Carvedilol, un bloqueador adrenérgico, suprime la síntesis de melanina al inhibir la vía de señalización CAMP/CREB en melanocitos humanos y cultivo de piel humana ex vivo

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1,Youngsup Song 3,*,‡ y Sung Eun Chang 1

Resumen:Las catecolaminas funcionan a través de receptores acoplados a proteína G, lo que desencadena un aumento en los niveles intracelulares de 30, 50-monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) en varias células. La biosíntesis de catecolaminas y el receptor -adrenérgico existen enmelanocitos; por lo tanto, las catecolaminas pueden desempeñar funciones críticas en la pigmentación de la piel. Sin embargo, su acción y los mecanismos que median la melanogénesis en la piel humana aún no se han investigado. Por lo tanto, examinamos el efecto antimelanogénico potencial del carvedilol, un bloqueador no selectivo con actividades de bloqueo 1-débiles. Carvedilol redujo el contenido de melanina y la actividad de tirosinasa celular sin comprometer la viabilidad celular en seres humanos normalesmelanocitosasí como en melanocitos de ratón inmortalizados con Mel-Ab. Carvedilol disminuyó el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF), tirosinasa, proteína relacionada con tirosinasa (TRP)-1 y TRP-2. El tratamiento con carvedilol condujo a la regulación a la baja de la proteína de unión al elemento fósforo-cAMPresponse (CREB). Además, el aumento de los niveles de AMPc tras el tratamiento con forskolina revirtió la acción antimelanogénica del carvedilol. Además, carvedilol redujo notablemente el índice de melanina en cultivos de piel humana irradiados con luz ultravioleta. En conjunto, nuestros resultados indican que el carvedilol suprime eficazmente la melanogénesis en humanos.melanocitosy piel humana ex vivo mediante la inhibición de la señalización de cAMP/proteína quinasa A/CREB. Los efectos antimelanogénicos del carvedilol tienen un significado potencial para la pielblanqueoagentes

Palabras clave:carvedilol; bloqueador adrenérgico;síntesis de melanina; Señalización de AMPc/CREB

Cistanchees capaz de inhibir la síntesis de melanina

1. Introducción

Una amplia gama de trastornos pigmentarios de la piel tiene un impacto psicológico y social significativo en los pacientes. Se han desarrollado varias modalidades de tratamiento, incluidos agentes sistémicos y tópicos, así como terapia con láser [1–3]. Sin embargo, los resultados son a menudo insatisfactorios y las reacciones adversas, como la hiperpigmentación posinflamatoria (PIH) y la hipopigmentación, del tratamiento son comunes. Además, el tratamiento es costoso y requiere mucho tiempo [4–6].

Las catecolaminas, que incluyen dopamina, epinefrina y norepinefrina, son moléculas de señalización que actúan como neurotransmisores y hormonas endocrinas. En la piel, la biosíntesis y la degradación de las catecolaminas ocurren en los queratinocitos humanos, pero la síntesis de catecolaminas en los melanocitos es algo diferente [7-9]. Las catecolaminas funcionan a través de receptores acoplados a proteína G (GPCR). La unión de las catecolaminas a los GPCR desencadena la activación de la adenilatociclasa intracelular, que sintetiza 30, 50-monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) a partir de ATP [10]. El segundo mensajero cAMP ejerce su actividad uniéndose a la subunidad R de la proteína quinasa A (PKA), lo que resulta en la fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta cAMP (CREB). Los GPCR son activados por aminas y péptidos, incluidos el glucagón, la hormona paratiroidea, la secretina y la calcitonina [10].

Los antagonistas de los receptores adrenérgicos incluyen los antagonistas de los receptores β y β. -Los antagonistas de los receptores se subcategorizan en agentes no selectivos, 1-selectivos y 2-selectivos, mientras que los antagonistas de los receptores se subclasifican en no selectivos, 1-selectivos y 2-selectivos. agentes basados ​​en sus actividades de bloqueo selectivo. A diferencia de los antagonistas de los receptores no selectivos de primera generación, como el propranolol, el timolol y el nadolol, el carvedilol es un bloqueador no selectivo de tercera generación que muestra acciones vasodilatadoras al bloquear los 1-adrenorreceptores (1-AR) [11]. Por lo tanto, carvedilol es un bloqueador no selectivo con 1-actividades de bloqueo débiles [12]. Se usa principalmente como medicamento oral para controlar la presión arterial alta y la enfermedad cardíaca congestiva, similar a otros bloqueadores [12]. Sin embargo, los bloqueadores de tercera generación exhiben actividades angiogénicas, antioxidantes, antiproliferativas, antihipertróficas y antiapoptóticas que requieren mayor aclaración [11]. En el campo dermatológico, debido a sus acciones antioxidantes y antiinflamatorias, el carvedilol se usa a menudo en formulaciones orales para tratar la rosácea eritematotelangiectásica [13,14]. Además, la actividad antioxidante del carvedilol da como resultado la prevención de la carcinogénesis de la piel inducida por los rayos ultravioleta (UV), lo que lo convierte en un agente atractivo para el tratamiento de las enfermedades cutáneas asociadas a los rayos UV [15–18]. Sin embargo, los efectos quimiopreventivos de carvedilola no están mediados directamente por los RA. [19] Aunque el mecanismo exacto es relativamente desconocido, la vía de señalización de cAMP/PKA y PKC-δ podría estar relacionada con las propiedades del carvedilol contra la metástasis cutánea [20].

En las primeras etapas de la investigación de la pigmentación, humanosmelanocitosse encontró que expresaban señalización -1-AR después de la inducción extracelular con norepinefrina. Sin embargo, no se encontraron AR después de la estimulación con señalización adrenérgica enmelanocitos[8]. Por el contrario, Cillbro et al. más tarde demostró que existe una señal 2-AR funcional específica en los melanocitos humanos y que la 2-estimulación AR conduce a la pigmentación a través de la vía 2-AR/cAMP [7]. Por lo tanto, se sugirió el papel de las catecolaminas en el control de la pigmentación, y el AMPc se considera el eje principal para el control de la melanogénesis por parte de las catecolaminas.

La melanogénesis es un proceso complejo que involucra numerosas vías. La tirosinasa, la proteína 1 relacionada con la tirosinasa (TRP-1) y la TRP-2, también llamada dopacromo tautomerasa (DCT), son las tres principales enzimas específicas de los melanocitos involucradas ensíntesis de melanina[21]. Numerosos factores inducen o inhiben la melanogénesis, incluidas hormonas, citocinas, neurotransmisores, factores de crecimiento y micromoléculas [21–23].

El regulador positivo más importante es el receptor de melanocortina-1 y sus ligandos, melanocortinas y hormona adrenocorticotrópica [23]. Sin embargo, los factores misceláneos involucrados en la melanogénesis son la endorfina, los estrógenos, los andrógenos, la vitamina D3 y las catecolaminas [23]. La evidencia acumulada ha sugerido que la L-tirosina y la L-DOPA, que son sustratos e intermediarios de la melanogénesis, actúan como inductores y reguladores positivos de la vía melanogénica, además de reguladores de otras funciones celulares [24]. Además, Jeff Howe et al. sugirió que la inducción y regulación de la melanogénesis por la L-tirosina está mediada por la activación directa de los receptores adrenérgicos por la L-tirosina, más que por sus productos metabólicos como las catecolaminas [25]. En sus estudios, la norepinefrina y la epinefrina estimularon la actividad de la tirosinasa, pero su efecto inductivo sobresíntesis de melaninafue comparativamente inferior a la L-tirosina [25].

Las catecolaminas pueden desempeñar funciones importantes en el sistema de pigmentación de la piel; sin embargo, aún no se han explorado sus efectos sobre la melanogénesis con respecto a la acción de los bloqueadores no selectivos de tercera generación. Por lo tanto, en el presente estudio, nuestro objetivo fue investigar si el carvedilol afecta la melanogénesis y explorar sus mecanismos de acción en humanos.melanocitosy piel humana ex vivo y su uso potencial comoblanqueoproducto.

inhibir la formación de melanina conhierbas cistanches

2. Resultados

2.1. Carvedilol suprime la melanogénesis

La citotoxicidad del carvedilol contra humanos normalesmelanocitos(NHM) y células Mel-ab se evaluaron mediante un ensayo de proliferación celular WST. Una concentración de carvedilol de 10 µM comenzó a mostrar citotoxicidad contra las células NHM y Mel-ab (Figura 1A, B). Por lo tanto, en evaluaciones posteriores, usamos 8 µM de carvedilol, que no es citotóxico para los NHM.

El tratamiento con carvedilol disminuyó el contenido de melanina de manera dependiente de la dosis sin afectar la viabilidad de los NHM (Figura 1C). El contenido de melanina se redujo en un 28,36 por ciento después de 96 horas de tratamiento con carvedilol 8 µM (Figura 1C). La adición de 100 mg/mL de arbutina redujo el contenido de melanina en menor grado que el carvedilol (Figura 1C). Después de 4 días de tratamiento con carvedilol, el contenido de melanina disminuyó de manera dependiente del tiempo (Figura 1D). Sin embargo, el tratamiento con forskolina (FSK) durante 4 días después del pretratamiento con carvedilol indujo un aumento en el contenido de melanina (Figura 1E). FSK aumenta la transcripción de MITF en su mayor grado a las 2 h en los NHM y se cree que funciona a través del AMPc. vía /PKA/CREB (Figura 1F).

2.2. Carvedilol inhibe la expresión de MITF y sus genes diana y disminuye los niveles de fosfo-CREB en NHM

Debido a que carvedilol disminuyó la acumulación de melanina, investigamos la actividad de la tirosinasa celular. El tratamiento con carvedilol disminuyó la actividad de la tirosinasa celular de manera dependiente de la dosis en los NHM (Figura 2A). La actividad de tirosinasa disminuyó un 28,48 por ciento después de 96 h de tratamiento con carvedilol 8 µM (Figura 2A). A continuación, determinamos si el carvedilol afecta la expresión de MITF, que desempeña un papel crucial en la regulación de la tirosinasa y los genes melanogénicos aguas abajo. El tratamiento con FSK aumentó los niveles de cAMP intracelular y revirtió las acciones antimelanogénicas del carvedilol. Carvedilol redujo significativamente los niveles de proteína de MITF, un factor de transcripción central de la melanogénesis, a las 72 h (Figura 2B). Además, la expresión de sus genes diana, como tirosinasa y TRP-1, disminuyó después del tratamiento con carvedilol (Figura 2B). Estos resultados indican que el carvedilol inhibe la melanogénesis al regular a la baja la señalización de MITF.

A continuación, investigamos las vías de señalización intracelular de la melanogénesis, que regulan la transcripción de MITF, midiendo los niveles de expresión de fosfo-CREB y fosfo-ERK. Los niveles de fosfo-ERK no cambiaron con el tiempo después del tratamiento con carvedilol; sin embargo, los niveles de fosfo-CREB estaban disminuidos (Figura 2B). De acuerdo con las observaciones anteriores, nuestros resultados revelaron que carvedilolin inhibe la melanogénesis al inhibir la vía de señalización cAMP/PKA/CREB. Además, el tratamiento con FSK revirtió la acción antimelanogénica del carvedilol al aumentar los niveles de AMPc.

2.3. Índice de melanina y tinción inmunohistoquímica en cultivo de piel humana ex vivo

La densidad de melanocitos epidérmicos y el índice de melanina en secciones de tejido de cultivo de piel humana ex vivo se detectaron mediante tinción de Melan-A y Fontana-Masson, respectivamente. Carvedilol no afectó el número de Melan-A (más)melanocitosen la muestra tratada con carvedilol más radiación UV (UVR) en comparación con la muestra tratada solo con UVR (Figura 3A). Los melanocitos HMB45( plus ) pueden indicar que la actividad melanocítica aumentó con el tratamiento con UVR y se reguló inversamente después del tratamiento con carvedilol (Figura 3B). Sin embargo, el contenido de melanina se redujo significativamente en las muestras tratadas con carvedilol más UVR en comparación con las muestras tratadas solo con UVR (Figura 3C). Para calcular el índice de melanina, se calculó y comparó la fracción del área teñida de Fontana-Masson sobre el área total entre un espécimen expuesto a UVR y el carvedilol más UVR (Figura 3D). Los lisados ​​celulares de cada espécimen se analizaron mediante Western blotassay, que reveló que la tirosinasa, TRP1 y DCT aumentaron con la UVR y disminuyeron con el tratamiento con carvedilol (Figura 3E). Como resultado, carvedilol redujo notablemente el índice de melanina y las proteínas relacionadas con la melanogénesis, mostrando su efecto antimelanogénico en la piel humana tratada con UVR.

3. Discusión

La melanina es el pigmento responsable del color de la piel y el cabello y se sintetiza en los melanosomas pormelanocitos. Aunque la melanina epidérmica desempeña un importante papel protector contra la RUV, la sobreproducción y acumulación de melanina en la piel provoca trastornos hiperpigmentarios cutáneos problemáticos, como PIH, despigmentación asociada al fotoenvejecimiento, melasma y lentigos solares [18,26]. Por lo tanto, la inhibición de la melanogénesis ha sido el foco de los tratamientos medicinales y cosméticos para la belleza y la salud de la piel. Se han realizado esfuerzos considerables para identificar agentes antipigmentación nuevos y eficaces. Sin embargo, los mecanismos anti-melanogénesis de los agentes específicos son actualmente inciertos y generalmente se han evaluado en células de ratón, lo que arroja resultados que no siempre son consistentes con los de los ensayos en piel humana [27,28]. Además, dado que la melanogénesis de los melanocitos está estrechamente regulada por los queratinocitos y otras células vecinas, las células humanas cocultivadas o la piel humana ex vivo son escenarios experimentales más confiables para la exploración de métodos efectivos.blanqueoagentes [29]. La mayoría de los agentes blanqueadores de la piel, ya sean de origen natural o químico, pueden causar toxicidad o irritación en la piel, lo que se puede predecir hasta cierto punto utilizando ensayos de viabilidad celular in vitro con melanocitos. En nuestro estudio, carvedilol no mostró citotoxicidad cuando se usó en dosis moderadas.

bienfaits de cistanche

Las cremas tópicas de hidroquinona pueden provocar trastornos de hipopigmentación no deseados y toxicidad cutánea [30–32]. Además, algunosblanqueolos cosméticos tienen consecuencias desastrosas al inducir hipopigmentación a través de la degradación de las proteínas tirosinasa [33–35]. Los agentes blanqueadores se pueden usar en dosis más altas dependiendo del usuario para maximizar el blanqueamiento de las lesiones hiperpigmentarias. Por lo tanto, los esfuerzos para descubrir agentes blanqueadores de la piel seguros y saludables están continuamente bajo exploración.

Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para llevarse a cabo en células humanas normales y piel humana ex vivo. Además, con base en el mecanismo de acción establecido de las catecolaminas de la señalización G, que aumenta el nivel de AMPc celular, creemos que un bloqueador adrenérgico podría disminuir los niveles de AMPc e inhibir la vía de señalización UVR/cAMP/CREB, que es el mecanismo principal para la hiperpigmentación de la piel inducida por UV [36,37]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los bloqueadores adrenérgicos que disminuyen los niveles de cAMP reducensíntesis de melanina.

Además, para desarrollarblanqueoParalelamente, deben buscarse mecanismos confiables y reproducibles de antimelanogénesis. El estímulo fisiológicamente más significativo es UV, y entre la señalización de UVR a epidérmicamelanocitos, el eje CREB es la vía más establecida para la regulación de la melanogénesis en la epidermis humana [29]. La exposición a los rayos UV activa sucesivamente la producción de AMPc, PKA y el factor de transcripción CREB, que, a su vez, induce la expresión de MITF y genes melanogénicos diana aguas abajo [38,39]. Además de la fosforilación de CREB por PKA, estudios recientes han demostrado que el reclutamiento del coactivador de transcripción regulado por CREB (CRTC) 3 al complejo de transcripción CREB también es necesario para MITF estimulado por AMPc. MITF desempeña el papel más esencial en la regulación desíntesis de melaninay la transcripción resultante de enzimas melanogénicas [26,40,41]. Durante este proceso de señalización intracelular, la melanogénesis está regulada por una enzima clave, la tirosinasa, y proteínas enzimáticas adicionales, como TRP-1 y DCT [1–4]. En el presente estudio, carvedilol redujo efectivamente la fosforilación de CREB, que indica que redujo las proteínas MITF y tirosinasa al inhibir la transcripción de MITF (Figura 4). Teniendo en cuenta que la regulación del gen del ARNm de MITF está intrincadamente controlada y rescatada por otras moléculas de señalización intracelular y coactivadores, la regulación del nivel transcripcional de MITF es una estrategia prometedora para explorar ingredientes saludables para blanquear la piel porque la función de supervivencia de MITF se preserva y rescata [1,38,40]. De hecho, cuando investigamos la transcripción de MITF inducida por FSK, se descubrió que el ARNm de MITF tenía su propia curva de respuesta máxima para la melanogénesis y la supervivencia celular para la homeostasis celular. Las funciones biológicas demelanocitosparecía estar intrínsecamente regulado por otras señales de retroalimentación en los melanocitos humanos. Además, carvedilol tiene un menor riesgo de eventos adversos de hipopigmentación, ya que atenúa la actividad de la tirosinasa celular con el tiempo, en lugar de hacerlo de manera abrupta.

Las catecolaminas incluyen dopamina, epinefrina y norepinefrina y se sintetizan a partir de la tirosina de la dieta mediante la acción de enzimas [42]. La biosíntesis y degradación de las catecolaminas ocurre en una amplia variedad de células, incluidas las neuronas de los nervios simpáticos y el cerebro, las células adrenomedulares, las células endoteliales, los neutrófilos y las células mononucleares [43–45]. En la piel humana, la síntesis de catecolaminas se produce en los queratinocitos. Por el contrario, los melanocitos también expresan ARNm y enzimas para la síntesis autocrina de norepinefrina pero no de epinefrina [7,42]. en humanosmelanocitos, -1-AR puede ser importante en la reacción a la norepinefrina, perosíntesis de melaninatambién está influenciado por 2-ARsignaling funcional [7,8]. Curiosamente, los pacientes con vitíligo han aumentado la 2-densidad de AR en los queratinocitos [46]. Se encuentran niveles elevados de norepinefrina en la orina y el plasma de pacientes con vitíligo no segmentario, lo que implica que el metabolismo de las catecolaminas puede estar asociado con el desarrollo y la progresión del vitíligo. [47]. Además, además de los neurotransmisores de estrés clásicos, los melanocitos producen neuropéptidos y hormonas, como el factor liberador de corticotropina y la proopiomelanocortina. Esta producción es estimulada por la RUV y otros agentes que actúan dentro del sistema neuroendocrino de la piel [48]. Por lo tanto, la acción de las catecolaminas y la función melanocítica están estrechamente relacionadas en una variedad de vías complejas. Además, el carvedilol podría interferir con las reacciones químicas en la vía melanogénica y esta posibilidad debe estudiarse más a fondo. El carvedilol puede tener ventajas, ya que tiene efectos antiinflamatorios simultáneos, ya que la mayoría de los trastornos hiperpigmentarios son PIH clínica o subclínica en pacientes de piel oscura. Dado que la penetración del carvedilol a través de la piel se ha estudiado tanto in vitro como ex vivo, el carvedilol se puede desarrollar como medicamento tópico.blanqueoagente en el futuro [49-51].

La administración sistémica de carvedilol puede causar bradicardia, mareos, hipotensión, dolores de cabeza y aturdimiento. La aplicación tópica de carvedilol no suele causar síntomas sistémicos, sin embargo, debemos prestar mucha atención a estos síntomas cuando se aplica a pacientes con barreras cutáneas defectuosas, como aquellos con dermatitis atópica. Además, en casos raros se informan eccema, prurito y erupción liquenoide cuando se toma carvedilol. Estos efectos secundarios dermatológicos, así como la dermatitis de contacto, también deben tenerse en cuenta al aplicar carvedilol como tratamiento tópico.blanqueoagente.

En conclusión, mostramos que el carvedilol redujo efectivamente la melanogénesis en humanosmelanocitosy piel humana ex vivo mediante la inhibición de la vía cAMP/CREB/MITF, lo que sugiere su uso potencial como agente blanqueador eficaz. Debe seguir una investigación adicional sobre la participación funcional del receptor adrenérgico por parte del carvedilol en los melanocitos humanos.

4. Materiales y Métodos

4.1. Materiales

El carvedilol, 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA), la toxina del cólera (CT) y el 12-otetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) se adquirieron de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco se adquirieron de WelGENE (Daegu, Corea). El suero bovino fetal (FBS), el antibiótico-antimicótico y la tripsina-EDTA se adquirieron de Gibco (Grand Island, NY, EE. UU.). Medio 254 (CascadeBiologics, Portland, OR, EE. UU.) y FSK ([3R-(3 ,4a ,5 ,6 ,6a ,10 ,10a ,10b )]-5-(acetiloxi)-3-etenildodecahidro{ {24}},10,10b-trihidroxi-3,4a,7,7,10a-pentametil-1H-nafto[2,1-b]pirano-1-ona ) se adquirieron de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido).

4.2. Líneas celulares y cultivo celular

Los NHM primarios obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.) se mantuvieron en Medio 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, EE. UU.) complementado con suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (Thermo Fisher). Las células Mel-ab, una línea celular de melanocitos inmortalizados espontáneamente derivada de ratón, se obtuvieron del Korean Cell Line Bank (KCLB, Seúl, Corea) y se mantuvieron en DMEM complementado con 10 por ciento de FBS, penicilina-estreptomicina, 100 nM TPA y 1 nM CONNECTICUT. Todas las células se mantuvieron de forma rutinaria a 37 ◦C en un ambiente humidificado con un 5 por ciento de CO2.

4.3. Anticuerpos y Western blot

Las células se lavaron una vez con PBS frío y se lisaron en tampón de lisis de proteínas (1 por ciento de SDS en 10 mMTris y EDTA 5 mM, pH 7,4), seguido de incubación a 98 ◦C durante 10 min. Las muestras de proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 8 %, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, EE. sometido a inmunotransferencia. Los anticuerpos tirosinasa y TRP-1 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EE. UU.), y MITF se adquirió de Abcam (Cambridge, Reino Unido). -tubulina (Gentex, Holanda, MI, EE. UU.) se utilizó como control de carga interna.

4.4. Contenido de melanina

El efecto citotóxico del carvedilol se evaluó utilizando el kit de ensayo de viabilidad celular Ez-Cytox (Dogen-Bio Co., Ltd., Seúl, Corea) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sembraron células Mel-Ab y NHM en placas de seis pocillos. a una densidad de 6 × 105 y 3 × 105 células/pozo, respectivamente. Las células se trataron con carvedilol, como se muestra en las figuras, durante 3 o 5 días (d). Antes de medir el contenido de melanina, las células se observaron con un microscopio de contraste de fase y se fotografiaron (Olympus, Tokio, Japón). Las células se disolvieron en 550 µL de NaOH 1 N a 100 ◦C durante 30 min y se centrifugaron a 13,000 rpm durante 5 min. La absorbancia de los sobrenadantes se midió a 405 nm mediante un lector de microplacas. El contenido de melanina intracelular se presentó como un porcentaje relativo al control de las células no tratadas. Se usó arbutina (100 mg/mL) como control positivo.

4.5. Actividad de tirosinasa celular

La actividad de tirosinasa se evaluó midiendo la tasa de formación de dopacromo de L-DOPA. Después de la incubación con carvedilol, las células se lavaron en PBS helado y se lisaron en tampón de lisis de tirosinasa (tampón de fosfato, pH 6,8, que contenía 1 por ciento de Triton X{ {5}}) con ciclos repetidos de congelación/descongelación. Los lisados ​​se clarificaron por centrifugación a 15,000 rpm a 4 ◦C durante 10 min. Después de cuantificar los niveles de proteína del lisado y ajustar las concentraciones de proteína con tampón de lisis, se incubaron 90 µL de sobrenadante mezclados con 10 µL de L-DOPA 10 mM en tampón de lisis de tirosinasa a 37 ◦C. La actividad de tirosinasa celular se midió leyendo la absorbancia a 475 nm utilizando un lector de microplacas cada 10 min durante al menos 1 h. Se utilizó arbutina (100 mg/ml) como agente de control positivo.

hierbas cistanches

4.6. Análisis inmunohistoquímico

Se cortaron tejidos de piel humana embebidos en parafina en secciones de 6-µm de espesor y se tiñeron con Melan-A (Novocastra, Newcastle, Reino Unido), kits Fontana-Masson (ID labs, Londres, ON, Canadá) y HMB45 (Santa Clara , CA, EE. UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El índice de melanina se determinó midiendo el porcentaje de área teñida con respecto al área total de tejido utilizando el software ImageJ 1.52a (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.).

4.7. Análisis estadístico

Los datos se presentan como medias ± error estándar de la media (SEM), y la significancia estadística se determinó mediante una prueba t de Student no pareada utilizando el software GraphPad Prism5 (San Diego, CA, EE. UU.). En este estudio, p < 0.05,="" p="">< 0.01="" y="" p="">< 0.001="" se="" consideraron="" estadísticamente="" significativos="" y="" están="" representados="" por="" *,="" **="" y="" ***,="">

Referencias

1. Gillbro, JM; Olsson, MJ La melanogénesis y los mecanismos de los agentes para aclarar la piel: enfoques existentes y nuevos. En t. J. Cosmet. ciencia 2011, 33, 210–221. [Referencia cruzada] [PubMed]

2. Lee, YJ; espinilla, HJ; No, conocimientos tradicionales; Choi, KH; Chang, SE Tratamiento del melasma y la hiperpigmentación posinflamatoria con un láser de alejandrita de picosegundo 755-nm en pacientes asiáticos. Ana. Dermatol. 2017, 29,779–781. [Referencia cruzada] [PubMed]

3. Lee, YJ; Parque, JH; Lee, DY; Lee, JH Despigmentación bilateral adquirida en la cara y el cuello: enfoques clínicamente apropiados. J. Korean Med. ciencia 2016, 31, 2042–2050. [Referencia cruzada] [PubMed]

4. Kang, HJ; Na, JI; Lee, JH; Roh, MR; Ko, JY; Chang, SE Hiperpigmentación posinflamatoria asociada con el tratamiento de lentigos solares usando un láser Q-Switched 532-nm Nd: YAG: una encuesta multicéntrica.J. Dermatólogo. Tratar. 2017, 28, 447–451. [Referencia cruzada] [PubMed]

5. Kato, H.; Araki, J.; Eto, H.; Doi, K.; Hirai, R.; Kuno, S.; Higashino, T.; Yoshimura, K. Un estudio prospectivo, aleatorizado y controlado del ácido tranexámico oral para prevenir la hiperpigmentación posinflamatoria después del láser de rubí Q-switched. Dermatol. Cirugía 2011, 37, 605–610. [Referencia cruzada] [PubMed]

6. Taylor, CR; Anderson, RR Tratamiento ineficaz del melasma refractario y la hiperpigmentación posinflamatoria mediante láser de rubí Q-switched. J. Dermatol. Cirugía oncol. 1994, 20, 592–597. [Referencia cruzada]

7. Gillbro, JM; Marles, LK; Hibberts, NA; Schallreuter, KU La biosíntesis de catecolaminas autocrinas y la señal del adrenoceptor beta promueven la pigmentación en los melanocitos epidérmicos humanos. J. Investig. Dermatol.2004, 123, 346–353. [Referencia cruzada]

8. Schallreuter, KU; Korner, C.; Pittelkow, MR; Swanson, NN; Gardner, ML La inducción del sistema de transducción de señales de los adrenoceptores alfa-1-en melanocitos humanos. Exp. Dermatol. 1996, 5, 20–23. [Referencia cruzada]

9. Sivamani, RK; Shi, B.; Griffiths, E.; Vu, SM; Lev-Tov, HA; Dahle, S.; Chigbrow, M.; La, TD; Mashburn, C.;Peavy, TR; et al. La herida aguda altera la señalización beta2-adrenérgica y las vías sintéticas de catecolaminas en los queratinocitos. J. Investig. Dermatol. 2014, 134, 2258–2266. [Referencia cruzada]

10. Emery, receptores de catecolaminas AC: prototipos para el descubrimiento de fármacos basados ​​en GPCR. Adv. Farmacol. 2013, 68,335–356.

11. Vale, GT; Cerón, CS; Gonzaga, NA; Simplicio, JA; Padovan, JC Three Generations of beta-blockers: History, Class Differences, and Clinical Applicability. actual hipertensos. Rev. 2019, 15, 22–31. [PubMed]

12. McTavish, D.; Campoli-Richards, D.; Sorkin, EM Carvedilol: Una revisión de sus propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas y eficacia terapéutica. Drogas 1993, 45, 232–258. [Referencia cruzada] [PubMed]

13. Hsu, CC; Lee, JY Enrojecimiento facial pronunciado y eritema persistente de la rosácea tratados eficazmente con carvedilol, un bloqueador beta-adrenérgico no selectivo. Mermelada. Academia Dermatol. 2012, 67, 491–493. [Referencia cruzada][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. Manejo a largo plazo del enrojecimiento facial distintivo y el eritema persistente de la rosácea mediante el tratamiento con carvedilol. J. Dermatólogo. Tratar. 2018, 29, 310–313. [Referencia cruzada] [PubMed]

15. Chang, A.; Yeung, S.; Thakkar, A.; Huang, KM; Liu, MM; Kanassatega, RS; Parsa, C.; Orlando, R.;Jackson, EK; Andresen, BT; et al. Prevención de la carcinogénesis cutánea por el bloqueador beta carvedilol. CáncerPrev. Res. 2015, 8, 27–36. [Referencia cruzada] [PubMed]

16. Chen, M.; Liang, S.; Shahid, A.; Andresen, BT; Huang, Y. El bloqueador beta carvedilol evitó el daño mediado por rayos ultravioleta de las células epidérmicas murinas y la piel humana reconstruida en 3D. En t. J.Mol. ciencia 2020, 21, 798. [Referencia cruzada] [PubMed]

17. Huang, KM; Liang, S.; Yeung, S.; Oiyemhonlan, E.; Cleveland, KH; Parsa, C.; Orlando, R.; Meyskens, FL, Jr.; Andresen, BT; Huang, Y. El carvedilol aplicado tópicamente atenúa la carcinogénesis de la piel inducida por la radiación ultravioleta solar. cáncer anterior Res. 2017, 10, 598–606. [Referencia cruzada]

18. Brenner, M.; Audición, VJ El papel protector de la melanina contra el daño de los rayos UV en la piel humana. Photochem.Photobiol. 2008, 84, 539–549.

19. Cleveland, KH; Liang, S.; Chang, A.; Huang, KM; Chen, S.; Guo, L.; Huang, Y.; Andresen, BT Carvedilolinhibits JB6 P mediada por EGF más la formación de colonias a través de un mecanismo independiente de adrenoceptors.PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [Referencia cruzada]

20. Dzong, G.; Zhongbing, M.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Carvedilol suprime la migración y la invasión de células mamarias malignas al inactivar Src que involucra la vía de señalización de AMPc/PKA y PKCdelta. J. Cáncer Res. Ther.2014, 10, 998–1003.

21. Rzepka, Z.; Bussman, E.; Beberok, A.; Wrzesniok, D. De la tirosina a la melanina: vías de señalización y factores que regulan la melanogénesis. Postepy Hig. Medicina. Dosw. En línea 2016, 70, 695–708. [Referencia cruzada]

22. Kim, Y.; Cho, JY; Oh, SO; Kang, M.; Lee, SE; Jung, E.; Parque, YS; Lee, J. La adiponectina globular actúa como una señal melanogénica en los melanocitos epidérmicos humanos. Hermano J. Dermatol. 2018, 179, 689–701. [Referencia cruzada][PubMed]

23. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentación de melanina en la piel de los mamíferos y su regulación hormonal. Fisiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [PubMed]

24. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirosina y L-dihidroxifenilalanina como reguladores similares a hormonas de las funciones de los melanocitos. Res. de melanoma de células pigmentarias. 2012, 25, 14–27. [Referencia cruzada] [PubMed]

25. Howe, J.; Constantino, R.; Slominski, A. Sobre el mecanismo putativo de inducción y regulación de la melanogénesis por L-tirosina. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150–152.

26. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Vías de señalización en la melanogénesis. En t. J.Mol. ciencia 2016, 17, 1144. [Referencia cruzada]

27. Jung, JA; Kim, BJ; Kim, MS; Tú, HJ; Yoon, ES; Dhong, ES; Parque, SH; Kim, DW Efecto protector de la toxina botulínica contra la pigmentación de la piel inducida por los rayos ultravioleta. plástico Reconstr. Cirugía 2019, 144, 347–356. [Referencia cruzada]

28. Jeong, YM; Oh, WK; Tran, TL; Kim, WK; Cantado, SH; Bae, K.; Lee, S.; Sung, JH Aglicona de Rh4 inhibe la síntesis de melanina en células de melanoma B16: posible participación de la vía de la proteína quinasa A. Biosci. Biotecnología. Bioquímica 2013, 77, 119–125. [Referencia cruzada]

29. Kim, YH; Kim, D.; Hong, AR; Kim, JH; Yoo, H.; Kim, J.; Kim, I.; Kang, SO; Chang, SE; Song, Y. Potencial terapéutico de Rottlerin para los trastornos hiperpigmentarios de la piel mediante la inhibición de la actividad transcripcional de los coactivadores de transcripción regulados por CREB. J. Investig. Dermatol. 2019, 139, 2359–2367.e2.[Referencia cruzada]

30. Das, A.; Ghosh, A.; Kumar, P. Leucodermia química por hidroquinona: un fenómeno inusual. Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. 2019, 85, 567. [Referencia cruzada]

31. Jow, T.; Hantash, BM Despigmentación inducida por hidroquinona: reporte de un caso y revisión de la literatura. Dermatitis 2014, 25, e1–e5. [Referencia cruzada]

32. Kersey, P.; Stevenson, CJ Vitíligo y exposición ocupacional a la hidroquinona por el mantenimiento de máquinas de autofotografía. Póngase en contacto con Dermato. 1981, 7, 285–287. [Referencia cruzada] [PubMed]

33. Sasaki, M.; Kondo, M.; Sato, K.; Umeda, M.; Kawabata, K.; Takahashi, Y.; Suzuki, T.; Matsunaga, K.;Inoue, S. Rhododendron, un compuesto fenólico que induce la despigmentación, ejerce citotoxicidad en los melanocitos a través de un mecanismo dependiente de tirosinasa. Res. de melanoma de células pigmentarias. 2014, 27, 754–763. [Referencia cruzada] [PubMed]

34. Yoshikawa, M.; Sumikawa, Y.; Hida, T.; Kamiya, T.; Kase, K.; Ishii-Osai, Y.; Kato, J.; Kan, Y.; Kamiya, S.;Sato, Y.; et al. Análisis clínico y epidemiológico en 149 casos de leucodermia inducida por rododendro.J. Dermatol. 2017, 44, 582–587. [Referencia cruzada] [PubMed]

35. Harris, JE Vitíligo inducido por sustancias químicas. Dermatol. clin. 2017, 35, 151–161. [Referencia cruzada] [PubMed]

36. Li-Sha, G.; Yi-He, C.; Na-Dan, Z.; Teng, Z.; Yue-Chun, L. Efectos del tratamiento con carvedilol en la expresión y fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta cAMP cardiaca en la miocarditis aguda inducida por el virus coxsackievirus B3-. BMC Cardiovasc. Desorden. 2013, 13, 100. [Referencia cruzada] [PubMed]

37. Zhang, F.; Los polimorfismos Steinberg, SF S49G y R389G del receptor beta(1)-adrenérgico influyen en la señalización a través de las vías cAMP-PKA y ERK. Fisiol. genoma 2013, 45, 1186–1192. [Referencia cruzada]

38. Lee, AY; Noh, M. La regulación de la melanogénesis epidérmica a través de las vías de señalización de cAMP y/o PKC: Perspectivas para el desarrollo de agentes hipopigmentados. Arco. Farmacia Res. 2013, 36, 792–801. [Referencia cruzada]

39. García-Borrón, JC; Abdel-Malek, Z.; Jimenez-Cervantes, C. MC1R, la ruta del cAMP y la respuesta a los rayos UV solares: extendiendo el horizonte más allá de la pigmentación. Res. de melanoma de células pigmentarias. 2014, 27, 699–720. [Referencia cruzada]

40. Lin, CB; Babiarz, L.; Liebel, F.; precio de Roydon, E.; Kizoulis, M.; Gendimenico, GJ; Fisher, DE; Seiberg, M.La modulación de la expresión génica del factor de transcripción asociado a la microftalmia altera la pigmentación de la piel.J. investigando Dermatol. 2002, 119, 1330-1340. [Referencia cruzada]

41. Kim, JH; Hong, AR; Kim, YH; Yoo, H.; Kang, SO; Chang, SE; Song, Y. JNK suprime la melanogénesis al interferir con la expresión MITF dependiente del coactivador de transcripción regulado por CREB 3-. Theranostics2020, 10, 4017–4029. [Referencia cruzada] [PubMed]

42. Ríos, M.; Habecker, B.; Sasaoka, T.; Eisenhofer, G.; Tian, ​​H.; Landis, S.; Chikaraishi, D.; Roffler-Tarlov, S. La síntesis de catecolaminas está mediada por tirosinasa en ausencia de tirosina hidroxilasa. J. Neurosci. 1999, 19, 3519–3526. [Referencia cruzada] [PubMed]

43. Cosentino, M.; Mariño, F.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Síntesis, metabolismo, almacenamiento y absorción de catecolaminas endógenas en neutrófilos humanos. Ciencias de la vida 1999, 64, 975–981. [Referencia cruzada]

44. Mariño, F.; Cosentino, M.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Síntesis de catecolaminas endógenas, almacenamiento metabólico y absorción en células mononucleares de sangre periférica humana. Exp. Hematol.1999, 27, 489–495. [Referencia cruzada]

45. Sorrento, D.; Santulli, G.; Del Giudice, C.; Anastasio, A.; Trimarco, B.; Iaccarino, G. Las células endoteliales son capaces de sintetizar y liberar catecolaminas tanto in vitro como in vivo. Hipertensión 2012, 60, 129–136.[CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; Fratini, P.; Santagostino, G.; Preda, S.; Orecchia, G. Las catecolaminas aumentan en la orina del vitíligo no segmentario, especialmente durante su fase activa. Res. de células de pigmento 2003, 16, 111–116. [Referencia cruzada][PubMed]

47. Salzer, BA; Schallreuter, KU Investigación de la estructura de la personalidad en pacientes con vitíligo y posible asociación con alteración del metabolismo de las catecolaminas. Dermatología 1995, 190, 109–115. [Referencia cruzada][PubMed]

48. Slominski, A. Actividad neuroendocrina del melanocito. Exp. Dermatol. 2009, 18, 760–763. [Referencia cruzada]

49. Gannu, R.; Vishnu, YV; Kishan, V.; Rao, YM Permeación in vitro de carvedilol a través de la piel porcina: Efecto de los vehículos y potenciadores de la penetración. PDA J. Pharm. ciencia Tecnología 2008, 62, 256–263.

50. Kshirsagar, SJ; Bhalekar, MR; Mohapatra, SK Desarrollo y evaluación del sistema de administración transdérmica de fármacos cargado con carvedilol: estudio de caracterización in vitro e in vivo. Desarrollo de drogas Industria Farmacéutica 2012,38, 1530–1537. [Referencia cruzada]

51. Tanwar, YS; Chauhan, CS; Sharma, A. Desarrollo y evaluación de parches transdérmicos de carvedilol. Acta Pharm. 2007, 57, 151–159. [Referencia cruzada] [PubMed]