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Mi Young Ahn1*, Ban Ji Kim1, Ha Jeong Kim1, Jae Sam Hwang1, Yi-Sook Jung2 y Kun-Koo Park3

Cistanche tiene un efecto antienvejecimiento.

Resumen

Antecedentes: Este estudio tuvo como objetivo evaluar laantienvejecimientoefecto de un compuesto derivado de insectos recién preparado, glicosaminoglicano de escarabajo pelotero (GAG), administrado por vía intraperitoneal a ratas SD viejas como parte de su dieta durante 1 mes. Se encontró que la administración de GAG ​​de insectos estaba relacionada con una reducción en el daño oxidativo, los niveles de biomarcadores hepatocelulares, el contenido de carbonilo de proteínas y la concentración de malondialdehído. losantienvejecimientoLos mecanismos genéticos moleculares relacionados con el escarabajo pelotero GAG aún no se han dilucidado por completo.

Resultados: Catharsius molossus (un tipo de escarabajo pelotero) GAG (CaG) poseídoantienvejecimientoactividades; redujo el nivel sérico de creatinina quinasa, tuvo actividades vasorrelajantes aórticas y acciones cardioprotectoras, y mantuvo un nivel de glucosa normal en las ratas tratadas. El análisis de micromatrices se realizó con una matriz de conjuntos de clones de ADNc de 30 K de rata para identificar los perfiles de expresión génica de ratas SD de 14-meses de edad tratadas con glucosaminoglucano de escarabajo pelotero 5 mg/kg (CaG5) durante un 1- período de un mes, que se hizo para investigar suantienvejecimientoefecto en comparación con el de Bombus ignitus (un tipo de abejorro) reina GAG 5 mg/kg (IQG5) o condroitín sulfato 10 mg/kg. CaG5 e IQG5 tuvieron marcados efectos antiinflamatorios, provocando la inhibición de los valores de ácidos grasos libres, ácido úrico, sGPT, IL-1 beta y CK. Además, se observaron efectos anticoagulantes y antitrombóticos: la concentración del factor 1 (fibrinógeno) aumentó en el plasma de rata tratado con CaG. El grupo de ratas tratadas con CaG5-, en comparación con el control, mostró una regulación al alza de 131 genes, incluida la lipocalina 2 (Lbp) y un inhibidor de la serina peptidasa, Kaszal type3 (Spink3), y 64 genes regulados a la baja, incluida la lisil oxidasa (Lox ), serina deshidratasa (sds) y retinol saturasa (Retsat).

Conclusión: Nuestros datos sugieren que el glicosaminoglicano del escarabajo coprófago puede ser un tratamiento útil para ratas ancianas, lo que indica su potencial como biomaterial terapéutico para el envejecimiento.

Palabras clave: Efecto antienvejecimiento, Escarabajo pelotero (Catharsius molossus), Reina de B. ignitus, Glicosaminoglicano

Fondo

empleados, a modo de purificación, extracción e identificación de componentes activos potentes, como alimentos o fármacos funcionales. Los extractos del escarabajo coprófago Catharsius molossus, que se encuentra en China, mostraron una marcada actividad fibrinolítica y efectos antioxidantes y antihiperglucémicos en ratas alimentadas con una dieta rica en grasas [9, 10]. El contenido de carbonilo de proteínas de la sangre y la concentración de malondialdehído del tejido hepático tratado con etanol de escarabajo coprófago o extracto de acetona durante un período de 1- meses, se redujeron significativamente en comparación con los controles [10]. Recientemente, se descubrió que un péptido del escarabajo coprófago coreano, LLCIALRKK-NH2, que es un péptido {{12}mer derivado de Copris tripartitus Coprisin, ejerce actividad bactericida contra E. coli y actividad antimicrobiana al causar daño severo al ADN. , que induce una muerte similar a la apoptosis [11]. Un producto apícola, el extracto de alcohol de B. ignitus queen (BIQ) tiene la eficacia potencial más alta entre todos los extractos de abejorro probados para tratar la inflamación en ratas SD, ya que redujo significativamente el edema de la pata [12]. Entonces, preparamos GAG derivados del mayor número adquirible de reinas de C. molossus o B. ignitus para probar suantienvejecimientopropiedades. El envejecimiento implica una disminución progresiva de la capacidad fisiológica de un organismo, y se manifiesta por alteraciones acumuladas y desestabilización a nivel de todo el sistema [13]. El envejecimiento también se asocia con un patrón de expresión génica diferencial que indica una menor respuesta al estrés entre los genes metabólicos y biosintéticos [14]. En particular, un aumento del tejido adiposo visceral relacionado con la edad o la obesidad suele ir acompañado de una inflamación crónica de bajo grado, que se ha postulado como causa de varias enfermedades metabólicas, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y, sobre todo, el tipo dos diabetes [15]. Estos GAG de insectos se pueden utilizar en un campo de rápido desarrollo con la perspectiva de utilizar la ingeniería de tejidos y los biomateriales como terapias novedosas [16].

En este estudio, informamos que GAG ​​de escarabajos peloteros y BIQ mostraronantienvejecimientopropiedades y, por lo tanto, estos compuestos tienen grandes promesas para su uso comoantienvejecimientoagentes Además, demostramos el valor potencial del glicosaminoglicano del escarabajo coprófago C. molossus para disminuir los aspectos nocivos del envejecimiento, medidos tanto en el suero como en los patrones de expresión génica de ratas SD de 14-meses de edad después del tratamiento durante 1 mes.

Métodos

Materiales

Preparación de glicosaminoglicanos de insectos

Se compró C. molossus seca en un mercado local en China; El abejorro (reina de Bombus ignitus) fue criado y liofilizado en el Departamento de Biología Agrícola de la Academia Nacional de Ciencias Agrícolas de Corea del Sur. El sulfato de condroitina y todos los reactivos fueron suministrados por Sigma Aldrich (St. Louis, Mo., EE. UU.).

Cada uno de los insectos secos de un kilogramo (1 kg) se empapó y se extrajo tres veces con etanol mediante ultrasonificación (Branson, Colorado, MI, EE. UU.) durante 30 min. Los residuos separados de los extractos alcohólicos se desengrasaron dos veces con 2 volúmenes de acetona. Se suspendieron aproximadamente 200 g de polvo seco, desgrasado y pulverizado en 2 L de tampón de carbonato de sodio 0,05 M (pH 9). La suspensión se incubó durante 48 horas a 60 grados después de agregar 28 ml (1,4 por ciento) de Alcalase (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.). La mezcla de digestión se enfrió a 4 grados y se añadió ácido tricloroacético a una concentración final del 5 por ciento. La muestra se mezcló, se dejó reposar durante 1 h y luego se centrifugó durante 30 min a 8000 × g (Hanil Science Industrial, Incheon, Corea del Sur). Se añadieron tres volúmenes de acetato de potasio al 5 por ciento en etanol a un volumen de sobrenadante. Después de mezclar, la suspensión se almacenó durante la noche a 4 grados y luego se centrifugó. El precipitado de 20 g se disolvió en 40 ml de NaCl 0,2 M y se centrifugó. Se añadió cloruro de cetilpiridinio (5 por ciento) a 0,2 veces el volumen del sobrenadante y el precipitado se recogió por centrifugación. El precipitado se disolvió en 20 ml de NaCl 2,5 M. Se añadieron cinco volúmenes de etanol y el precipitado se separó por centrifugación. El precipitado se disolvió en agua y se dializó frente a 100 volúmenes de agua [17], y el glicosaminoglicano crudo dializado se liofilizó para obtener aproximadamente 1,1 g de CaG, 4,89 g de IQG en forma de polvo. El GAG bruto se cargó en una columna de cromatografía en gel DEAE Sephadex A-25 (40 x 1,2 cm) equilibrada con tampón de fosfato 50 mM (pH 7,4). Las fracciones se eluyeron utilizando un gradiente lineal de cloruro de sodio de 0 a 2,5 M de NaCl en tampón de fosfato a un caudal de 20 ml/h, y el glucano dializado se liofilizó hasta obtener GAG puro.

animales

Se suministraron ratas Sprague Dawley (SD) (macho), de 8- meses de edad, de Samtako Co. Ltd. (Osan, Corea). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las Directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Ético de Animales de Laboratorio de la Academia Nacional de Ciencias Agrícolas, RDA, Corea del Sur (NAAS1503) y siguieron las pautas nacionales para el cuidado y uso de animales (vivienda individual). Las ratas se aclimataron durante 6 meses en condiciones normales de manejo (23 ± 2 grados C, 55 ± 10 por ciento de humedad y 12 h de ciclo de luz/oscuridad) y se les alimentó con una dieta normal (D10001, AIN-76Una dieta para roedores, Research Diet Inc., New Brunswick, NJ, EE. UU.) y agua ad libitum. Las ratas de 14-meses de edad se segregaron en 4 grupos de tratamiento de 10 ratas cada uno y se distribuyeron según la similitud de peso (680,2 ± 9,20 g). Los tratamientos se administraron en PBS diariamente y cada uno se administró por vía intraperitoneal.

Los grupos fueron control, 5 mg/kg CaG (CaG5), 5 mg/kg IQG (IQG5) y 10 mg/kg CS (CS10) (Sigma Aldrich Co., EE. UU.), administrados. Cada grupo se mantuvo con la dieta normal (AIN-76Dieta para roedores, Dieta de investigación) y tratamiento de muestra durante 1 mes (Esquema 1).

Pesos del tejido adiposo

Se determinaron las proporciones de grasa abdominal y epididimaria con respecto al peso corporal. Las mediciones se realizaron después de sacrificar al final del período de tratamiento de 1- meses.

Densidad de adipocitos

Los órganos extirpados y el tejido adiposo se fijaron con formalina neutra al 10 por ciento. Después de la inclusión en parafina, se tiñeron con hematoxilina y eosina y azul de toluidina O, se examinaron con microscopía óptica (Leica CTR6000, Hesse, Alemania) y se fotografiaron. La densidad de adipocitos (células/mm2) se determinó en tejido tratado y control mediante tinción con azul de toluidina O (aumento original, x400).

Muestreo de sangre y sangre, plasma, un ensayo de suero

En cuatro grupos denominados CON, CaG5, IQG5, CS10 (n =10), después de 1 mes de tratamiento, se recolectó sangre (~5 ml) de la vena cava posterior bajo inhalación ligera de CO2 y se usó para mediciones de química sérica. Los parámetros examinados incluyeron fosfolípidos, ácido hialurónico, ácidos grasos libres, albúmina, fosfatasa alcalina (ALP), transaminasa glutámico oxaloacética (GOT), transaminasa glutámico pirúvica (GPT), deshidrogenasa láctica (LDH), CK (creatinina fosfoquinasa), glucosa , triglicéridos de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, creatinina, nitrógeno ureico en sangre (BUN), proteína total, ácido úrico y proteína c reactiva (PCR). Todos los parámetros se evaluaron utilizando un autoanalizador (Hitachi 7060 automatic Clinical Analyzer, Tokio).

Muestreo de sangre y análisis de plasma para la detección de actividad anticoagulante

Después de los tratamientos de 1-meses, se recogieron aproximadamente 4 ml de plasma de la vena cava posterior bajo inhalación ligera de CO2 y se centrifugaron. El sobrenadante se utilizó para el tiempo de coagulación como prueba de actividad anticoagulante: tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), tiempo de trombina, tiempo de protrombina y factor 1 (fibrinógeno) como ensayo de actividad fibrinolítica utilizando el analizador clínico automático mencionado anteriormente según el manual de Green Cross Lab.

Daño oxidativo de lípidos

Para determinar el daño oxidativo de los lípidos en los hepatocitos de rata, se midieron los niveles de malondialdehído (MDA) con un ensayo de peroxidación lipídica utilizando el método de color que involucra sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) a 535 nm [18].

Daño oxidativo de proteínas

Los sobrenadantes de homogeneizado de hígado y la sangre, obtenidos después de la centrifugación, se usaron para la determinación del contenido de carbonilo. El estrés oxidativo de las proteínas se evaluó midiendo el contenido de carbonilo de proteínas en la sangre. El contenido de carbonilo se determinó con un inmunoensayo ligado a enzimas de acuerdo con el protocolo del fabricante para el kit ELISA de carbonilo de proteínas OxiSelect™ (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, EE. UU.). La actividad de CAT (U/mg de proteína) se midió en función de la descomposición de H2O2 mediada por CAT [19].

Preparación de homogeneizado de hígado para la detección de enzimas oxidativas

Alrededor de cuatro grupos denominados CON, CaG5, IQG5, CS10, los tejidos hepáticos se homogeneizaron en hielo en una solución de extracción de proteínas PRO-PREP™ de tampón de lisis de 10-veces de volumen (iNtRON, Busan, Corea). El sobrenadante del homogeneizado de hígado después de la centrifugación (800 g, 10 min) se analizó para detectar catalasa, glutatión peroxidasa, glutatión s-transferasa y superóxido.

actividad dismutasa según el manual de ensayo (kit OxiSelect™ ELISA, Cell BioLabs, Inc., San Diego, CA, EE. UU.).

Ensayo de citoquinas IL-1 , IL-6 e IL-10

En cuatro grupos denominados CON, CaG5, IQG5, CS10, se midió el nivel de IL- 1 o IL-6 o IL-10 en suero de rata tratado con GAG de insectos usando kits comerciales Elisa (Quantikine, R&D Systems, Inc. , Minneapolis, MN, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Preparación de ARN y análisis PCR cuantitativo en tiempo real

El ARN total se aisló del hígado usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.), y la concentración y la pureza del ARN se midieron usando un espectrofotómetro UV/Vis (Beckman Coulter Co., Miami, FL, EE. UU.). El ADN complementario (ADNc) se sintetizó a partir de 1 g de ARN total utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, EE. UU.). La amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real se realizó con Power SYBR Green Master Mix utilizando un sistema de PCR en tiempo real 7500 (ambos de Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la detección de transcripciones de genes objetivo, diseñamos cebadores de oligonucleótidos específicamente directos e inversos utilizando el software Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, EE. UU.). Las secuencias de los cebadores se enumeran en el Esquema 2. Los niveles de ARNm objetivo se normalizaron utilizando gliceraldehído 3- fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno para calificar la expresión relativa del ARNm objetivo de acuerdo con el método de umbral de ciclo. Todas las muestras se analizaron por triplicado.

Secuencias de cebadores para la amplificación de genes implicados en el mecanismo de reparación celular y patrón interno de GAPDH (Esquema 2).

Procedimiento de microarrays de ADN

Después del análisis histopatológico, se realizó la hibridación de micromatrices en muestras de hígado [20]. El ARN total se aisló del tejido hepático utilizando un kit Qiagen RNeasy Midi (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.). Se utilizó un kit de etiquetado de microarrays FairPlay™ (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN marcado se cargó en un chip de micromatriz. Se ensambló una cámara de hibridación con el chip de micromatriz, Rat Genome 230 2.0 Array (Affymetrix Inc., Santa Clara, EE. UU.), y se sumergió en un baño de agua durante la noche a 60 grados. El chip de micromatriz se lavó en tampón de lavado I, tampón de lavado II y luego tampón de lavado III durante 5 o 15 min. El portaobjetos se secó mediante centrifugación a 500 g durante 15 min y se escaneó con un escáner de matriz BMS, se aplicó un lector de precisión Array Worx eBiochip (BioRad, Dallas, TX, EE. UU.), utilizando los canales Cy3 y Cy5 [21].

Análisis de corazón de rata aislado

Se anestesiaron ratas macho Sprague-Dawley que pesaban 350 ± 50 g con pentobarbital (100 mg/kg). Se inyectó heparina (1000 U/kg) en la vena de la cola y luego se intubó la tráquea. Mientras que las ratas fueron ventiladas mecánicamente con un ventilador para roedores (Modelo 7025; Ugo Basile, Comerio-Varese, Italia), sus corazones fueron perfundidos in situ con tampón de bicarbonato de Krebs-Henseleit oxigenado modificado mediante canulación aórtica retrógrada. Luego, los corazones se extirparon y se trasladaron a un aparato Langendorff (Hugo Sachs Electronik, March-Hugstetten, Alemania), donde se perfundieron con tampón de bicarbonato de Krebs-Henseleit oxigenado modificado a una presión de perfusión constante de 75 mmHg. Se introdujo un ventrículo de látex lleno de agua a través de la vena pulmonar y se conectó a un transductor de presión Isotec (Hugo Sachs Electronik) para medir la presión del ventrículo izquierdo (PVI). Se permitió que los corazones se equilibraran durante 15 minutos, momento en el cual la presión diastólica final (EDP) del ventrículo izquierdo se ajustó a 10 mmHg, y este volumen del globo se mantuvo durante todo el experimento. Luego, función contráctil de referencia, frecuencia cardíaca y flujo coronario (sonda de flujo electromagnético extracorpóreo; narco Bio-systems, Houston,

TX, EE. UU.) se midieron. La función contráctil cardíaca se calculó restando la LVEDP de la presión sistólica máxima del VI (LVSP), lo que da como resultado la presión desarrollada (LVDP). Después de 1 h de equilibrio, los anillos aórticos se trataron con vehículo (solución salina) o CaG (10 ug/ml, 100 ug/ml) 10 min antes de inducir la contracción con fenilefrina 1 μM. Luego, la relajación dependiente del endotelio fue inducida por acetilcolina (0.1–100 μM) [22].

Análisis estadístico

Las medias y el error estándar de todos los parámetros estudiados se determinaron para cada grupo mediante la prueba ANOVA. Se llevó a cabo una prueba t de Student para determinar diferencias significativas entre los grupos de control y tratados. un valor p<0.05 was="" considered="">

Resultados

Cambios en el peso corporal y la grasa adiposa

No hubo diferencias significativas en el peso corporal medio entre los grupos de tratamiento (Fig. 1). Durante el período de administración de 1-meses, los pesos corporales de las ratas macho de edad avanzada fueron comparables en los grupos de control y tratados con CaG, IQG y CS. Los pesos corporales semanales medios se presentan en la Fig. 2a: CON, 685,16 ± 9,14 g; CaG5, 659,54 ± 14,21 g; IQG5, 646,50 ± 11,56 g, y CS10, 662,93 ± 7,82 g. La cantidad media de grasa abdominal disminuyó significativamente en los grupos IQG5 y CS10 en comparación con el control: 21,84 ± 7,46 g para el control; 20,66 ± 8,47 g para CaG5; 16,56 ± 5,97 g para IQG5 (IQG5 vs CON, p < 0,05);="" y="" 16,93="" ±="" 5,17="" g="" para="" cs10="" (cs10="" vs="" con,="" p="">< 0,05)="" (fig.="" 2a).="" la="" grasa="" epididimial="" también="" disminuyó="" significativamente="" en="" los="" grupos="" iqg5="" y="" cs10="" en="" comparación="" con="" el="" control:="" 10,38="" ±="" 2,58="" g="" para="" el="" control;="" 8,19="" ±="" 4.00="" g="" para="" cag5;="" 7.00="" ±="" 1,35="" g="" para="">

(IQG5 frente a CON, p < 0.05);="" y="" 8,56="" ±="" 2,53="" g="" para="" cs10="" (cs10="" vs="" con,="" p="">< 0,05)="" (fig.="">

Densidad de adipocitos

La densidad de adipocitos [número de células/área (mm2)] de tejidos de hígado de rata tratados con GAG en un HFD, evaluada mediante tinción con azul de toluidina O, se redujo con CaG5 (33,00 ± 1,73), IQG5 (45 .00 ± 4,36), o CS10 (26.00 ± 2,52) (CS10 vs CON, p < 0,05) en comparación con el control (51.00 ± 5,29) (fig. 2b).

Cambios en la presión arterial y la frecuencia cardíaca

No se observaron diferencias significativas en la presión arterial (presión arterial sistólica o frecuencia cardíaca) entre los grupos tratados con 5 mg/kg de CaG, IQG o CS y el grupo de control (datos no mostrados).

Hematología y química sanguínea

Se observaron algunos cambios dependientes de la dosis entre los grupos de tratamiento y control con respecto a los parámetros hematológicos examinados al final del experimento. Hubo un aumento del 27,5 por ciento en el APTT (seg.) en el grupo tratado con CaG5-: CON, 35,68 ± 5,68; CaG5, 45,49 ± 10,91; CIG5, 29,93 ± 3,57; CS10, 36,83 ± 23,95 (Fig. 3). El tiempo de trombina (seg.) fue como sigue: CON, 40,18 ± 2,04; CaG5, 42,13 ± 3,23; CIG5, 36,15 ± 6,67; CS10, 45,02 ± 21,89. Hubo un aumento significativo (62,6 por ciento) en el Factor I (fibrinógeno, mg/dL) en el grupo tratado con CaG5-: CON, 429,33 ± 142,22; CaG5, 698,29 ± 120,28 (CaG5 frente a CON, p < 0,05);="" cig5,="" 627,14="" ±="" 160,67;="" cs10,="" 790.00="" ±="" 274,22="" (cs10="" frente="" a="" con,="" p="">< 0,05).="" el="" tiempo="" de="" protrombina="" (seg.)="" fue="" como="" sigue:="" con,="" 62.86="" ±="" 47,30;="" cag5,="" 52,71="" ±="" 4,96;="" cig5,="" 52,14="" ±="" 5,58;="" cs10,="" 55.00="" ±="">

Bioquímica sérica

En los sueros de los grupos tratados con IQG y CS (Tabla 1), los niveles de fosfolípidos (mg/dL) fueron significativamente más bajos que en los sueros de control después de 1 mes en ratas envejecidas: CON, 271,78 ± 91,74; CaG5, 233,67 ± 71.0; IQG5, 173,2 ± 32.{{20}}2 (IQG5 frente a CON, p < 0,05);="" cs10,="" 259,7="" ±="" 57,27="" (cs10="" frente="" a="" con,="" p="">< 0,05).="" los="" niveles="" de="" ácidos="" grasos="" libres="" (μeq/l)="" se="" redujeron:="" con,="" 686,78="" ±="" 104,67;="" cag5,="" 431,33="" ±="" 66,22="" (cag5="" frente="" a="" con,="" p="">< 0,05);="" iqg5,="" 405,6="" ±="" 63,39="" (iqg5="" vs.="" con,=""><0.05); cs10,="" 566.9="" ±="" 115.38="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). also,="" serum="" gpt="" (alt)="" levels="" (iu/l)="" in="" the="" cag-="" and="" iqg-="" treated="" groups="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" control="" group="" in="" aged="" rats:="" con,="" 76.33="" ±="" 40.21;="" cag5,="" 36.78="" ±="" 8.0="" iu/l;="" iqg5,="" 43.22="" ±="" 13.86="" (iqg5="" vs.="" con,p="" <="" 0.05);="" cs10,="" 53.44="" ±="" 11.36="" (cs10="" vs.="" con,="" p=""><0.05). fur-="" thermore,="" the="" mean="" creatinine="" phosphokinase="" (ck="" u/l)="" level="" in="" the="" cag-treated="" group="" was="" lower="" than="" that="" in="">

grupo control en ratas envejecidas: CON, 125,78 ± 91,66; CaG5, 1{{10}}2,89 ± 65,73 (CaG5 frente a CON, p < 0,05);="" cig5,="" 91,22="" ±="" 24,74;="" cs10,="" 131,2="" ±="" 62,56.="" la="" glucosa="" sérica="" media="" (mg/dl)="" disminuyó="" significativamente="" en="" ratas="" de="" edad="" avanzada="" (cada="" grupo="" frente="" a="" con,="" p="">< 0,05):="" con,="" 435,11="" ±="" 105,42;="" cag5,="" 304,0="" ±="" 44,44;="" cig5,="" 275,9="" ±="" 43,18;="" cs10,="" 317,8="" ±="">

El nivel medio de colesterol total (mg/dl) en el grupo tratado con IQG fue menor que en el grupo control en ratas de edad avanzada, y esa diferencia también fue significativa: CON, 212,67 ± 92,82; CaG5, 181,44 ± 68,4; IQG5, 124,1 ± 23,6 (IQG5 frente a CON, p < 0,05);="" cs10,="" 198,9="" ±="">

Además, los niveles de triglicéridos (mg/dL) fueron los siguientes: CON, 207,89 ± 101,95; CaG5, 136,22 ± 61,6; IQG5, 103,3 ± 35,59 (IQG5 frente a CON, p < 0.05);="" cs10,="" 183,4="" ±="" 104,74.="" niveles="" de="" colesterol="" ldl="" (mg/dl)="" disminuidos:="" con,="" 74,67="" ±="" 44,91;="" cag5,="" 69,0="" ±="" 31,3;="" iqg5,="" 41,44="" ±="" 10,14="" (iqg5="" vs="" con,="" p="">< 0,05);="" cs10,="" 65,22="" ±="" 18,52.="" se="" observaron="" disminuciones="" significativas="" del="" nivel="" de="" ácido="" úrico="" (mg/dl)="" en="" todos="" los="" grupos="" tratados="" con="" gag="" en="" comparación="" con="" el="" control="" (cada="" grupo="" frente="" a="" con,="" p="">< 0,05):="" con,="" 10,9="" ±="" 2,26;="" cag5,="" 8,12="" ±="" 1,48;="" cig5,="" 6,49="" ±="" 0,89;="" cs10,="" 8,14="" ±="" 2,17,="" tabla="">

Disminución del daño oxidativo

El malondialdehído (MDA, nmol/ml) se analizó después de 1 mes de cada tratamiento con GAG [CON, 252,9 ± 13,1; CaG5, 175,1 ± 5,8 (disminuciones del 30,32 por ciento). Cada tratamiento con GAG y sulfato de condroitina disminuyó la peroxidación lipídica en los hepatocitos (Fig. 4a). La concentración de carbonilo de proteína en sangre disminuyó en una proporción de 68,52 por ciento, 36,89 por ciento y 53,70 por ciento en GaG5, IQG5 y CS10, respectivamente (Fig. 4b). Sin embargo, cada GAG no tuvo diferencias estadísticas en comparación con el control en el contenido de carbonilo de los hepatocitos (datos no mostrados).

Cuantificación de enzimas oxidativas (catalasa, GPx, GST, SOD)

La actividad de catalasa (mg de proteína/min) en los hepatocitos después de 1 mes de tratamiento con GAG fue la siguiente: CON, 17,72 ± 2,81; CaG5, 19,87 ± 3,88; CIG5, 17,22 ± 4,55; CS10, 19,23 ± 3,55. La actividad de catalasa en todos los grupos de hepatocitos tratados con CaG aumentó. La superóxido dismutasa (SOD) es una enzima eliminadora de radicales libres (superóxido). La actividad de SOD (nmol/min/ml) aumentó en los grupos de tratamiento en comparación con el control: control, 381,44 ± 85,32; CaG5, 400,56 ± 60,62; CIG5, 386,72 ± 69,22; CS10, 513,05 ± 60,07. La actividad de la glutatión peroxidasa (unidad/mg de proteína) en el grupo de hepatocitos tratados con CaG aumentó significativamente con el tratamiento (CaG5 frente a CON, p < 0,05),="" y="" la="" actividad="" de="" la="" glutatión="" s-transferasa="" (nmol/min/ml)="" en="" el="" grupo="" de="" hepatocitos="" tratados="" con="" cag="" aumentó="" significativamente="" con="" el="" tratamiento.="" el="" grupo="" cag="" también="" aumentó="" significativamente="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" de="" control="" (cag5="" frente="" a="" con,="" p="">< 0,05)="" (tabla="">

Producción de citoquinas IL-1 e IL-10

Se observaron aumentos en los niveles de IL-10 en el grupo tratado con CaG. Los niveles de IL-1 (ρg/ml) en suero se redujeron en 1

Tabla 1 Hallazgos serológicos de ratas viejas tratadas con CaG o IQG durante 1 mes

mes de tratamiento con CaG o IQG, demostrando las acciones antiinflamatorias de los compuestos: control, 251,3 ± 70,7; CaG5, 102,9 ± 9,5; CIG5, 110,4 ± 5,2; CS10, 110,4 ± 10,1 (cada grupo vs CON, p < 0,05).="" la="" actividad="" de="" il-10="" (ρg/ml)="" después="" de="" 1="" mes="" de="" tratamiento="" con="" cag="" en="" ratas="" aumentó:="" con,="" 34,9="" ±="" 11,5;="" cag5,="" 67,4="" ±="" 13,3="" (cag5="" frente="" a="" con,=""><0.05); iqg5,="" 55.5="" ±="" 24.7;="" cs10,="" 28.0="" ±="" 3.8="" (fig.="" 5).="" the="" il-10="" levels="" in="" the="" cs10="" group,="" was="" statistically="" different="" from="" that="" in="" the="" con="" group="" (cs10="" vs.="" con,p=""><>

Expresión génica mediante análisis cuantitativo de PCR en tiempo real

The data represented that PCR cycle required number (Ct value) when the concentration of PCR amplicon are equilibrated by sample amplicon. Median CT values of 5 sample's represented, but there was no difference from the control group (Ct vale >2.0) en la secuencia del cebador usado (datos no mostrados).

micromatriz de ADN

Se realizó un análisis de micromatrices utilizando una matriz de clones de ADNc de ratón 28 K para identificar los perfiles de expresión génica en hígados de ratas SD de 15- meses de edad tratados con CaG, IQG y CS, y para proporcionar información sobre posiblesantienvejecimientomarcadores

En comparación con el grupo de control, el grupo CaG5 exhibió un aumento de 2- a 4- veces en 118 genes, un aumento de 4- 8- veces en 11 genes y un aumento de más de 8- veces aumento en 2 genes. Los niveles de expresión de los ~30,000 genes restantes permanecieron iguales. Sesenta genes se regularon a la baja de 2- a 4- veces, y 4 mostraron una disminución de 4- a 8- veces.

En el grupo IQG5 en comparación con el grupo de control, 162 genes aumentaron de 2- a 4-veces, 10 genes aumentaron de 4- a 8-veces y 3 genes aumentaron de más de 8- veces. Por otro lado, 66 se redujeron 2- a 4- veces y 7 se redujeron 4- a 8- veces.

Tabla 2 Actividades enzimáticas antioxidantes del glicosaminoglicano del escarabajo coprófago en hígado de rata anciana

En el grupo CS10, en comparación con el grupo de control, 63 genes aumentaron de 2- a 4- veces, 2 genes aumentaron de 4- a 8- veces y 2 genes aumentaron por más de 8- veces. Treinta y ocho genes se regularon a la baja de 2- a 4- veces, 4 se regularon a la baja de 4- a 8- veces, y 4 se redujeron en más de 8- veces.

En comparación con el grupo de control, el gen lipocalina2 (Lcn2) aumentó aproximadamente 10-veces en el tejido hepático tratado con CaG5-, 46-veces en el grupo IQ5 y {{6} }doblar en el grupo CS10. En tejidos hepáticos de ratones tratados con CaG5-, la lisil oxidasa (Lox) se reguló a la baja en una proporción de 0,13, es decir, se redujo la expresión génica. El grupo de ratas tratadas con CaG5, en comparación con el control, mostró que 131 genes, incluida la lipocalina 2, la proteína de unión a oligosacáridos (Lbp) y el inhibidor de la serina peptidasa, Kaszal type3 (Spink3), estaban regulados al alza (Tabla 3) y 64 genes, incluida la lisil oxidasa (Lox), la serina deshidratasa (sds) y el retinol saturado (Retreat) estaban regulados a la baja (Tabla 4). El grupo tratado con CaG5-, en comparación con el grupo de control, exhibió una regulación positiva de 131 genes, incluida la lipocalina 2, la proteína de unión a oligosacáridos (Lbp) y el inhibidor de la serina peptidasa Kaszal tipo 3 (Spink3) (Tabla 3 ) y regulación a la baja de 64 genes, incluidos lisil oxidasa (Lox), serina deshidratasa (sds) y retinol saturado (Retsat) (Tabla 4). Estos datos apuntan a la lipocalina 2 y las adipocinas, como genes regulados al alza, y a la lisil oxidasa (relacionada con la heparanasa), como gen regulado a la baja, como posibles marcadores terapéuticos que actúan contra el envejecimiento y la obesidad.

Caracterización de CaG

Las composiciones de los monosacáridos amino, ácido y neutro de GaG se determinaron mediante GC-MS (Tabla 5). Los aminomonosacáridos primarios de CaG están en el siguiente orden: ácido D-glucosamínico > N-acetil-galactosamina > N-acetil-D-gactosaminitol > galactosamina HCl > ácido galactosamínico > galactosamina > ácido glucurónico. Además, los monosacáridos neutros que se encuentran en CaG son principalmente glucosa y manitol, mientras que los menores incluyen arabinosa y ramnosa.

Indicadores de cardioprotección

En este experimento, caracterizamos el efecto directo de CaG en las arterias de resistencia utilizando vasos incubados in vitro con contracción inducida por fenilefrina y relajación inducida por acetilcolina. CaG fue evaluado como un agente cardioprotector. La curva de concentración-respuesta a CaG se desplazó hacia abajo en comparación con la observada después del tratamiento de control (solo PBS), lo que muestra que la estimulación cardíaca se produjo de manera dependiente de la concentración (Fig. 6).

Discusión

El envejecimiento es un proceso de disminución progresiva de la capacidad fisiológica de un organismo, manifestado por alteraciones acumuladas y desestabilización a nivel de todo el sistema [13]. Se cree que el glicosaminoglicano disminuye los efectos nocivos del envejecimiento al prevenir la destrucción de cartílago, hueso, discos, piel [23], el sistema vascular [8], etc. Recientemente, un tipo de GAG ​​como materiales multifuncionales, poliuretano a base de heparina o son considerado actualmente como uno de los biocompatibles y compatibles con la sangre establecidos

biomateriales que ofrecen una gran relación estructura-propiedad, como la inmovilización con heparina en injertos de poliuretano modificado con quitosano con propiedades antiadhesivas y antimicrobianas [24]. Hoy en día, la llegada del control de la temperatura ha hecho posible el diseño de sistemas de cría de insectos a gran escala. Por lo tanto, glucosaminoglucano

se puede adquirir de la corteza del insecto como un residuo de extracto alcohólico. Estos medicamentos crudos de escarabajos peloteros y reinas B. ignitus se han estudiado en un esfuerzo por identificar sus componentes activos o hacer que los extractos sean más seguros para el uso humano. El escarabajo coprófago C. molossus se purificó para producir dímeros de N-acetildopamina, molossusamida AC (1–3), mostrando

actividad inhibidora de COX-1 y COX-2 [25]; quitosano [26]; melanina [27]; y serina proteasas [9, 28]. Se demostró que un extracto de abejorro (Bombus ignitus) contiene serina proteasa de veneno de abeja [29], peroxirredoxinas [30] y proteína de reconocimiento de peptidoglicano (PGRP-S) [31].

Las estrategias para prevenir o retrasar el envejecimiento han incluido la ingestión de antioxidantes para reparar el daño celular oxidativo en el ADN, las proteínas y los lípidos, así como la regeneración de tejidos mediada por células madre y la terapia génica [32]. Como marcador de daño oxidativo de lípidos en estados de estrés oxidativo de lípidos de hepatocitos, el malondialdehído disminuyó con el tratamiento con CaG. Además, el contenido de carbonilo en la sangre, especialmente los neutrófilos, disminuyó con el tratamiento con CAG y demostró reparar el daño de la proteína oxidativa celular.

Los glicosaminoglicanos de C. molossus y B. ignitus queens consisten principalmente en ácido D-glucosamínico como monosacárido ácido y N-acetil-galactosaminitol como amino

monosacárido, junto con -glucosa y D-manitol como monosacáridos neutros. Por lo tanto, el compuesto puede acceder a los receptores de la membrana celular y puede prevenir las causas de las enfermedades relacionadas con la edad al alterar el metabolismo energético. Los glicosaminoglicanos podrían reparar tejidos conectivos [23], cartílagos erosionados, discos, huesos y glicoproteínas a nivel molecular, con GAG formando un enlace entre proteínas [9]. En este experimento, las ratas utilizadas eran viejas y pesaban alrededor de 680 g, por lo que no hubiera sido fácil lograr una reducción del peso corporal, pero sí observamos una disminución del peso de la grasa adiposa y del número de adipocitos. Al igual que con la mayoría de los glicosaminoglicanos, CaG e IQG produjeron una reducción en los niveles séricos de parámetros relacionados con la inflamación: ácidos grasos libres, AST (SGPT), creatinina quinasa (relacionada con la función cardíaca), glucosa, ácido úrico e hiperglucemia. niveles: colesterol, total, triglicéridos, colesterol LDL, etc. Los niveles de ácidos grasos libres (hígado graso relacionado) de los grupos tratados se redujeron estadísticamente de manera significativa, 36,7 por ciento en el grupo CaG y 40,94 por ciento en el grupo IQG. Además, el nivel de sGPT (función hepática relacionada) se redujo significativamente, 51,58 por ciento en el grupo CaG y 43,38 por ciento en el grupo IQG.

Los datos generados a partir del análisis de microarrays de ADN apoyaron laantienvejecimientoefecto de IQG, con cambios significativos en los perfiles de expresión génica en ratas SD de 14-meses de edad observadas después de un período de tratamiento de 1-meses. Las ratas tratadas con CaG5-, en comparación con el grupo de control, tuvieron aumentos en 131 genes, incluida la lipocalina 2 [33], la proteína de unión a liposacáridos (Lbp) [34] y un inhibidor de la serina peptidasa, Kazal type3 (Spink3) [35] y disminuciones en 64 genes, incluida la lisil oxidasa (Lox) [36], la serina deshidratasa (sds) [37] y la retinol saturasa (Retsat) [38]. Los datos apuntan a la lipocalina 2 y las adipocinas, que estaban reguladas al alza, y a la lisil oxidasa (relacionada con la heparanasa), que estaba regulada a la baja, como marcadores terapéuticos potenciales paraantienvejecimientoEfectos en animales obesos.

El presente estudio observó cambios significativos en los perfiles de expresión génica en ratas de edad avanzada después del tratamiento con CaG o IQG durante 1 mes. La expresión génica de la lipocalina-2, que es una adipoquina implicada en la resistencia a la insulina [39] y una proteína secretora con propiedades de unión a lípidos, aumentó aproximadamente 10 veces. Esto está de acuerdo con un estudio de micromatrices que informó que la ingestión de soja provoca un aumento de una chaperona amiloide endógena, la prostaglandina D2 sintasa de tipo lipocalina (Ptgds), lo que conduce a la supresión de la disfunción cognitiva [4{{ 22}}]. La proteína de unión a lipopolisacáridos (LPS) (LBP), un marcador sustituto de la translocación microbiana, se asocia con una función física reducida y un aumento de la inflamación [41]. El proceso normal de envejecimiento altera el sistema de coagulación de la sangre en los humanos; Los anticoagulantes naturales, como la antitrombina III, el cofactor de heparina II, la proteína C, la proteína S y el inhibidor de la vía del factor tisular, pueden modular las reacciones del sistema de coagulación de la sangre [42]. En este estudio, hubo aumentos significativos en el factor I (fibrinógeno) en los grupos tratados con CaG (162,6 por ciento), IQG (146,0 por ciento) y CS10 (184,0 por ciento) en comparación con el grupo de control tratado con PBS. Además, el nivel de LBP (proteína de unión a LPS) aumentó en nuestros datos de microarrays de ADN, lo que sugiere que la heparina (GAG) se une a LBP, facilita la transferencia de LPS a CD14 y mejora la activación mediada por LPS de los monocitos de sangre periférica, lo que da como resultado actividad anticoagulante [43]. Un inhibidor de la tripsina, el inhibidor de la serina proteasa Kazal-tipo 3 (Spink3), se reguló en este experimento, lo que indica un papel para la modulación paracrina; también está involucrado en la implantación del embrión [44]. Como Spink3 es un importante inhibidor de la serina proteasa, su regulación al alza puede reflejar un importante mecanismo citoprotector endógeno que evitaría más lesiones [45]. La regulación a la baja de la lisil oxidasa puede indicar que la heparina (GAG) que inhibe la estrecha unión de la lisil oxidasa a las fibrillas preformadas apenas se vio afectada [46]. La regulación a la baja de la saturación de retinol observada en este experimento es notable, ya que la saturasa de retinol promueve la adipogénesis y se regula a la baja en la obesidad [47]. Según una hipótesis, la densidad del tejido adiposo, un nuevo biomarcador que predice el riesgo de mortalidad en adultos mayores que no parece estar relacionado con la inflamación [48], además, CaG redujo significativamente la densidad adiposa prometiendo un potenteantienvejecimientoagente.

Conclusiones

El glicosaminoglicano del escarabajo pelotero disminuyó los niveles de colesterol y triglicéridos en suero, provocó una disminución del peso del tejido adiposo y la normalización de los niveles séricos de ácidos grasos libres, GPT, glucosa y ácido úrico, y prolongación del tiempo de coagulación que evitaría la agregación sanguínea y lipídica. acumulación en las barreras endoteliales vasculares que contribuyen a la homeostasis en el sistema circulatorio. La IL{{0}} (pg/ml) en suero se redujo con 1 mes de tratamiento con CaG o IQG, demostrando acción antiinflamatoria. Además, el gen protector del hígado lipocalina estaba altamente (10- veces) regulado al alza y la lisil oxidasa estaba regulada a la baja (0,1- veces) en ratas tratadas con CaG. CaG derivado de insectos podría ser un

reemplazo más seguro de la heparina y otros GAG de fuentes de mamíferos, ya que las fuentes de insectos reducen la posibilidad de transmisión de virus infecciosos de animales como los cerdos. Estos resultados sugieren que CaG y BIQ no solo podrían ser naturalesantienvejecimientopero también ser alimentos funcionales, similares al quitosano y futuros biomateriales que juegan un papel vital en nuestra vida cotidiana.

abreviaturas

ALP: Fosfatasa alcalina; ALT(GPT): glutamato piruvato transaminasa; aPTT: tiempo de tromboplastina parcial activada; AST(GOT): glutamato oxaloacetato transaminasa; BUN: nitrógeno ureico en sangre; CaG 5: Escarabajo coprófago (Catharsius molossus) glicosaminoglicano 5 mg/kg; CK: creatinina fosfocinasa; CONTRA: grupo de control; PCR: proteína C reactiva;

CS10: Sulfato de condroitina (10 mg/kg); GAG: glicosaminoglicano; GGT: - glutamil transferasa; H. Chol: Colesterol alto; IQG5: Reina de Bombus ignitus (un tipo de abejorro) glicosaminoglicano 5 mg/kg; l.Chol: Colesterol bajo; LDH: Lactato deshidrogenasa; PT: tiempo de protrombina; T. Chol: Colesterol total; TG: triglicéridos

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a la Academia Nacional de Ciencias Agrícolas por el apoyo financiero (RDA, PJ011853) y técnico.

Fondos

Este trabajo fue apoyado por el proyecto de Investigación Básica de la Administración de Desarrollo Rural, PJ011853.

Disponibilidad de datos y materiales.

Todos los datos están disponibles en los portales de revistas en el manuscrito enviado. No se necesitan otros archivos/datos de respaldo junto con este envío.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Contribuciones de los autores

MY realizó la mayoría de los experimentos, preparó el manuscrito: concibió el estudio, participó en su diseño y coordinación, recopiló y analizó datos y preparó el manuscrito. BJ llevó a cabo los estudios en animales, participó en el ensayo de enzimas relacionadas con la oxidación. HJ llevó a cabo ensayos de citoquinas. JS participó en la alineación de la secuencia genética. KK participó en microarrays de ADN. YS llevó a cabo un estudio in vivo de la capacidad de respuesta de la arteria de resistencia. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Consentimiento para publicación

Este manuscrito no contiene datos de ninguna persona individual en ninguna forma.

Aprobación ética

Los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Animales de Laboratorio de la Academia Nacional de Ciencias Agrícolas, RDA, Corea del Sur (NAAS1503).

Los manuscritos que informaban sobre estudios no contenían participantes humanos, datos humanos ni tejidos humanos.

Nota del editor

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Detalles del autor

1Departamento de Biología Agrícola, Academia Nacional de Ciencias Agrícolas, Administración de Desarrollo Rural (RDA), Wanju-Gun 55365, Corea del Sur. 2Facultad de Farmacia, Universidad Ajou, Suwon 442-749, Corea del Sur. 3Pharmacogenechips Inc., Chuncheon 200-160, Corea del Sur.