Una estrategia de detección de patógenos innatos que involucra la ubiquitinación de las proteínas de la superficie bacteriana Parte 2

DISCUSIÓN

Los metazoos utilizan la ubiquitinación como un mecanismo versátil para mantener la homeostasis citosólica, evitando la acumulación de proteínas/orgánulos dañados y defendiéndose contra los patógenos invasores (40, 41). Dada la variedad de patógenos y los diversos conjuntos de proteínas dañadas encontradas, la identificación de motivos comunes para el reconocimiento de sustratos y la posterior ubiquitinación representa una estrategia inteligente para la optimización de recursos. Las proteínas en las células eucariotas que están destinadas a la proteólisis se identifican típicamente por un motivo de grado tripartito (24).

La inmunidad es la capacidad del cuerpo para combatir enfermedades, incluidas las respuestas a bacterias, virus y otras sustancias dañinas. Si el sistema inmunológico del cuerpo está comprometido, no será lo suficientemente fuerte para hacer frente a la embestida de la enfermedad. Los estudios han demostrado que la desnutrición tiene un impacto en la función del sistema inmunológico, lo que hace que el cuerpo sea más susceptible a infecciones y enfermedades. La proteína es una de las sustancias importantes para mantener la inmunidad.

Las proteínas están hechas de aminoácidos, algunos de los cuales se llaman aminoácidos esenciales porque deben ser proporcionados por los alimentos y no pueden ser sintetizados por el cuerpo. Estos aminoácidos esenciales incluyen triptófano, leucina, fenilalanina, lisina, isoleucina, metionina, valina e histidina. Si el cuerpo no obtiene suficientes aminoácidos esenciales, puede provocar un deterioro del metabolismo de las proteínas, lo que puede afectar la función del sistema inmunológico.

Además, una ingesta de proteínas de alta calidad ayuda a mantener un sistema inmunológico y funciones corporales normales. Cuando el cuerpo carece de proteínas, puede llevar a un sistema inmunológico comprometido y el cuerpo es más susceptible a las enfermedades. Si el cuerpo humano carece de proteínas durante mucho tiempo, puede causar daños a largo plazo en el sistema inmunológico, lo que hace que las personas sean susceptibles a diversas enfermedades.

Por ello, una dieta equilibrada y un ejercicio adecuado son las claves para mantener el aporte proteico. Las personas pueden satisfacer las necesidades de proteínas de su cuerpo al comer más alimentos ricos en proteínas, como carne, aves, pescado, frijoles, huevos, productos lácteos, granos, nueces y semillas. Además, el ejercicio moderado también puede aumentar la demanda del cuerpo de proteínas y la eficiencia de absorción. Una dieta equilibrada y variada y un estilo de vida saludable son las claves para mantener la inmunidad, mantener el cuerpo sano y estable y resistir la invasión de enfermedades. Desde este punto de vista, necesitamos mejorar nuestra inmunidad. Cistanche puede mejorar significativamente la inmunidad porque los polisacáridos de la carne pueden regular la respuesta inmunitaria del sistema inmunitario humano, mejorar la capacidad de estrés de las células inmunitarias y mejorar la inmunidad de las células inmunitarias. Efecto bactericida.

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Esto nos llevó a explorar si se podían encontrar motivos similares en las superficies de los patógenos, donde podrían funcionar como un representante para el reconocimiento del sustrato. Aquí, demostramos que las ligasas de ubiquitina del huésped usan firmas moleculares similares para detectar patógenos filogenéticamente distintos. El reconocimiento de patógenos a través de patrones/motivos moleculares comunes (PAMP) es una característica bien caracterizada de la inmunidad innata (42). Nuestros resultados sugieren que las secuencias similares a degron dentro de las proteínas de la superficie bacteriana actúan de manera equivalente a los PAMP, para impartir vigilancia de patógenos intracelulares. Este modus operand podría ser explotado aún más por el huésped para la presentación de antígenos de proteínas microbianas en el complejo mayor de histocompatibilidad I para inducir una fuerte respuesta de CD8 dirigida contra patógenos intracelulares.

La importancia potencial de la detección de patógenos mediada por ubiquitina para las defensas del huésped se destaca aún más por la ubiquitinación residual sustancial detectada en SPN mutantes que carecen tanto de BgaA como de PspA. Esto indica que hay más sustratos no identificados de la maquinaria de ubiquitina, con la redundancia resultante que garantiza una intercepción sólida de patógenos. En particular, algunas preguntas inmediatas sobre el motivo degron y su importancia para la bacteria (aparte de ser una unidad reconocible) proporcionan un ángulo evolutivo interesante.

El motivo degron es prescindible in vivo y, en todo caso, mutar o eliminar el motivo mejoró la persistencia intracelular, lo que resultó en una mayor virulencia. Esto está respaldado por nuestros resultados de que los patógenos podrían usar la mutación en el motivo degron para escapar del reconocimiento mediado por ubiquitina como se ve para el serotipo 19F de SPN. Sin embargo, la naturaleza conservada del motivo degron en BgaA en la mayoría de los serotipos de SPN podría sugerir una contraestrategia adoptada por las bacterias para ser menos letal para el huésped.

Esto podría brindar una oportunidad para que el patógeno aumente sus hábitats ocupables. Al mismo tiempo, la ubiquitinación de la superficie bacteriana o las proteínas secretadas en el motivo degron podría modularlas funcionalmente para amortiguar o reconfigurar la respuesta del huésped para un beneficio eventual (43). Por lo tanto, la presencia o ausencia de dominios o motivos funcionales de tipo eucariótico (como los degrones) podría depender de un nicho patógeno y estar adaptado para evadir o modular las respuestas inmunitarias del huésped.

Un mecanismo de detección de patógenos similar que involucra proteínas de unión a guanilato también se ha implicado en la eliminación bacteriana; sin embargo, a diferencia de la ubiquitinación, se informa que su función está restringida a patógenos gramnegativos (44–47). La ubiquitinación se dirige al patógeno independientemente de su origen Gram, por ejemplo, se ha documentado que RNF213 se dirige a Listeria spp. independientemente de la ausencia de LPS (48). Nosotros, por lo tanto, no eliminamos la posibilidad de su acción antimicrobiana contra SPN también.

Una superficie patógena puede ser ubiquitinada con múltiples tipos de cadena por diferentes ligasas E3 con interacciones entre cadenas (41). En particular, en el caso de Mtb, se ha demostrado que Smurf1 y Parkin forman tipos de cadena K48 y K63 que funcionan sinérgicamente para degradar el patógeno (12). La comprensión del papel mecánico de la ubiquitinación de K48 y las ligasas E3 involucradas durante los escenarios de infección aún no se ha estudiado. En el caso de STm, se ha descrito que una sola ligasa E3 ARIH1 se dirige a STm citosólico con cadenas de ubiquitina K48 que conducen a su eliminación del sistema (15). Según nuestros hallazgos y los de otros, los patógenos marcados con K48-Ub finalmente se degradan mientras se asocian con la maquinaria proteasómica.

Sin embargo, este estudio muestra la decoración K48-Ub de proteínas superficiales bacterianas específicas. Se sabe que algunos patógenos modifican activamente sus proteínas de superficie, protegiéndolas de la ubiquitinación y posterior muerte, lo que enfatiza la importancia de la localización superficial del sustrato de ubiquitina (10). Además, múltiples patógenos intracelulares obligados han desarrollado estrategias para desubiquitinarse a sí mismos, o albergar componentes reguladores, para evadir la eliminación mediada por ubiquitina (5). Juntos, estos hallazgos subrayan la importancia de la activación de la alarma mediada por la ubiquitina como un mecanismo fundamental de detección de patógenos intracelulares central para las defensas del huésped.

Nuestro estudio demostró además el papel central de la ligasa SCF E3, particularmente con FBXW7, en la ubiquitinación bacteriana que aumenta la degradación de patógenos. Las mutaciones heterocigotas en FBXW7, particularmente la variante R505C (un residuo crítico en el bolsillo de reconocimiento de sustrato), desencadenan múltiples carcinomas y leucemia linfocítica en humanos (49, 50). Un estudio reciente basado en una cohorte indicó que casi el 43 % de los pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC) sucumben a la neumonía bacteriana y la sepsis, seguidas de las infecciones fúngicas (51).

Esto corrobora nuestra observación de la capacidad anulada de las células huésped que portan la mutación FBXW7 para detectar y eliminar patógenos. Nuestros hallazgos, por lo tanto, brindan una explicación molecular inesperada del mayor riesgo de infecciones en pacientes con CLL. El vínculo entre el polimorfismo genético en los genes de la ligasa E3 y la susceptibilidad a las infecciones bacterianas también está corroborado por los pacientes con enfermedad de Parkinson, que son vulnerables a la fiebre tifoidea o la lepra (14), lo que sugiere la notable contribución de las ligasas E3 en la inmunidad del huésped contra las infecciones bacterianas y el mantenimiento de estado estacionario celular.

En conclusión, desciframos un lenguaje universal de detección de patógenos que habitan en el citosol que el huésped podría aplicar de manera eficiente para reconocer microorganismos para su posterior eliminación. En conjunto, estos hallazgos arrojan luz sobre la comprensión de los procesos inmunitarios celulares rudimentarios, que podrían aprovecharse para intensificar la inmunidad antibacteriana.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo de células

Tanto la línea celular de carcinoma alveolar de pulmón humano (neumocito tipo II) A549 [Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) no. CCL185)] y la línea celular de adenocarcinoma cervical HeLa (ATCC no. CRM-CCL-2) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; HiMedia) suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (Gibco) a 37 grados y 5 por ciento de CO2.

Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano

SPN (R6, serotipo 2, obsequio de Tim J. Mitchell, Universidad de Birmingham, Reino Unido) se cultivó en caldo Todd-Hewitt complementado con extracto de levadura al 1,5 por ciento a 37 grados en CO2 al 5 por ciento. Se usaron los siguientes antibióticos para desarrollar cultivos de SPN cuando fue necesario: kanamicina (200 ug/ml), espectinomicina (100 ug/ml) y cloranfenicol (4,5 ug/ml). Novecientos microlitros de 0,4 OD600 (densidad óptica a 600 nm) se mezclaron con 600 ul de glicerol estéril al 80 por ciento (32 por ciento de concentración final de glicerol) y se almacenaron en un congelador de -80 grados. Estos stocks de glicerol se usaron como inóculo de partida para todos los experimentos.

Se sembraron cultivos de Escherichia coli DH5 y STm (ATCC 14028) en caldo Luria-Bertani (LB) a 37 grados bajo condiciones de agitación (200 rpm), y cuando fue necesario se utilizaron los siguientes antibióticos: kanamicina (50 ug/ml), espectinomicina (100 ug/ml), cloranfenicol (20 ug/ml) y ampicilina (100 ug/ml). Para todos los ensayos de infección, las bacterias se cultivaron hasta una DO600 de ~0,4, seguido de una resuspensión en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una densidad similar antes de infectar las células huésped.

Detección de proteínas diana de ubiquitina putativas

Todas las proteínas de superficie presentes en el proteoma STm y SPN se identificaron por primera vez a partir de la literatura publicada. Se obtuvieron secuencias de proteínas completas de las proteínas de superficie de UniProt, que luego se usaron para identificar la presencia de motivos degron. Se seleccionó un conjunto de 29 motivos de grado putativos de la literatura publicada (24, 52, 53) y la base de datos de motivos lineales eucariotas. El módulo regex de Python se utilizó para identificar la ubicación de todos estos motivos seleccionados en las secuencias de proteínas de superficie. Se realizó además una búsqueda lineal para identificar la presencia de un residuo de lisina cercano (de 8 a 14 residuos de aminoácidos) a cada motivo de grado identificado. Se supone que este residuo de lisina actúa como sitio de unión para el resto de ubiquitina. Por último, las secuencias de proteínas preseleccionadas se introdujeron en IUPred (54), una herramienta de predicción de estructura de proteínas, para localizar la presencia de una región desordenada entre el motivo degron y la lisina proximal. Las proteínas resultantes (BgaA y PspA para SPN y RlpA para STm) se seleccionaron para evaluarlas como dianas de ubiquitinación y decodificar su función en la eliminación de patógenos.

Construcción de cepas bacterianas

El intercambio alélico por recombinación homóloga se llevó a cabo utilizando regiones flanqueantes de genes que portaban un casete de antibiótico insertado para la generación de cepas mutantes tanto en SPN como en STm (tabla S2).

Para SPN, las regiones aguas arriba y aguas abajo de 500-pb de bgaA, pspA y sus genes se amplificaron a partir del genoma con cebadores apropiados (tabla S3) y se ensamblaron en el vector pBKS. Después de la clonación de estos fragmentos, se insertó en esta construcción un casete de resistencia a antibióticos (espectinomicina para bolsa, así como pspA y cloranfenicol para hysA). Luego, los plásmidos recombinantes linealizados se transformaron en WT SPN usando el péptido estimulante de la competencia 1 (GenPro Biotech), los recombinantes se seleccionaron usando los antibióticos respectivos y el reemplazo del gen se confirmó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación de los respectivos loci del gen. Para STm, se utilizó el método de la recombinasa roja λ para la generación de mutantes por deleción génica (55).

Brevemente, se agregaron secuencias homólogas a los extremos del gen de la cuerda en las secuencias del cebador que se usan para la amplificación del casete de resistencia a la kanamicina. A continuación, el casete se sometió a electroporación en la cepa WT STm y los knockouts generados por recombinación homóloga se seleccionaron en función de la resistencia a la kanamicina. La eliminación del gen se confirmó mediante PCR y secuenciación del locus del gen. Se clonaron pspA, hysA y una bgaA-T truncada (1 a 3168 pb) de longitud completa bajo el promotor P23 en el vector lanzadera pIB166 (56) y se usaron para la complementación.

Estos plásmidos recombinantes también se utilizaron para la mutagénesis dirigida al sitio para generar diferentes variantes de bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R y bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R y pspAΔDegron ) y his (hysADegron-BgaA e hysADegron-PspA) usando conjuntos de cebadores apropiados (tabla S3) y transformados en mutantes ΔbgaA y ΔpspA. Todos los clones fueron verificados por secuenciación de ADN. La expresión de diferentes variantes de BgaA, PspA e HysA se confirmó mediante transferencia de Western usando anticuerpos apropiados.

Anticuerpos y reactivos

Suero anti-enolasa y anti-PspA (S. Hammerschmidt, Universidad de Greifswald, Alemania); suero anti-BgaA (S. King, The Ohio State University, EE. UU.); y anticuerpos específicos para His6 (Invitrogen, MA1-21315), enlace K48-Ub (Millipore, 05-1307), enlace K63-Ub (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (Millipore, MAB374), GSK3 [Tecnología de señalización celular (CST), D5C5Z], fosfotreonina (CST, 9381S), IgA, Kappa de mieloma murino, clon TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) y PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: anti-conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (BioLegend, 406401), anti-ratón marcado con HRP (BioLegend 405306), anti-conejo Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-conejo Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), inmunoglobulina A anti-ratón conjugada con biotina (Life Technologies, M31115), anti-ratón Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anti-ratón Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), anti-cabra Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082) y FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Expresión y purificación de proteínas.

BgaA-T y sus variantes se clonaron en pET28 usando sitios de restricción Xba I/Not I. Los plásmidos recombinantes que codifican BgaA-T con etiqueta His N-terminal se transformaron en células E. coli BL21 (DE3) para la expresión de proteínas. Las colonias recién transformadas se cultivaron en LB que contenía kanamicina (50 ug/ml) a 37 grados en una incubadora con agitación durante 12 horas. Se añadió uno por ciento del cultivo primario a 1 litro de caldo LB y se incubó a 37 grados en una incubadora con agitación hasta que la OD600nm alcanzó entre 0,6 y 0,8. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de 100 μM de isopropil- -D-tiogalactopiranósido (IPTG) y el crecimiento adicional del cultivo a 37 grados durante 5 a 6 horas con agitación a 150 rpm.

Las células se recogieron por centrifugación a 6000 rpm durante 10 min a 4 grados. El sedimento celular se resuspendió en tampón A [tris 25 mM (pH 8,0) y NaCl 300 mM] y se lisó mediante sonicación. Los restos celulares se separaron por centrifugación (14, 000 rpm, 50 min, 4 grados) y el sobrenadante se aplicó a una columna de Ni-NTA, equilibrada con tampón A. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón A, y las proteínas etiquetadas con His se eluyeron con imidazol (250 mM) en tampón A. Todas las variantes de BgaA-T se expresaron y purificaron usando el mismo procedimiento. FBXW7 se subclonó en el vector pGEX-4 T-1 que tiene una etiqueta de glutatión S-transferasa (GST) N-terminal del vector pCMV6-Entry-FBXW7 utilizando la enzima de restricción Eco RI.

FBXW7 marcado con GST se expresó en células E. coli BL21 (DE3) después de la inducción de la expresión de proteínas con 0.1 mM IPTG y crecimiento a 30 grados durante 4 horas. GST-FBXW7 del extracto crudo de E. coli se purificó mediante cromatografía en columna de glutatión-sefarosa (GE HealthCare). Las fracciones que contenían proteínas purificadas se agruparon y concentraron hasta 0,5 mg/ml utilizando un filtro de corte de peso molecular de 10-kDa (Amicon) mediante centrifugación a 4700 rpm a 4 grados. La pureza de las proteínas se comprobó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) seguida de tinción con azul de Coomassie.

Transfecciones de células huésped

BgaA-T se clonó en el vector inducible por doxiciclina pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene n.º 130261) usando un kit de clonación por infusión (Takara). Se confirmó un clon positivo por secuenciación de Sanger. La mutación FBXW7R505C se llevó a cabo mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando pMRX-GFP-FBXW7 como plantilla y se confirmó mediante secuenciación de Sanger. Todas las transfecciones se realizaron utilizando el reactivo Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), y las selecciones se realizaron en presencia de clorhidrato de blasticidina (2 ug/ml; HiMedia).

Eliminación de genes dirigidos por siRNA

Para la eliminación de genes específicos mediada por interferencia de ARN, se usaron los siguientes siRNA: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) y siGSK3 (Dharmacon ONTARGET SMARTpool L-003010-00-0005). Brevemente, las células A549 cultivadas en una placa de 24-pocillos se transfectaron transitoriamente con siRNA específicos de genes o scramble (siControl) (150 pmol) usando Lipofectamine 3000 según las instrucciones del fabricante. Treinta y seis horas después de la transfección, las células se procesaron para ensayos de transferencia de Western e inmunofluorescencia o protección de penicilina-gentamicina.

Predicción y modelado de estructuras

Todas las estructuras fueron predichas por AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) y visualizadas usando PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC). Las estructuras se codificaron por colores en PyMol en función de las puntuaciones de IUPred (54) que van desde ordenado (azul) a desordenado (rojo) pasando por blanco.

transferencia occidental

Los cultivos de SPN que crecieron a {{0}}.4 OD600nm se lisaron mediante sonicación y los extractos crudos se recolectaron después de la centrifugación (15,000 rpm, 30 min, 4 grados). Para A549, las monocapas se lavaron varias veces con PBS y se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) enfriado con hielo [tris-Cl 50 mM (pH 7,89), NaCl 150 mM, Triton X al 1 por ciento-100, sodio al 0,5 por ciento desoxicolato y SDS al 1 por ciento] que contiene un cóctel inhibidor de proteasa (Promega), fluoruro de sodio (10 mM) y EDTA (5 mM). La suspensión celular se sonicó brevemente y se centrifugó para recoger los lisados ​​celulares. Las proteínas presentes en lisados ​​bacterianos o de células A549 (10 ó 20 ug) se separaron en geles SDS-PAGE al 12 por ciento y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno activado. Después del bloqueo en leche desnatada al 5 por ciento, las membranas se probaron con anticuerpos primarios y secundarios marcados con HRP apropiados. Las transferencias se desarrollaron finalmente utilizando un sustrato de quimioluminiscencia mejorado (Bio-Rad).
Ensayo de protección de penicilina-gentamicina

Las cepas SPN cultivadas hasta una DO600nm 0.4 en caldo Todd-Hewitt suplementado con 0.2 por ciento de extracto de levadura (THY) se sedimentaron, se resuspendieron en PBS ( pH 7,4), y se diluyó en medio de ensayo para infección de monocapas de A549 con una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Después de 1 hora de infección, las monocapas se lavaron con DMEM y se incubaron con un medio de ensayo que contenía penicilina (10 ug/ml ) y gentamicina (400 ug/ml) durante 2 horas para matar el SPN extracelular. A continuación, las células se lisaron con Triton X-100 al 0,025 por ciento y el lisado se sembró en placas de agar con infusión de cerebro y corazón para enumerar SPN viables. El porcentaje de invasión se calculó como [unidades formadoras de colonias (UFC) en el lisado/UFC utilizadas para la infección] × 100. Para evaluar la supervivencia intracelular, 9 horas después de la infección (desde el comienzo del tratamiento con penicilina-gentamicina), se prepararon lisados ​​celulares como mencionado anteriormente, y se enumeraron las bacterias sembradas y supervivientes. La eficiencia de supervivencia (porcentaje) se representó como un cambio de veces en el porcentaje de supervivencia en relación con el control en el punto de tiempo indicado (normalizado a 0 horas).

inmunofluorescencia

Para el ensayo de inmunofluorescencia, se cultivaron células A549 o HeLa en cubreobjetos de vidrio y se infectaron con cepas SPN o STm a una MOI ~25 durante 1 hora, seguido de un tratamiento con antibióticos durante 2 horas. En los puntos de tiempo deseados después de la infección (9 horas para la infección con SPN en A549 y 3 horas para la infección con STm en HeLa), las células se lavaron con DMEM y se fijaron con metanol enfriado con hielo a -20 grados durante 10 min. Además, los cubreobjetos se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 3 por ciento en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente (RT). A continuación, las células se trataron con un anticuerpo primario adecuado en BSA al 1 % en PBS durante la noche a 4 ºC, se lavaron con PBS y se incubaron con un anticuerpo secundario adecuado en BSA al 1 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Por último, los cubreobjetos se lavaron con PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio junto con VECTASHIELD con o sin 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Vector Laboratories) para su visualización usando un microscopio confocal de barrido láser (LSM 780, Carl Zeiss ) con objetivos de petróleo de 40× o 63×. Las imágenes se adquirieron después del corte óptico y luego se procesaron con el software ZEN lite (versión 5.0). La microscopía de superresolución se realizó de manera similar utilizando Elyra 7 (Carl Zeiss) en modo SIM. Para el análisis de colocalización, las bacterias se puntuaron mediante conteo visual de n > 100 bacterias por réplica.

Microscopio de transmisión por electrones

Después de la infección con SPN y STm, las células se lavaron con {{0}}tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, se fijaron con glutaraldehído al 2,5 por ciento (Sigma-Aldrich) en 0tampón de cacodilato de sodio 0,1 M ( Sigma-Aldrich) durante 3 horas a 4 grados. Después de la fijación, las células se recogieron a través de un raspador de células y se sedimentaron a 2000 rpm durante 10 min. A continuación, las células se lavaron con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M y se fijaron posteriormente con tetróxido de osmio al 1 por ciento en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante 20 minutos a 4 grados. Después de lavados posteriores con tampón de cacodilato y agua destilada, las células se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol (50, 70, 95 y 100 por ciento) y óxido de propileno durante 30 minutos y finalmente se incluyeron en resina epoxi (Electron Microscopy Sciences, 14300) por polimerización a 75 grados durante 45 min. Posteriormente, las cápsulas se transfirieron a un horno a 95 grados durante 45 min. Se cortaron secciones ultrafinas (70 nm) con un cuchillo de diamante en un ultramicrótomo Leica EM UC7 y se tiñeron con acetato de uranilo al 2 % y citrato de plomo al 1 % y se observaron con un microscopio electrónico de transmisión (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) a 120 KV.

Ubiquitinación ex vivo

A549-que expresa BgaA-T y sus variantes se trataron con MG132 (5 μM), y se indujeron las expresiones de proteína con doxiciclina (100 ug/ml) durante 24 horas. A continuación, las células se lisaron en tampón RIPA y las muestras se sometieron a electroforesis mediante SDS-PAGE (8 por ciento). La confirmación de la expresión de proteínas y la ubiquitinación de BgaA-T y sus variantes se demostró mediante transferencia de Western después de sondear con anticuerpos anti-BgaA y anti-K48-Ub, respectivamente.

Ubiquitinación in vitro

Para los ensayos de ubiquitinación in vitro, las proteínas recombinantes se purificaron como se describió anteriormente (58). El complejo de ligasa SCFFBW7 E3 se incubó con 00,1 mM E1 recombinante (UBE1; Boston Biochem), 00,25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) y ubiquitina (2,5 ug/ml; Boston Biochem) en presencia de BgaA-T purificada y sus variantes. Las reacciones de ubiquitilación se realizaron en tampón de ensayo [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM trifosfato de adenosina (ATP), 1 mM -mercaptoetanol y 0,1 por ciento de Tween 20] durante 2 horas a 25 grados. . Las reacciones se detuvieron con tampón Laemmli 5x, se resolvieron en geles SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-BgaA.

Ensayo de quinasa in vitro

Para realizar el ensayo de quinasa in vitro, se usó el sistema de enzimas de quinasa GSK3 (Promega) según el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones. Brevemente, se agregaron 3 ug de BgaA-T recombinante a 0.5 ug de GSK3 activa con ATP 400 μM en tampón de reacción compuesto por tris 40 mM (pH 7.5), MgCl2 20 mM , BSA (0,1 mg/ml) y ditiotreitol 50 µM. La reacción se incubó durante 2 horas a 30 grados y se detuvo añadiendo 1x tampón Laemmli. Luego, las muestras se hirvieron y se sometieron a electroforesis para transferencia Western como se mencionó anteriormente. Se detectó BgaA-T fosforilada con un anticuerpo anti-fosfotreonina.

modelo in vivo

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 por ciento del peso corporal inicial y secreción nasal u ocular pronunciada. Las muestras de sangre se obtuvieron mediante punción cardíaca bajo anestesia terminal y los bazos se extirparon post mortem para la enumeración bacteriana. Las muestras de tejido se procesaron con un homogeneizador de tejido manual y los homogeneizados se diluyeron en serie en PBS antes de colocarlos en placas de agar sangre. Las placas se incubaron durante la noche a 37 grados, 5 por ciento de CO2 y se evaluó el número de colonias bacterianas al día siguiente.

análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism versión 5 para el análisis estadístico. Las pruebas estadísticas realizadas para experimentos individuales se mencionan en las respectivas leyendas de las figuras. P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se probaron para la normalidad y para definir la varianza de cada grupo probado. Todos los análisis multiparamétricos incluyeron correcciones para comparaciones múltiples y los datos se presentan como medias ± DE a menos que se indique lo contrario.

REFERENCIAS Y NOTAS

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