Efecto antienvejecimiento de la urolitina A en ovocitos bovinos in vitro 2

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2.8.Análisis estadístico

Los datos de las sesiones de producción y calidad de embriones se analizaron utilizando Proc Glimmix de SAS (Statistical Analysis Systems, SAS Inst., Inc., Cary, NC, EE. UU.), utilizando la distribución binaria y el logit como funciones de enlace. El modelo mixto lineal generalizado incluyó el tratamiento (dosis de AU, efecto de envejecimiento y edad de las hembras y su interacción) como efecto fijo y réplicas como efecto aleatorio. Además, se calcularon las medias de cada tratamiento y se realizaron comparaciones entre grupos mediante la prueba PDIFF. Los datos de JC-1, los niveles de transcripción de mRNA y el número de copias de mt-DNA se analizaron utilizando el Proc Mixed de SAS con un modelo que incluye el tratamiento (efecto UA, efecto de envejecimiento y/o edad femenina y su interacción) como efecto fijo. La sesión se consideró un efecto aleatorio. Los datos de configuraciones cromosómicas se compararon entre grupos mediante la prueba exacta de Fisher, en una tabla de contingencia 2 x 2. El análisis de resultados se consideró estadísticamente significativo cuando p<>

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3. Resultados

3.1.Ensayo anterior: estudio de dosis-respuesta

El estado de maduración de los ovocitos observado durante el estudio de dosis-respuesta de AU suplementado con el medio de maduración se representa en la Figura 1. Esta suplementación influyó significativamente en las etapas de maduración nuclear de los ovocitos. El grupo 50 UA (38.9±0.5 por ciento) reveló una mayor tasa de ovocitos en el estado de fase AI/TI en comparación con el Control (10.8±{{ 15}}.5 por ciento ,P=0.03)y 10 UA(0.0±0.{{ 45}} por ciento, p=0.0006) grupos. En esta fase, una tasa más alta en el grupo de 25 UA (17.2±0.5 por ciento, p=0.05) también se identificó el grupo 10 UA. Además, se encontró una tendencia entre el grupo de 50 UA y 1 UA (14.3±2.0 por ciento, p=0.08). La dosis más alta también mostró un efecto dañino, reduciendo el número de ovocitos clasificados en Metafase-II. etapa (MII) (50 UA, 44,4 ± 2,0 por ciento) en comparación con el control (86, 5 ± 7,0 por ciento, p=0, 003), 1 UA (82,1 ± 2,5 por ciento, p{{ 53}}.01), 10 UA (89.3±6.5 por ciento, p=0.002) y 25 UA (82.8±9.0 por ciento, p=0.01) grupos. No se observaron diferencias entre los grupos restantes Etapas de maduración de los ovocitos. Las fases de maduración GV y CCl no se muestran en la Figura 1, ya que no se evaluaron ovocitos en estas categorías.

La prueba de dosis-respuesta no mostró un efecto significativo de las concentraciones de AU en las tasas de escisión y de embriones eclosionados. Sin embargo, la tasa de embriones producidos en el día 7 estuvo influenciada por las diferentes concentraciones de AU. El grupo de 50 UA (7,2±2,7 por ciento) tuvo tasas más bajas de embriones en el día 7 en comparación con el grupo de 1 UA (28,5±4,8 por ciento, p=0,004), 10 UA (20,4±4,0 por ciento , p=0.03) y 25 UA (18.5±4.7 por ciento, p=0.05)grupos. Aunque no se encontraron diferencias significativas entre los grupos de control y 50 AU, se identificó una tendencia (p=0.06). Además, las tasas de embriones del día 7 tienden (p =0.07) a ser más altas después de la suplementación con una dosis de 1 UA en comparación con el control. Además, el grupo de 1 UA duplicó el número de embriones de excelente/buena calidad (68,9 % de embriones de grado 1, n=20) en comparación con el control (34,6 %, n=10) y 10 UA (26,8 % por ciento, n=10). Se obtuvo un bajo número de embriones de grado 1 con las dosis más altas: grupo 25UA (15,4 por ciento, n=4) y 50UA (35,4 por ciento, n=3). En base a los resultados antes mencionados, se eligió la AU 1 uM para proceder a los siguientes estudios.

3.2.Experimento 1——Calidad de los ovocitos y potencial de desarrollo de ovocitos envejecidos y fisiológicamente maduros

3.2.1.Maduración nuclear

Investigamos el efecto de la suplementación con AU en el estado de maduración cromosómica de ovocitos envejecidos y fisiológicamente maduros recolectados de hembras prepuberales y adultas. Independientemente del efecto UA, el envejecimiento de los ovocitos y la edad de las hembras indujeron un efecto nocivo significativo sobre la maduración. Se identificaron tasas más altas de fase MII en los ovocitos de control en comparación con los de mayor edad (22h=93.2±5.4 por ciento vs.30h=77.6±4.1 por ciento, p {{11 }}.02). Además, se identificó un retraso en la progresión de la maduración en gametos envejecidos y hembras prepuberales con más ovocitos en la fase AI/TI (22h=3.4±0.5 por ciento vs. 30h =17.9±0.6 por ciento, p=0.01 y prepuberal=21.1±1.1 por ciento vs adulto=6.8±0.7 por ciento p =0.03). Además, se identificó un mayor número de ovocitos degenerados después de 30 h de MIV en comparación con después de 22 h (7.1 ± 1.39 por ciento vs. 4.1 ± 0.89 por ciento, p =0.02) . La edad de la hembra y la suplementación con AU no interfirieron (p 0.05) con el número de ovocitos degenerados.

Tanto el envejecimiento in vitro como la suplementación con AU al medio de maduración influyeron significativamente en la configuración cromosómica de los ovocitos en hembras prepúberes y adultas (p<0.05, figure="" 2).="" on="" the="" al/ti="" phase="" of="" the="" maturation="" status,="" higher="" rates="" of="" oocytes="" were="" found="" in="" this="" stage="" in="" the="" control="" aged="" 30="" h="" prepubertal="" group="" (46.7±0.5%)="" when="" compared="" to="" control="" prepubertal="" (0.0±0.0%,p="0.05)" and="" ua="" aged="" 30h="" prepubertal="" (0.0="" ±0.0%,p="0.02),and" both="" adult="" control="" (5.6±0.5%,p="0.01" and="" ua="" adult,0.0±0.0%,="" p="0.0002)and" control="" aged="" 30h="" adult="" (9.1±10%,p="0.02)groups." a="" trend="" was="" also="" identified="" between="" ua="" adults="" and="" ua="" aged="" 30="" h="" adult="" (p="">

En cuanto a la fase MII correspondiente a la maduración nuclear completa, también se encontraron diferencias significativas entre grupos (Figura 2). Se encontraron tasas más bajas de ovocitos en la etapa MII en el control de 30 h de edad prepuberal (53.3±2.0 por ciento) en comparación con el control prepuberal (10{{2{ {27}}}}.0±1.5 por ciento, p=0.05), UA prepuberal de 30 h de edad (100.0±2.5 por ciento, p=0.02) y UA adulto (100.0 ±10,5 por ciento, p=0,0002) y grupos de control de adultos de 30 años de edad (86,0±5,5 por ciento p =0,056). Además, el grupo de adultos UA mostró tasas más altas de ovocitos maduros (MII) en comparación con el adulto UA de 30 h de edad (76,2 ± 11,3 por ciento, p=0 0,01), control adulto de 30 h de edad (86). 0±5,5 por ciento, p=0,08) y adulto de control (83,3±4,5 por ciento, p=0,057).

No se observaron diferencias entre las restantes etapas de maduración de los ovocitos.flavonoides,En resumen, la suplementación con AU mejoró la progresión de la maduración in vitro en ovocitos sometidos al proceso de envejecimiento, especialmente en hembras prepuberales. Así se identificó un importante efecto antienvejecimiento de la AU.

3.2.2.Potencial de membrana mitocondrial

Con el fin de analizar la implicación de la disfunción mitocondrial en ovocitos envejecidos femeninos y el efecto de la UA y la edad materna, se evaluó el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en ovocitos de diferentes grupos.

Cistanche puede antienvejecimiento

Independientemente de la edad de la hembra y los efectos de la UA, el envejecimiento de los ovocitos tuvo un efecto perjudicial significativo en la MMP evaluada como la proporción de la fluorescencia roja y verde medidas (relación de 22 h =0, 54 ± 1,8 por ciento frente a la proporción de 30 h{{6} }.47±1.5 por ciento, p=0.002).

La combinación de la edad de las hembras, el efecto del envejecimiento y la suplementación con AU durante la maduración influyeron significativamente (p{{0}}.{{10}}07) en el MMP (Figura 3). Como se observa en la Figura 3, las mayores tasas de MMP se obtuvieron en los grupos de prepuberales AU (ratio=0.55±0.04) y adultos AU (ratio=0.63±0.04) donde los ovocitos se maduraron durante 22 h. , en comparación con el control adulto de 30 h (ratio=0.45±0.04, p=0.04 y p=0.0007, respectivamente) y AU adulto de 30 h (ratio{ {23}}.45±0.03,p=0.03 yp=0.0003,respectivamente) grupos.usos de hesperidinaAdemás, se observó un aumento significativo en la relación JC{{0}} agregado/monómeros, lo que indica un aumento significativo en MMP, en el grupo de adultos UA en comparación con el adulto control (proporción =0.47 ±0.04,p =0.0031),control prepuberal(proporción=0.52±0.04, p=0. 03), control adulto 30h (ratio=0.48±0.03,p=0.003) y AU adulto 30h (ratio=0.47±0.03,p{{25 }}.001)grupos. También se identificó una tendencia entre AU prepuberales y AU prepuberales de 30 h (p=0.07).

En resumen, el AU mejoró la MMP durante la maduración fisiológica pero no fue capaz de superar el efecto negativo del envejecimiento tanto en los ovocitos prepuberales como en los adultos.

3.2.3.Desarrollo embrionario

El potencial de desarrollo embrionario se evaluó a través de las tasas de clivaje, D7 y embrión eclosionado, obtenidas con los diferentes tratamientos (envejecimiento y suplementación con AU) aplicados a los AOC de hembras prepuberales y adultas durante la maduración. Independientemente de la edad de la hembra y los efectos de la AU, el envejecimiento de los ovocitos tuvo un efecto perjudicial significativo en la escisión (22h=79.5±1.7 por ciento vs.30h=68.6±2.0 por ciento, p=0.0001)y D7tasas embrionarias(22h=18.6±1.9 por ciento

vs.30h=12.1±1.7 por ciento, p=0.01). La suplementación con UA ​​también demostró mejorar las tasas de embriones D7 (control{ {8}}.1±1.5 por ciento vs. UA=20.0±2.0 por ciento, p=0.0009).

La combinación de la edad de la hembra, el efecto de envejecimiento y la suplementación con AU durante la maduración influyeron significativamente (p {{0}}.{{30}}1) en el desarrollo embrionario, es decir, en la escisión y Tasas de embriones D7 (Tabla 2). Se lograron tasas más altas de escisión cuando los ovocitos adultos maduraron durante 22 h con o sin suplementos de AU (adulto de control=1, 4 ± 3,2 por ciento y adulto de UA=80). 9±3.4 por ciento) y los ovocitos prepuberales maduraron durante 22 h con suplementos de AU (UA prepuberal=80.6±3.2 por ciento), en comparación con UA ​​de 30h de edad adulta (66.5±4.2 por ciento, p Menos de o igual a 0,01), control 30 h prepuberales (66,9±3,9 por ciento, p menor o igual a 0,02) y UA 30 h prepuberales (67,2±4,0 por ciento, p menor o igual a 0,01) (Tabla 2). También se identificó una tendencia (p=0.09) entre los grupos de adultos de control y adultos de control de 30 h de edad.

Another parameter that was significantly (p=0.01) influenced by the combination of the female age, the supplementation with UA, and COCs aging was the rate of embryos produced at day 7(Table 2). Exceptions were made for the UA prepubertal and UA 30 h prepubertal groups, the UA adult group presented the highest rates of the embryo at day7 (26.8±4.3%,p≤0.05). Moreover, lower D7 embryo rates were produced from aged oocytes from both adult and prepubertal females without the supplementation of UA (control aged 30hprepubertal=7.7±2.6% and control aged 30h adult=7.7±2.6%)compared to those that were supplemented with UA, respectively (UA aged 30 h prepubertal=18.9±4.0%,p=0.03 and UA aged 30 h adult=15.9±4.0%,p=0.09). The supplementation of UA to the maturation medium did not significantly (p>0.05) influyó en las tasas de calidad de los embriones producidos de los grados 1, 2 y 3, ni el efecto del envejecimiento ni todos los efectos estudiados juntos (Cuadro 3). Sin embargo, se duplicó el número de embriones de excelente/buena calidad que se produjeron cuando se suplementó con AU a ovocitos madurados durante 22 h (Cuadro 3).

3.3.Experimento 2

3.3.1.Niveles de expresión génica

Para estudiar el efecto de UA y la influencia de la edad materna en la vía de señalización de Nrf2, se evaluó mediante RT-qPCR el análisis de los niveles de expresión génica de NFE2L2 y NQO1 en cultivos de GC de vacas prepuberales y adultas. Independientemente de los otros factores estudiados, la edad femenina influyó significativamente en la expresión del gen NFE2L2, lo que se refleja en el nivel más alto de transcripciones de NFE2L2 en GC de mujeres prepuberales (niveles de ARNm prepuberal=0.00015 ±0,0012 por ciento frente a adulto=0,00011±0,0012,p=0,048).

The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly(p>0.05) influyen en los niveles de expresión génica de los genes NFE2L2, NQOl y mt-ND5. La figura 4 representa los niveles de expresión de estos genes que se normalizaron con el control respectivo, tanto en GC prepúberes como adultos tratados con UA.

3.3.2.mt-Número de copia de ADN

Analysis of mt-ND5 DNA content in GC culture from prepubertal and adult cows was assessed by qPCR. The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly (p>0.05) influyen en el número de copias del gen mt-ND5.imperio perdido cistancheLa figura 5 representa el número de copias de este gen normalizado con los controles respectivos, tanto en GC prepúberes como adultos tratados con UA.

4. Discusión

Durante las últimas décadas, se ha observado una demanda creciente de aplicación de ART en el ganado [8,46,47]. Además, el retraso en la maternidad asociado a la edad materna avanzada se ha convertido en la actualidad en el principal factor que lleva a las mujeres a recurrir a las TRA [5]. La calidad de los ovocitos es crítica para que ocurra una concepción exitosa, y el envejecimiento del gameto femenino es una preocupación importante para el éxito de las TRA. A pesar de los crecientes avances en este campo, las tecnologías aplicadas aún no son capaces de restaurar la fertilidad, revirtiendo el reloj biológico [7]. En el presente trabajo se desarrolló un modelo para el estudio de la infertilidad asociada a la edad en ovocitos bovinos. Debido a las similitudes con el embarazo humano, los eventos foliculares y endocrinos[48,49], este modelo también puede ser útil para la investigación en humanos, evitando las restricciones éticas y físicas que dificultan estos estudios en ovocitos humanos. Nuestro modelo para el envejecimiento de gametos femeninos demostró ser muy eficiente y adecuado para estudiar diferentes problemas asociados con el envejecimiento reproductivo y el deterioro de la fertilidad, actualmente uno de los desafíos más críticos en el mundo. Además, la búsqueda de nuevas terapias antioxidantes próximas con el potencial de prevenir la infertilidad provocada por el envejecimiento de los gametos femeninos, como se estudia en el presente trabajo, es igualmente de suma importancia.

Los resultados presentados informaron por primera vez el efecto beneficioso de la AU en los resultados del TRA. El AU es un metabolito alimentario capaz de prevenir la acumulación de mitocondrias disfuncionales relacionadas con la edad al inducir su mitofagia y prolongar la vida útil de las células [28]. Dado que el AU nunca antes se había probado en la reproducción bovina, se utilizaron dosis aplicadas con éxito en diferentes líneas celulares que mostraron sus efectos anticancerígenos, antiinflamatorios y antienvejecimiento [28,35,39]. En nuestro estudio, una dosis previa- Se llevó a cabo un ensayo de respuesta y la concentración de AU 1 uM se identificó claramente como la más prometedora. Además, se demostró un efecto deletéreo a dosis más altas, especialmente a la dosis de AU 50 uM, perjudicando la progresión de la maduración nuclear hasta MII. Este efecto se reflejó en el deterioro del desarrollo embrionario. En consecuencia, Liu y sus colegas (2019) notaron una viabilidad celular y una proliferación significativamente reducidas de fibroblastos de piel senescentes humanos, a una concentración de AU de 50 uM. Refirieron que las altas dosis de UA conducen a una disminución de la viabilidad celular, lo que aumenta el número de células detenidas en el ciclo celular G/M [35]. Por el contrario, se produjeron mayores tasas de embriones en el día 7 después de la suplementación de 1 uM UA al medio de maduración en comparación con las otras dosis. Para explorar más a fondo los posibles mecanismos de acción de la AU en la reproducción femenina, se implementó un estudio durante el envejecimiento de los ovocitos y utilizando hembras de diferentes edades como donantes de ovocitos. Yamamoto y colaboradores (2010) informaron una disminución asociada con la edad en la tasa de fertilización de vacas viejas, lo que demuestra que estos ovocitos eran más propensos a reanudar la primera división meiótica durante la maduración y, a menudo, ya habían iniciado la maduración meiótica en la recolección de ovocitos [50] Estos datos sugirieron que los ovocitos de vacas más viejas tuvieron una progresión de maduración nuclear más rápida y alcanzaron la fase MII más rápido que los ovocitos de hembras jóvenes debido a una menor competencia ovocitaria [51]. En consecuencia, nuestro estudio revela que la edad de las donantes femeninas y el proceso de envejecimiento de los ovocitos influyen significativamente en la configuración cromosómica de los ovocitos durante el proceso de maduración. De hecho, los ovocitos de vacas prepuberales mostraron una tasa más alta de etapas tardías, como las fases Al/TI (prepuberal=21.1 por ciento vs. adulto =6.8 por ciento), lo que revela una progresión más lenta de la enfermedad nuclear. maduración, que puede deberse a una menor competencia ovocitaria como proponen Soto-Heras y colaboradores (2018). Los ovocitos envejecidos también presentan tasas más bajas de ovocitos que han alcanzado la fase MII durante un período de 30 h (7,6 por ciento) en comparación con el período fisiológico (93,2 por ciento). Además, se ha identificado un efecto positivo del tratamiento con AU durante el proceso de maduración fisiológica, así como efectos antienvejecimiento tanto en mujeres prepuberales como adultas.

De acuerdo con nuestros hallazgos, un estudio ha demostrado que la suplementación con melatonina durante la maduración in oitro podría estimular la reanudación de la meiosis en los AOC bovinos, mientras que los ovocitos de control cultivados sin hormonas tenían tasas de reanudación de la meiosis más lentas [52]. Por el contrario, la suplementación con otros agentes antioxidantes, como la quercetina, la vitamina C o el resveratrol, no presentó ningún efecto sobre las tasas de maduración nuclear, incluso cuando se observaron niveles reducidos de ROS o niveles enzimáticos antioxidantes aumentados [53,54].fracción de flavonoides purificada micronizada 1000 mg usosPor el contrario, nuestros resultados muestran que la AU podría rescatar a los ovocitos de los efectos del envejecimiento tanto en hembras adultas mayores como prepúberes, que presentan menor competencia, mejorando las tasas de maduración.

Uno de los principales contribuyentes a los malos resultados de fertilidad que afectan la calidad de los ovocitos está relacionado con las funciones mitocondriales, que se ven comprometidas con la edad materna avanzada y el envejecimiento posovulatorio [21,55]. Las MMP han sido ampliamente estudiadas en diferentes modelos, revelando que tanto los gametos envejecidos después de la ovulación como el envejecimiento materno inducen la pérdida de la función mitocondrial [56]. En consecuencia, la pérdida de MMP se reflejó negativamente en el desarrollo de ovocitos y embriones [26,57]. De acuerdo con estos hallazgos, en nuestro estudio, se encontró una proporción reducida de MMP en ovocitos envejecidos de vacas prepuberales y adultas. Además, la suplementación con AU al medio de cultivo indujo un aumento en la MMP de ovocitos prepúberes y adultos que maduraron durante 22 h, repercutiendo en tasas de escisión más altas. Estos datos están de acuerdo con los resultados encontrados por Liang y colaboradores (2017), quienes observaron una mejora de MMP cuando los ovocitos bovinos se complementaron con melatonina durante 22 h [26]. Sin embargo, también identificamos una reducción en MMP en ovocitos envejecidos complementados con AU, lo que indica que es posible que UA no pueda revertir el efecto negativo del envejecimiento en MMP. Se han observado resultados discrepantes con respecto a la MMP después de la suplementación de ovocitos envejecidos con compuestos antioxidantes. De hecho, varios autores informaron mayores niveles de MMP en ovocitos después de la suplementación con melatonina [26] y laminarina [21], mientras que otros han observado lo contrario, una disminución de MMP en ovocitos envejecidos tratados con L-carnitina [58] y melatonina [38]. Además, Ryu y colegas (2016) mostraron una reducción de MMP en mioblastos de ratones cultivados con AU [28]. Con respecto a nuestros resultados, se deben abordar más estudios para profundizar en el conocimiento del mecanismo de acción de la AU en la mitocondria del ovocito y explicar los efectos diferenciales identificados sobre los oocitos envejecidos y fisiológicamente maduros.

La calidad intrínseca de los ovocitos ha sido ampliamente reportada como el principal determinante del desarrollo embrionario posterior. La evidencia acumulada reveló que se producen varias anomalías celulares y moleculares durante los períodos prolongados de maduración in vitro, así como durante el envejecimiento postovulatorio in oivo [57]. Además, estas anormalidades pueden ejercer impactos relevantes en la calidad de los ovocitos que repercuten en la producción de embriones [52]. Para demostrar que la AU puede actuar como un compuesto antienvejecimiento y mejorar la calidad de los ovocitos, retrasando el envejecimiento de los ovocitos, investigamos la capacidad de desarrollo de los ovocitos envejecidos después de la fertilización in vitro. En nuestro estudio, se observó un efecto dañino significativo (p menor o igual a 0.01) del envejecimiento de los gametos en la escisión y las tasas de producción de embriones del día 7. En consecuencia, varios autores refirieron que las hembras viejas tienen una disminución de las capacidades reproductivas asociada con la edad, lo que se refleja en tasas de fertilidad más bajas y una calidad embrionaria deficiente [44,55]. Por otro lado, estudios previos que probaron otras moléculas antioxidantes para rescatar ovocitos envejecidos han reportado el efecto beneficioso de algunos de estos compuestos durante la maduración in Vitro en el desarrollo embrionario de hembras envejecidas de diferentes especies, como bovino [58], cerdo [ 38] y ratones [6]. Por ejemplo, la L-carnitina se probó en ovocitos envejecidos bovinos y no se encontraron diferencias significativas en las tasas de escisión obtenidas. Sin embargo, se identificó un aumento significativo en la tasa de cigotos desarrollados hasta la etapa de blastocisto, en comparación con los ovocitos envejecidos sin L-carnitina [59]. Nuestros resultados también demuestran que la suplementación con AU durante la maduración fisiológica mejoró la tasa de escisión en mujeres prepuberales y adultas. Aunque las tasas de escisión de los ovocitos envejecidos por UA no fueron significativamente diferentes de los ovocitos envejecidos como control, se identificaron tasas de embriones D7 más altas en los ovocitos envejecidos por UA de hembras prepuberales y adultas. Estos resultados señalaron que el efecto antienvejecimiento de la AU previamente identificado en diferentes cultivos celulares [28,35] es válido para ovocitos y embriones. El envejecimiento de los ovocitos es un proceso multifactorial que perjudica el desarrollo del embrión, y restaurar la capacidad de desarrollo de los ovocitos envejecidos es un objetivo importante que se logró en el presente estudio.

Además, también evaluamos el papel preventivo de la AU en el deterioro de la calidad del embrión relacionado con la edad. Aunque en este estudio no se encontraron diferencias significativas en los índices de calidad embrionaria, los ovocitos suplementados con AU aumentaron el número de embriones transferibles, en comparación con los no tratados. Un estudio anterior informó que el tratamiento con L-carnitina podría mejorar la calidad de los embriones desarrollados a partir de ovocitos bovinos envejecidos mediante la reducción de los niveles de ROS y niveles más altos de glutatión, así como de otras enzimas antioxidantes [58]. Las diferencias entre estos resultados y los nuestros pueden deberse a las diferentes técnicas aplicadas para evaluar la calidad embrionaria. La evaluación morfológica de la calidad embrionaria sigue siendo un método subjetivo que depende de la experiencia del observador. En el futuro, se deben abordar más estudios utilizando otras técnicas para evaluar con precisión la calidad del embrión.

Es ampliamente conocido que el estrés oxidativo juega un papel crucial en la disminución de la fertilidad asociada con la edad. El estrés oxidativo es uno de los principales contribuyentes a la baja eficiencia de maduración de los ovocitos y al deterioro de la calidad de los ovocitos, lo que perjudica el desarrollo embrionario posterior [11]. La comunicación intercelular entre el gameto y las células somáticas es crucial para el correcto desarrollo de ovocitos de alta calidad. Se han informado cambios en el microambiente de los ovarios envejecidos, como una disminución de la actividad enzimática antioxidante que conduce a una disminución de la eficiencia de eliminación de ROS.oteflavonoideAdemás, se demostró que los GC de mujeres jóvenes y mayores tenían genes expresados ​​​​diferencialmente asociados con actividades antioxidantes y edad materna [2,13]. Por lo tanto, es de gran importancia que los mecanismos encontrados manejen el estrés oxidativo para rescatar a los ovocitos del envejecimiento y superar los problemas de infertilidad. La vía Nrf2-Keapl se ha estudiado ampliamente debido a su capacidad para hacer frente a los efectos nocivos del estrés oxidativo y ejercer propiedades antioxidantes [60] Para estudiar más a fondo la activación de la vía de señalización Nrf2 en GC bovinos, evaluamos la Nivel de expresión de ARNm de NFE2L2 y su antioxidante aguas abajo (NQO1). Nuestros resultados mostraron una influencia significativa de la edad femenina en el nivel de transcripciones de NFE2L2, que disminuye con la edad. De hecho, se observaron mayores niveles de expresión de ARNm en vacas prepuberales en comparación con los adultos. Esto está de acuerdo con estudios previos que informaron un nivel altamente expresado de proteína Nrf2 y ARNm en tejidos ováricos de ratones jóvenes fértiles y mujeres de 22 y 49 años, mientras que en ratones de edad avanzada y mujeres se encontró una expresión más baja. Se sugirió que la disminución de la expresión de Nrf2 puede estar involucrada en la disminución de la capacidad reproductiva de las mujeres mayores y su control puede tener implicaciones importantes en el retraso del envejecimiento ovárico [15,61]. Además, Akino y colaboradores (2019) demostraron que la activación de la vía Nrf2-Keapl a través de la administración de dimetilfumarato podría reducir los niveles de ROS y retrasar la infertilidad [18]. Se informaron resultados similares con respecto al efecto de AU en la reducción de ROS en fibroblastos de piel humana senescente. Cuando estas células se trataron con UA, se notificó un aumento significativo en la expresión de ARNm de genes dirigidos a Nrf2, como SOD1, NQ01, GCLC y HMOX1. [35]. En nuestro estudio, observamos que el nivel de expresión de los genes NFE2L2 y NQO1 en los GC no se vio significativamente afectado por la suplementación con AU. Sin embargo, se deben abordar más estudios para confirmar la reducción de ROS y la posterior mejora del blastocisto producido, así como el efecto de UA en la expresión de ARNm de los genes antes mencionados en ovocitos envejecidos.

Además del daño al ADN mitocondrial (ADNmt) [25,57], también se ha demostrado que la interrupción de la expresión génica mitocondrial contribuye a la disfunción mitocondrial con la edad. Zhang y sus colegas (2019) informaron que algunos genes involucrados en OXPHOS, a saber, mt-ND2, mt-ND3, mt-ND4, mt-ND4L y mt-ND5, estaban significativamente regulados a la baja en la etapa GV de ovocitos de ratones envejecidos. en comparación con los de ratones jóvenes [62]. En nuestro estudio, no se encontraron diferencias significativas en la expresión del ARNm de mt-ND5 entre los GC recuperados de vacas prepuberales y adultas. Además, también evaluamos el número de copias de mt-DNA, porque el contenido de mt-DNA en GC se ha asociado positivamente con la calidad de los ovocitos y el desarrollo del embrión [63,64]. Aunque en nuestro estudio no se identificaron diferencias significativas entre el número de copias de mt-DNA en GC de vacas prepuberales y adultas, o cuando fueron tratadas con AU, observamos una mayor cantidad de ovocitos que se desarrollaron hasta la etapa de blastocisto, en comparación con los grupos no tratados. Además, Ryu y colaboradores (2016) informaron que el contenido de mt-DNA y el nivel de proteína de los complejos respiratorios no cambiaron en los mioblastos de ratones suplementados con AU [28]. Se deben realizar más estudios para revelar el mecanismo de acción de la AU para mejorar la fertilidad femenina.

5. Conclusiones

Los resultados obtenidos en este estudio confirmaron el efecto nocivo del envejecimiento de los ovocitos sobre su competencia de desarrollo. Además, nuestro modelo para el envejecimiento de los gametos femeninos demostró ser muy eficiente y útil para estudiar diferentes problemas asociados con el envejecimiento reproductivo y el consiguiente deterioro de la fertilidad. Además, la suplementación con AU durante el proceso de maduración de ovocitos envejecidos mejoró las tasas de maduración y produjo embriones. Por lo tanto, se identificó por primera vez un efecto antienvejecimiento de AU en el rescate de gametos envejecidos, mejorando el desarrollo de blastocistos, lo que conduce a un mayor número de embriones para transferir a las hembras receptoras. También se identificó un efecto positivo de AU sobre la maduración fisiológica, MMP y desarrollo embrionario. En conclusión, el tratamiento con AU proporciona un nuevo enfoque terapéutico para prevenir o retrasar el envejecimiento de los gametos y mejorar la posterior formación de blastocistos y los resultados de fertilidad en TRA.

Este artículo está extraído de Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals