la supresión.

2.3.2. Ensayo de actividad quelante de iones.

Dentro de la situación de estrés oxidativo, la ferrozina puede desarrollar un complejo con Fe2 plus para ser medido cuantitativamente. En presencia de mediadores quelantes, el complejo se rompe, causando que los iones ferrosos se reduzcan de un color rojo oscuro del complejo Fe2 plus. Utilizamos EDTA como control positivo. La Tabla 2 muestra que los MWCNT, los MWCNT cortos, los GONR y los GONR cortos tenían actividad quelante a 10 mg/l (29,2 ± {{10}},8, 28,7 ± 0. 7, 69,7 ± 0,6 y 68,9 ± 0,3 por ciento), mientras que el control positivo tenía una condición similar a 100 μM (93,4 ± 0,1 por ciento).

2.3.3. Medición del poder antioxidante reductor férrico.

El ensayo de potencial reductor férrico es una prueba sencilla y fiable que se utiliza para cuantificar la síntesis del complejo Fe(III)-ferricianuro. En este ensayo, el poder reductor de los cuatro nanocarbonos que producen el complejo ferroso Fe(III)−TPTZ se detectó mediante cambios en el color de la solución de amarillo a verde y azul. La Tabla 2 demuestra que los poderes reductores de MWCNT, MWCNT corto, GONR y GONR corto fueron densidad óptica (OD) 1,11, 1,13, 1,15 y 1,11 a 10 mg/L.

2.3.4. Los MWCNT y los GONR inhiben la acumulación intracelular de ROS.

Muchos informes han demostrado que las ROS destruyen la integridad estructural de las membranas celulares, incluidas las membranas celulares y las membranas nucleares, lo que provoca daño celular y pérdida de la función normal. la inhibición de la producción de ROS es una buena estrategia para regular a la bajamelanina synthesis. In this study, we used the 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) staining assay to analyze the intracellular oxidative stress level in MWCNT and GONR treatment cells. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) induced oxidative stimulations in MWCNT and GONR groups and was used as a negative control.41 When the concentration of PMA was 20 ng/mL, it induced oxidative stress, increasing the value to 38%; after treating GONRs and MWCNTs, the levels of ROS were downregulated to the normal level. The data showed that both materials inhibited oxidative stress levels, and the anti-oxidative effect of GONRs was higher than that of MWCNTs (Figure 3). Table 1 shows a similar consequence list. We contended that there are three reasons for our new findings: first, the order of solubility of these materials was as follows: short GONRs > GONRs >MWCNT cortos > MWCNT, lo que significa que el área de contacto de los GONR cortos era la más grande, por lo que era superior para la eliminación de ROS. En segundo lugar, los GONR y los MWCNT eran estructuras de sp2-carbono que podían destruir la electricidad de ROS a través de la formación de aductos o la transferencia de electrones.42 Descubrimos que elefectos antioxidantesde las estructuras de nanocintas eran mejores que las de las estructuras de nanotubos, por lo que las nanocintas facilitan la transferencia de electrones que los nanotubos. Finalmente, en la Figura 1b, observamos que el sitio de carbono sp2-GONR contenía más grupos funcionales de oxígeno que los MWCNT, los grupos de ácido carboxílico podrían quelar iones metálicos y los grupos hidroxilo podrían ser un donante de H para eliminar ROS e inhibir la producción de melanina.

2.4. Citotoxicidad de MWCNT y GONR tratados en células de fibroblastos dérmicos humanos.

Se aplicó el método de bromuro de {{0}}(4,5-dimetilt-triazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) para evaluar el efecto citotóxico propiedades de GONR en células Hs68 (Figura 3), y las células se cultivaron a diferentes dosis de 1, 5 y 10 ug/mL. Examinamos que las viabilidades celulares de MWCNT eran 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 y 94,1 ± 4,7 por ciento en concentraciones de 1, 5 y 10 mg/L, respectivamente; las viabilidades para el MWCNT corto se calcularon en el mismo orden y resultaron ser 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 y 98,9 ± 2,1 por ciento. Observamos que las células B16-F10 se incubaron en altas concentraciones y que la supervivencia celular de las células Hs68 fue superior al 80 por ciento, lo que sugiere que el MWCNT y el MWCNT corto no tuvieron efectos tóxicos en las células de fibroblastos dérmicos humanos. Las viabilidades celulares de GONR y GONR corto fueron 860,24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 y 90,64 ± 2,5 por ciento. También se señala en la Figura 4a que GONR y shortGONR no tenían un efecto citotóxico perceptible en las células HS68. En informes anteriores, el uso de nanomateriales no probados con fines cosméticos podía considerarse cuestionable,43,44 y generalmente se debía al ataque del ADN después de que las nanopartículas ingresaran a las células. Después de la prueba de citotoxicidad, encontramos que nuestros materiales no causaron toxicidad a las células normales de la piel. Llegamos a la conclusión de que después de que los nanomateriales entraran en las células, los nanomateriales simplemente inhibían la producción de melanina al disminuir el estrés oxidativo y quelar los iones metálicos y no dañar las mitocondrias ni el ADN, lo que significa que los MWCNT y los GONR eran seguros para su uso.

2.5. Dos tipos de MWCNT y GONR en la actividad de tirosinasa celular B16−F10 y el contenido de melanina.

En elmelaninavía de síntesis, la tirosinasa juega un papel fundamental. La tirosinasa se oxida y forma eumelanina y feomelanina a través de una serie de reacciones bioquímicas. Para determinar si los GONR y los MWCNT inhiben las actividades de la tirosinasa y provocan una disminución en la producción de melanina, analizamos la actividad de la tirosinasa en las células B16-F10. Descubrimos que los MWCNT y los MWCNT cortos inhibían la actividad de la tirosinasa en aproximadamente un 17,1 % y un 23 % a 10 mg/l. Los GONR y los GONR cortos tuvieron un mejor efecto en la supresión de la actividad tirosinasa a las mismas concentraciones en comparación con otro GONR. También dependían de la dosis e inhibieron el 49,8 % y el 44,7 % de la actividad de la tirosinasa, como se muestra en la Figura 4b.

Melaninaes un pigmento indispensable en el cuerpo humano, pero la sobreexpresión de melanina suele desencadenar una serie de enfermedades. En estudios previos, Xiao et al. usó un material similar, Radical Sponge, una nanopartícula de fullereno, como agente anti-melanina.45 Hubo algunos buenos resultados; alrededor del 20 por ciento demelaninapodría inhibirse la producción. Para mejorar su eficiencia, mejoramos aún más el material de prueba para medir la tasa de inhibición de la melanina y su mecanismo molecular, como se muestra en las Figuras 4c y 5. Los MWCNT y los MWCNT cortos redujeron el contenido de melanina en 17,6 ± 5,5 y 13,2 ± 0. 2 por ciento a 10 mg/L y de manera dependiente de la dosis. Los GONR y los GONR cortos redujeron poderosamente los valores a 32,0 ± 2,3 y 35,3 ± 3,4 por ciento a 10 mg/L. Los resultados experimentales sugirieron que los cuatro tipos podían inhibir la síntesis de melanina y los GONR tenían un efecto más fuerte. Por otro lado, también hemos observado que la GONR corta tiene un mejor efecto en la inhibición de la producción de melanina. Llegamos a la conclusión de que los GONR cortos tienen más grupos funcionales y pueden prevenir eficazmente la tirosinasa catalizada por iones metálicos, lo que inhibe aún más la producción de melanina (Figura 2). En la Tabla 1, observamos que el esfuerzo del tipo corto quelante de iones metálicos es mayor que el tipo normal; esto significa que estos GONR cortos podrían aplicarse potencialmente en el campo cosmético como agentes para el cuidado de la piel.

2.6. El mecanismo de MWCNT y GONR inhibió el contenido de melanina celular B16-F10.

Las células responden al estrés oxidativo externo regulando la expresión de proteínas. Las células B16-F10 mejoran la expresión del gen c-myc y AMPK regulada al alza para disminuir los niveles oxidativos,46 y en este trabajo, MITF es un factor de transcripción específico de tirosinas para regular la vía de la señal de síntesis de melanina molecular.47-49 En la Figura 5a, MWCNT y GONR regularon a la baja el factor de transcripción asociado a la microftalmía al reducir el estrés oxidativo, y luego, los genes TRP-1 y TRP-2 corriente abajo también se regularon a la baja. Para el nivel de proteína, se encontró un fenómeno similar, mediante el cual los MWCNT y los GONR regularon a la baja la vía de la melanogénesis relacionada con MITF y finalmente redujeron lamelaninacontenido (Figura 5b).

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3. MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

3.1. Elaboración de MWCNTs y GONRs.

El proceso relevante para hacer GONR se informó en un artículo anterior. Se suspendió 12MWCNT (0.05 g) en 9:1 H2SO4/H3PO4 y se trató con un reactor de microondas (CEM-Discover) con la potencia ajustada a 250 W durante 2 min. Después de agregar KMnO4 (0,25 g) a las soluciones, las soluciones se trataron con la misma potencia de microondas a 65 grados durante 4 min12. Luego modificamos este proceso usando un tiempo de microondas de segunda etapa más corto de 8 min utilizando un compresor de aire. Aquí, el compresor de aire se usa para controlar la temperatura del reactor de microondas durante el proceso. La potencia de microondas se fijó en 250 W en las pruebas preliminares.

3.2. Elaboración de Short MWCNTs y Short GONRs.

El proceso relevante para hacer GONR cortos se informó en nuestro artículo anterior.34 El tiempo de tratamiento ácido se eligió como 8 h. La potencia de microondas se fijó en 250 W, que es la misma que para obtener GONR.

3.3. Actividad de captación de radicales DPPH.

El DPPH se utilizó con frecuencia para decidir la capacidad depuradora de las muestras y las propiedades antioxidantes.50 El DPPH es un reactivo púrpura que cambia el color de púrpura a amarillo si el radical libre se transfiere al analito. Se añadieron a la solución muestras antioxidantes positivas con concentraciones adecuadas y las muestras se analizaron a 517 nm durante 30 min. Usamos los porcentajes del DPPH restante además de las muestras de prueba para medir el número deantioxidantesnecesarios para reducir los radicales DPPH anteriores. Como control positivo se utilizó vitamina C a 100 µM. La actividad depuradora (porcentaje) se midió como

3.4. Actividad quelante de metales.

El ion metálico es el factor que causa la oxidación excesiva de los lípidos, y el Fe2 plus es uno de los iones más influyentes.50 Se cargaron diferentes concentraciones de nanobiomateriales (1 μL) en una 96-placa de pocillos, que contenía FeCl2·4H2O 2 mM ( 10 μL), y luego se cargó en ferrozina (5 mM, 20 μL). La mezcla se combinó por completo con 69 μL de mentol y se mantuvo a temperatura ambiente durante 10 min. Luego, la solución de reacción de muestra se observó a 562 nm. Se usó EDTA como control positivo a 100 μM, y la fórmula de cálculo de la actividad quelante de metales se basó en la ecuación 1.

3.5. Poder reductor.

El cálculo del poder reductor se basa en un estudio anterior.50 Primero, se mezclaron 2,5 μL de materiales de grafeno con tampón PBS (67 mM, pH 6,8) y K3Fe(CN)6 (2,5 μL, 20 por ciento) y luego se incubaron a 50 grados durante 20 mín. Luego, se mezcló ácido tricloroacético al 10 por ciento (160 µl) con los reactivos a 300 g y se centrifugó durante 20 min. La longitud de absorción se determinó a 700 nm después de mezclar con 25 μL de FeCl3 (2 por ciento). Se utilizó hidroxianisol butilado (BHA) a 100 μM.

3.6. Exámenes de proliferación celular.

Se empleó la línea celular de fibroblastos dérmicos humanos HS68 para analizar la proporción de proliferación celular. HS68 se incubó en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía un 10 % de suero fetal bovino y una mezcla de 1 % de penicilina y estreptomicina.50,51 Después de tratarse con diferentes concentraciones de muestras, aplicamos MTT para detectar la tasa de proliferación celular. Se sembraron 8000 células en 96-placas de pocillos y se trataron con muestras durante 24 h. Se eliminó la solución sobrenadante y usamos la solución de MTT para cultivar durante 2 horas a 37 grados. Después de la incubación, se retiró el medio que contenía MTT y se disolvió con dimetilsulfóxido (DMSO). La solución se leyó a una DO de 590 nm y la velocidad se calculó mediante la ecuación 1.

3.7. Evaluación del contenido de melanina celular.

Usamos un método con modificaciones menores basado en el ensayo anterior.52,53 Se disolvieron sedimentos celulares de B16−F10 del Bioresource Collection and Research Center (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwán) en una mezcla de NaOH 2,0 N y 10 por ciento de DMSO. Posteriormente, la muestra se calentó durante 1 ha 90 grados y se centrifugó a 10,000g durante otros 10 min para obtener el sobrenadante clarificado. losmelaninael recuento se determinó controlando la DO del sobrenadante a 475 nm.

3.8. Actividad de tirosinasa celular B16-F10.

Para la actividad de la tirosinasa celular B16-F10, nos referimos al trabajo anterior con algunas modificaciones.50 Las células se cultivaron en 12-placas de pocillos con 105 células cada pocillo. Después de los tratamientos con muestras, las células se lisaron en Triton X-100/PBS al 1 por ciento y tirosina 2 mML (50 μL) durante 3 h. Después de la incubación, retiramos los medios y leímos la absorbancia a OD 590 nm. La fórmula de actividad de la tirosinasa se calculó mediante la ecuación 1.

3.9. Detección de ROS por tinción DCFDA.

En referencia al estudio anterior,54 1.2 1.105 células B16-F10 se sembraron en6-placas de pocillos y se trataron con varias concentraciones de muestras. Las células se suspendieron en PBS y luego se cargaron con DCFDA (5 μM) en DMEM sin rojo fenol durante 30 minutos a 37 grados. Se usó el citómetro de flujo (Guava, Merck, Alemania) para detectar la señal fluorescente de DCFDA. Las longitudes de onda de excitación y emisión de DCFDA fueron 488 y 535 nm, respectivamente.

3.10. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real.

Seguimos los métodos de Lin et al. (2018).1 La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) consistió en una sonda de cebador exclusiva para generar fluorescencia. Utilizó una técnica de detección de fluorescencia que detecta cada ciclo utilizando un 7500 qRT-PCRSystem (Applied Biosystems, EE. UU.). Detectó el ciclo basado en la cantidad de fluorescencia liberada, y luego se calculó el producto de cada ciclo para el contenido generado, lo que resultó en el logro de propósitos cuantitativos en tiempo real. Se usó Trizol (Invitrogen, EE. UU.) para extraer un ARN completo del tejido pulmonar, según las instrucciones dadas por el fabricante. Posteriormente, se usó un kit de transcripción inversa (Takara, Japón) para generar ADN. En la qRT-PCR usando cebadores, enumerados en la Tabla 1, primero, la muestra se calentó para formar una sola hebra de ADN; luego se realizó una unión del cebador para formar un ADN bicatenario (dsDNA), luego de lo cual se combinó SYBR Green dsDNA, para lo cual se utilizó el kit de reactivos SYBR green plus (Roche, Basilea, Suiza), que dio como resultado la liberación de fluorescencia. El resultante se pasó a través de un sistema de detección de fluorescencia. La detección de señales fluorescentes tuvo lugar durante la fase de elongación o hibridación de cada ciclo; después de la detección, las intensidades de fluorescencia detectadas empujaron hacia atrás el contenido de la muestra. .

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3.11. Prueba de Western Blot.

Las células B16-F10 se lisaron a 4 grados durante la noche con un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Thermo Scientific Co., EE. UU.), que contiene inhibidores de proteasa. Se usó el kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA, Sigma-Aldrich Corp., EE. UU.) para cuantificar la cantidad de proteína. Las proteínas de muestra se separaron en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 % y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Pall LifeScience, Ann Arbor, MI, EE. UU.). La membrana de PVDF se bloqueó con un tampón de bloqueo (Thermo Scientific) durante 1 h y se incubó con el anticuerpo primario específico durante la noche a 4 grados. A continuación, la membrana se lavó dos veces con tampón Tween 20 con solución salina tamponada con Tris y se incubó con anticuerpos secundarios durante 1,5 h. Después de eso, la membrana se sumergió en reactivos de detección de quimioluminiscencia (Thermo Scientific) y se analizó con un generador de imágenes de quimioluminiscencia MiniChemi (Beijing Sage Creation Science, China). Las fuentes de anticuerpos incluyeron anti-MITF de conejo, anti-TRP de conejo-1, anti-TRP de conejo-2 y actina (Thermo Scientific).

3.12. Análisis de materiales.

Se utilizó TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) para observar la morfología del nanocarbono. Se aplicó un espectrómetro Amicro Raman (PTT, RAMaker) para verificar los modos de resonancia del nanocarbono. También se llevaron a cabo medidas de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) para determinar el análisis composicional.

3.13. Análisis estadístico.

Todas las muestras y experimentos estándar se repitieron al menos tres veces. Aplicamos la prueba t de Student para comparar y expresar estadísticamente el promedio de los valores medios ± desviación estándar.

4. CONCLUSIONES

En resumen, observamos que el GONR corto era un material potencial para la producción de productos para el cuidado de la piel debido a sus múltiples propiedades biofuncionales (Figura 6). Los resultados mostraron que el nanocarbono desempeñó un papel como antioxidante extracelular e intracelular. Mientras tanto, el nanocarbono inhibió la actividad tirosinasa y lamelaninacontenido y no causó ningún daño grave a las células pigmentarias. Este trabajo estableció las funciones anti-melanogénesis de cuatro tipos de nanocarbono; los estudios futuros examinarán el mecanismo de estos compuestos en expresiones específicas de genes y proteínas relacionadas con la maduración, el transporte y la acumulación de melanina.

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