Efectos antienvejecimiento de las antocianinas Ribes Meyeri en células madre neurales y ratones envejecidos, parte 2

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Nar rescata fenotipos senescentes de 23M-NSC

Las antocianinas de R. Meyer son ricas en muchos tipos de flavonoides y componentes bioactivos [1,3-5]. Para determinar qué componente de las antocianinas de R. Meyer juega un papel importante en el antienvejecimiento, realizamos un análisis metabolómico de R. antocianinas de Meyer. Revelamos que Nar puede ser un metabolito flavonoide importante porque la ruta biosintética de flavonoides estaba altamente enriquecida en antocianinas R. Meyer (Tabla complementaria 1). Para determinar los efectos antisenescentes de Nar, se aplicaron varias concentraciones (0, 1,7, 3,4, 6,8, 13,6 y 27,2 ug/mL) a 23M-NSC y se usaron ensayos de CCK-8 para investigar la viabilidad celular. Como muestra la Figura complementaria 3, el tratamiento con 6,8 ug/ml de Nar aumentó la viabilidad celular en un 150 por ciento. Para explorar más a fondo los efectos antisenescentes de Nar, las 23M-NSC se trataron con Nar y luego se detectaron indicadores relacionados con el envejecimiento. .usos de hesperidinaEn 23M-NSC tratados con 6,8 ug/ml de Nar, se redujo la expresión del ARNm de p16nk4a (Figura 3A). Nar también alargó los telómeros de mNSC cultivadas y aumentó la síntesis de ADN (Figura 3B, 3C). Para explorar más a fondo los efectos de Nar sobre la proliferación celular, realizamos una tinción de inmunofluorescencia de Ki67, que es un antígeno nuclear de las células mitóticas que se expresa a lo largo del ciclo celular, excepto en G0 [19,27]. El tratamiento con Nar mejoró la proliferación celular, medida por el aumento del número de células positivas para Ki67- (Figura 3D, 3E). A continuación, también detectamos el potencial de diferenciación de NSC en neuronas. De hecho, el tratamiento con 6,8 ug/mL de Nar también aumentó el número de células MAP2-positivas (Figura 3F, 3G). Estos resultados demuestran consistentemente que Nar puede revertir la senescencia de 23M-NSC.

Figura 2. Las antocianinas de Ribes Meyer mejoran la memoria del ratón y las habilidades de aprendizaje al aumentar las células madre neurales (NSC). (A) Se toma tiempo para encontrar la plataforma. (B) Se toma tiempo para llegar primero a la plataforma. (C) Velocidad media para encontrar la plataforma. (D) Distancia nadada antes de encontrar la plataforma. (E. F) Tratamiento con R.imperio perdido cistanchecada antocianina aumentó el número y el tamaño de las neuroesferas en comparación con los controles. (G) El número de neuroesferas de 50-100 um de tamaño aumentó mediante el tratamiento con antocianina de R. Meyer en ratones. Los datos se presentan como la media ± SD de tres experimentos independientes. *PAGS<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Figura 3. Efecto de la naringenina (Nar) sobre la senescencia de las células madre neurales (MNC) de ratón. (A) La expresión del ARNm de p16k4a se midió mediante qRT-PCR en 23M-NSC con y sin tratamiento de 6,8 ug/ml de Nar durante 48 h. (B) Distribuciones de fase del ciclo celular de 23M-NSC tratadas con Nar durante 48 h y células de control. (C) La longitud relativa de los telómeros de 23M-NSC aumentó significativamente con el tratamiento con Nar, (D) Tinción con Ki67 de inmunofluorescencia de músculos tratados con Nar durante 48 h, con marcaje nuclear DAPI, (E) Cuantificación de (D), (F) Representante Campos de tinción de inmunofluorescencia MAP2 y GFAP de mNSC cultivadas después del control y el tratamiento con Nar. (G) Cuantificación de (F). Los datos se presentan como la media ± SD de tres experimentos independientes. *PAGS<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

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Nar mejora la memoria y la cognición en ratones que envejecen

Los niveles cognitivos disminuyen con el envejecimiento y los tratamientos antienvejecimiento pueden mejorar los niveles cognitivos [11, 28]. Para verificar los efectos antienvejecimiento de Nar in vivo, inyectamos 20 mg/kg de Nar en ratones C57BL/6 envejecidos (12 meses de edad) a través de la vena de la cola. La prueba MWM se utilizó para examinar la memoria espacial y las capacidades cognitivas de los ratones.fracción de flavonoides purificada micronizada 1000 mg usosDurante 5 días de entrenamiento repetido, el tiempo que tardaron los ratones envejecidos tratados con Nar en encontrar la plataforma disminuyó gradualmente en comparación con el grupo de control (Figura 4A). Los resultados de la prueba revelaron que se redujo el tiempo necesario para llegar por primera vez a la plataforma (Figura 4B), mientras que se incrementó el tiempo pasado en la zona de la plataforma (Figura 4C). Además, se observaron ratones envejecidos tratados con Nar dentro de la zona de la plataforma con mayor frecuencia que el grupo de control (Figura 4D). Juntos, estos resultados sugieren que Nar puede mejorar la memoria espacial y las habilidades cognitivas en ratones que envejecen.

Análisis de secuenciación de ARN de sangre tratada con Nar de ratones envejecidos

Para investigar los mecanismos antienvejecimiento específicos de Nar, analizamos el perfil de expresión génica de la sangre tratada con Nar de ratones envejecidos mediante secuenciación de ARN (RNA-seq). Los resultados revelaron 1.961 genes expresados ​​diferencialmente (DEG). En general, Nar reguló a la baja la expresión génica, y solo un pequeño número de genes se reguló al alza en comparación con el grupo de control no tratado (Figura 5A, 5B). Además, los genes importantes de la vía de señalización relacionados con el envejecimiento estaban regulados a la baja, especialmente aquellos en la vía de señalización del TNF (Figura 5C).oteflavonoideEstos resultados implican que Nar afecta la vía de señalización de TNF, lo que influye profundamente en la función de TNF-a, que está involucrada en el deterioro cognitivo relacionado con el envejecimiento [29,30]. Por lo tanto, examinamos los niveles de TNF- en el plasma de ratones. Resultados de ensayos inmunoabsorbentes (ELISA) ligados a enzimas

Figura 4. Naringenina (Nar) mejora la memoria y las capacidades de aprendizaje en ratones envejecidos. (A) La latencia de escape de los ratones envejecidos tratados con Nar fue más corta en comparación con el grupo de control. (B) El tiempo necesario para llegar por primera vez a la plataforma fue más corto en los ratones envejecidos tratados con Nar que en el grupo de control. (C) Duración del tiempo pasado en la zona de la plataforma. (D) Frecuencia de observación en la zona de la plataforma para ratones envejecidos tratados con Nar en comparación con el grupo de control. Los datos se presentan como la media ± DE de tres experimentos independientes.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche puede antienvejecimiento

DISCUSIÓN

El envejecimiento se asocia con un mayor riesgo de deterioro cognitivo, así como con una pérdida de la capacidad de aprendizaje y memoria [22,23]. La pérdida neuronal y el deterioro de la neurogénesis están estrechamente relacionados con la disfunción cerebral asociada con la edad [11-13]. Por lo tanto, aumentar el número de neuronas y mejorar la neurogénesis son cruciales para el tratamiento antienvejecimiento. R. Meyer, una planta rica en flavonoides y otras sustancias bioactivas [1, 3-6], tiene muchas funciones que aún no han sido descritas. En el presente estudio, las antocianinas de R. Meyer promovieron la proliferación de NSC y aumentaron la formación de neuroesferas con morfología uniforme. El tratamiento con antocianinas de R. Meyer también mejoró el fenotipo de envejecimiento celular, con niveles reducidos de ROS y expresión del gen P16nk4 relacionado con el envejecimiento, aumento de la fase de síntesis de ADN y telómeros alargados.puritanos vitamina cAdemás, los resultados de la tinción de inmunofluorescencia revelaron que las antocianinas de R Meyer estimularon la formación de neuronas. Estos resultados sugieren que las antocianinas de R. Meyer tienen efectos antienvejecimiento en las mNSC y también pueden promover directamente la formación de neuronas in vitro. Además, el deterioro cognitivo está estrechamente relacionado con el envejecimiento [22, 23]. Nuestros resultados de MWM demostraron que la administración intragástrica de antocianinas R. Meyer mejoró la memoria espacial y las habilidades de aprendizaje en ratones de edad avanzada, y también aumentó

Figure 5. Tumor necrosis factor(TNF)-a plays an essential role in naringenin (Nar)-mediated anti-aging effects. (A) Summary of gene expressions in mouse blood, as determined by RNA-seq. (B)Heatmap showing differentially expressed genes (DEGs) in the blood between control and Nar-treated mice. DEGs were identified by a fold change of >2.0 o<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

El uso del análisis metabolómico para investigar la composición específica de las antocianinas R. Meyer reveló que Nar puede ser un metabolito flavonoide importante. Se ha informado previamente que Nar mejora la senescencia de las células miocárdicas [31], mejora la capacidad metabólica del tracto intestinal [32] y ejerce efectos antiinflamatorios [33] y anticancerígenos [34]. Sin embargo, los efectos de Nar sobre las NSC durante el envejecimiento siguen sin conocerse. Para explorar los efectos antienvejecimiento de las antocianinas R. Meyer, llevamos a cabo más estudios con Nar. El tratamiento con 6,8 ug/ml de Nar aumentó la viabilidad celular, redujo la expresión del gen P16ink4a, alargó los telómeros y promovió la diferenciación de NSC en neuronas in vitro. Para evaluar más a fondo los efectos de Nar sobre la proliferación celular, realizamos estudios de inmunofluorescencia. Los resultados indicaron que el tratamiento con Nar aumentó tanto el número de células Ki67-positivas como la proporción de células MAP2-positivas, lo que sugiere que Nar puede promover la neurogénesis. Además, los efectos de Nar sobre el aprendizaje y la memoria también se evaluaron en ratones envejecidos. Los resultados de la prueba MWM demostraron consistentemente que el tratamiento con Nar mejora el aprendizaje espacial en ratones envejecidos. Curiosamente, el análisis de RNA-seq reveló que Nar puede afectar la senescencia a través de la vía de señalización de TNF, especialmente al regular a la baja la expresión de TNF-a en la sangre de ratones envejecidos. Los ensayos ELISA también indicaron que el tratamiento con Nar redujo los niveles de TNF-a en plasma en comparación con los ratones de control envejecidos. TNF-a es un factor clave en la vía de señalización de TNF y está estrechamente relacionado con el envejecimiento cognitivo. Sus funciones incluyen la promoción de cambios patológicos en las sinapsis del hipocampo [29] y la inhibición de la proliferación de células precursoras [35]. Los niveles alterados de TNF se asocian con deterioro cognitivo en la depresión, la esquizofrenia, el trastorno bipolar y la enfermedad de Alzheimer [30,36,37]. Más específicamente, el TNF-a está regulado al alza en pacientes con enfermedad de Alzheimer [38].

En resumen, nuestro estudio demuestra que las antocianinas de R. Meyer mejoran los efectos del envejecimiento en NSC a través de Nar, que regula a la baja los niveles de TNF-a in vivo y mejora la cognición en ratones que envejecen. En conjunto, nuestros hallazgos brindan una estrategia novedosa para el desarrollo de tratamientos clínicos, destinados a una mayor comprensión del valor medicinal de las antocianinas R.Meyer.

MATERIALES Y MÉTODOS

animales de experimentación

Este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Tongji y se realizó de acuerdo con las pautas institucionales. Se administraron antocianinas de R. Meyer por vía intragástrica durante 2 meses a ratones de 12-mes de edad mantenidos en el fondo C57BL/6. Nar se inyectó en la vena caudal durante 1-meses a 12-meses de edad en ratones mantenidos con el fondo C57BL/6. Los ratones de control recibieron el mismo volumen de solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Preparación de antocianinas R. Meyer y Nar

La fruta de R. Meyer (500 g) se homogeneizó utilizando un homogeneizador de tejidos y se suspendió en 1 L de metanol que contenía 0,1 por ciento de ácido clorhídrico. La extracción ultrasónica se realizó tres veces durante 30 min a temperatura ambiente. Los extractos se combinaron y el metanol se concentró a presión reducida para obtener extractos de R Meyer. El extracto se purificó aún más con resina macroporosa AB-8 para aumentar el contenido de antocianinas.

La naringenina (C15H1205; PM: 272,25; pureza: mayor o igual al 98 por ciento; grado HPLC) se compró a Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd. (Sichuan, China) y se almacenó a 2 grados {{6 }} grado en un ambiente seco y sin luz. La concentración de la solución madre fue de 100 mM en dimetilsulfóxido (DMSO). La concentración final de DMSO no superó el 0,1 por ciento en el medio de cultivo.

Ensayos de diferenciación y neuroesfera

Las NSC se derivaron del ratón SVZ. Los ratones se sacrificaron después de la anestesia y la SVZ se diseccionó cuidadosamente y se disoció en células individuales con 00,4 U/mL de papaína (Imogen, Alexandria, VA, EE. UU.; Cat No: LS003126). Las NSC se sembraron en placas de 10 cm que contenían 10 ml de medio basal de NSC con 10 ng/ml de EGF (PeproTech, Cranbury, NJ, EE. , EE. UU.; Número de catálogo: AF-100-18B). Las neuroesferas se pasaron cada 5 días. Se sembraron NSC de neuroesferas de paso-2 recién disociadas en laminina (Gibco, Gaithersburg, MD, EE. ; Cat No: P3655) portaobjetos de vidrio recubiertos en NSCBasalMedium sin suplementos de diferenciación. Las células diferenciadas se inmunoteñeron para Tu1 (beta-tubulina II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.; Cat No: 480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, Cat No: MA5-12826) y proteína ácida fibrilar glial (GFAP; Thermo Fisher Scientific, Cat No. PA5-16291), y luego se contrastó con 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Thermo Fisher Scientific, Cat No: D1306). Los portaobjetos se examinaron utilizando un microscopio Olympus BX53 (Olympus, Madison, WI, EE. UU.). La cuantificación de TuJ1- y MAP2-células positivas se realizó contando las células marcadas de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t no pareada.

Este artículo se extrajo de www.aging-us.com ENVEJECIMIENTO 2020, vol. 12, núm. 17