El andamio activado por el gen Klotho antienvejecimiento promueve una respuesta de cicatrización de heridas rejuvenecedora en células madre derivadas de tejido adiposo humano

Palabras clave:antienvejecimiento; -Kloto; andamio activado por genes; células madre derivadas de tejido adiposo; angiogénesis;depósito de matriz;sanación rejuvenecedora

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1. Introducción

La curación de heridas es un proceso biológico complejo que requiere una estrecha orquestación de múltiples eventos celulares.1]. Sin embargo, en la población que envejece, los eventos celulares se interrumpen, lo que lleva a un retraso en la curación.2]. La interrupción en los mecanismos de curación surge en parte debido a la reducción de la localización de las células progenitoras de la médula ósea y otras enfermedades metabólicas predominantes como la diabetes.3,4]. En el manejo de heridas, la aplicación de andamios de biomateriales se está volviendo más común como tratamiento. Andamios de biomaterialesproteger la herida de infecciones, absorber los exudados de la herida y mantener la herida húmeda para evitar la necrosis tisular [5]. Los productos terapéuticos también se pueden cargar en andamios de biomateriales y promover una curación más rápida en heridas difíciles de curar [1]. Sin embargo, los andamios de biomateriales por sí solos pueden no orquestar eficazmente las múltiples cascadas de señalización que ocurren dentro de la herida. La administración de células madre a veces se propone como una solución para moderar los complejos eventos de señalización en la herida.6]. 

Las células madre secretan factores paracrinos y pueden diferenciarse en células de múltiples linajes de tejido.7]. Las células madre generalmente se administran en la herida a través de inyecciones intradérmicas.6], pulverización tópica [8], o como injertos de ingeniería tisular [9]. En los últimos años, la aplicación de injertos de ingeniería tisular para la cicatrización de heridas crónicas ha ganado gradualmente una mayor aceptación debido a su capacidad para curar heridas rápidamente.9–11]. Apligraf® y Dermoinjerto® son dos de las construcciones de bioingeniería aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) ampliamente utilizadas para el tratamiento de heridas crónicas.12,13]. Sin embargo, la generación de estos injertos requiere un cultivo celular prolongado para producir un alto número de células.14]. Cuando se utilizan células madre, el cultivo prolongado puede aumentar la senescencia celular y disminuir la troncalidad de las células madre.15,16]. Por lo tanto, mantener la troncalidad de las células madre es fundamental para lograr la respuesta terapéutica óptima. La entrega de genes terapéuticos a las células madre utilizando vectores no virales es una estrategia potencial para mejorar la funcionalidad de las células madre.17]. Tradicionalmente, las células se transfectan en cultivos 2D y luego se trasplantan in vivo [18]. Sin embargo, plataformas como los andamios activados por genes, que consisten en andamios de biomateriales funcionalizados con nanopartículas que llevan el transgén terapéutico [19], que nuestro grupo ha sido pionero en ofrecer una solución alternativa para transfectar las células dentro de un entorno 3-D. Este estudio se centró en desarrollar una versión activada por genes del andamio 3D colágeno-condroitín sulfato (coll-CS) que tiene un tremendo potencial de traducción clínica, ya que su composición es similar a la de la plantilla de regeneración dérmica (DRT) de Integra, un andamio para la curación de heridas crónicas [20]. Utilizamos principalmente un polímero catiónico llamado polietilenimina (PEI) para condensar plásmidos de ADN que codifican genes de factores de crecimiento como el factor alfa derivado del estroma-1 y el factor de crecimiento nervioso y ensamblarlos en nanopartículas cargadas [21–23]. Estas nanopartículas cargadas luego se cargan en nuestro andamio coll-CS para generar los andamios activados por genes. Nuestros estudios previos también han demostrado que el andamio activado por genes basado en PEI puede causar una sobreexpresión transitoria del transgén terapéutico en una variedad de células de cicatrización de heridas y promover sus capacidades regenerativas.21,24,25]. Tradicionalmente, el andamio activado por genes se desarrolló para dirigirse a las células huésped y promover la reparación local.26]. Sin embargo, la evidencia emergente indica que los andamios activados por genes cargados de células tienen una potencia superior para regenerar estructuras tisulares complejas que los andamios activados por genes solos.27]. 

La abundancia celular es uno de los requisitos cruciales para la generación de injertos de ingeniería tisular.28]. El tejido adiposo es una rica fuente que puede aportar un gran número de células madre. El tejido adiposo contiene hasta 500 veces más células madre para la misma masa de médula ósea, una fuente de tejido tradicional para la extracción de células madre.29]. Además, las células madre se pueden extraer del tejido adiposo mediante un proceso de liposucción mínimamente invasivo.29]. Nuestro estudio reciente encontró que las células madre derivadas de tejido adiposo humano (ADSC) demuestran una excelente biocompatibilidad con el andamio coll-CS. El uso de un andamio activado por genes proangiogénicos mejoró aún más las respuestas regenerativas de las ADSC.30]. Sin embargo, los ADSC tienden a perder su fuerza tras la expansión [31]. Previamente, encontramos que una proteína anti-envejecimiento -Klotho podría mejorar significativamente la proliferación de ADSC humanas sanas y diabéticas [32]. La mayoría de los estudios generalmente usan la variante primaria -Klotho [33–35] y han demostrado que la proteína puede aumentar la vida útil de las ADSC al activar la actividad transcripcional de la telomerasa [33]. -También se ha descubierto que las MSC que sobreexpresan Klotho ejercen fuertes efectos antifibróticos en la lesión renal a través de la inhibición de Wnt/ -señalización de catenina [36]. Sin embargo, el papel de -Klotho en células madre permanece relativamente inexplorado.

Además de la diferencia en el enfoque de investigación entre los - y -Klotho, el antienvejecimientoLas proteínas Klotho aún no se han incorporado completamente a las estrategias de ingeniería de tejidos.para la cicatrización de heridas. Por lo tanto, en este estudio, buscamos estudiar el impacto funcional de un -Andamio activado por el gen Klotho en ADSC humanas para aplicaciones de cicatrización de heridas. Nosotrosinvestigó por primera vez las actividades transcripcionales de los factores de pluripotencia clásicos (Oct-4,Nanog y Sox-2), marcador de proliferación (Ki-67) y reguladores de cicatrización de heridas (TGF- 3 y TGF- 1) en los ADSC. Luego evaluamos la bioactividad de los medios acondicionados.generado por el andamio activado por genes cargados de ADSC para evaluar su potencial paracrino.En última instancia, examinamos la regeneración de la membrana basal (fibronectina, laminina,y colágeno IV) y proteínas asociadas a cicatrices ( -SMA y elastina) en los ADSC cargadosandamio activado por genes para evaluar la maduración controlada del tejido.

2. Resultados

2.1. -El andamio activado por el gen Klotho mejora transitoriamente la potencia de las ADSC humanas y los genes pro-reparadores

El análisis de expresión génica primero mostró que las ADSC en el andamio activado por genes sobreexpresaban la -gen Klotho más de 172-veces (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1A). Este hallazgo confirmó la interacción eficiente de las ADSC con el andamio activado por genes. El análisis del marcador de proliferación Ki-67 confirmó además que las ADSC en el andamio activado por genes también mantuvieron una capacidad proliferativa robusta durante 14 días (Figura1A). Habiendo confirmado la sobreexpresión del anti-envejecimiento -Gen Klotho, luego evaluamos el rejuvenecimiento de las células madre a través de la activación de factores de "pluripotencia" en las ADSC. En general, notamos una regulación transitoria de los tres factores de transcripción durante los 14 días (Figura1B). Sin embargo, las ADSC solo mostraron un aumento significativo en la expresión del gen Oct-4 que se mantuvo hasta el día 14. Específicamente, las ADSC mostraron un aumento de 2.5-veces (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). Los niveles del profibrótico TGF- 1 gen en el - Se encontró que las ADSC que sobreexpresan Klotho estaban a la par con las del grupo de andamiaje libre de genes durante los 14 días. Sin embargo, los niveles de antifibrótico TGF- 3 fueron significativamente (3.6-veces,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -Andamio activado por genes Klotho

Mejora la potencia paracrina de las ADSC humanas2.2.1. Bioactividad proangiogénica La prueba de bioactividad del CM generado por andamios activados por genes cargados de ADSC mostró por primera vez que podía controlar temporalmente la actividad metabólica en HUVEC. El día 3 CM mejoró significativamente la actividad metabólica en HUVEC, mientras que el uso de CM envejecido a partir del día 14 redujo significativamente la actividad metabólica de HUVEC (Figura2A). Habiendo observado esto, probamos el impacto proangiogénico del CM del día 3 y 14 en las HUVEC sembradas en Matrigel. Como se anticipó, el día 3 CM del grupo de andamiaje activado por genes significativamente (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Sin embargo, no se produjo ningún aumento adicional en la actividad angiogénica con el día 14 CM en comparación con el día 3 CM. Además, el día 14 CM de ambos grupos exhibió una eficiencia proangiogénica similar (Figura2C). En conjunto, nuestro hallazgo indica que el andamio activado por genes acelera transitoriamente la respuesta proangiogénica de las ADSC.

pro-fibrótico TGF- 1. ** y * indicap < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± Desviación Estándar (n = 3).

Figura 2. Bioactividad paracrina proangiogénica del andamio CM activado por el gen cargado de ADSC. (A) CM producido por el andamio activado por genes cargados de ADSC durante los 14 días demostró una capacidad para controlar temporalmente la actividad metabólica de HUVEC. (B) Día 3 CM del grupo de andamiaje activado por genes mejoró significativamente la formación de túbulos endoteliales y su ramificación en comparación con la del grupo de andamios sin genes. (C) Formación de túbulos y ramificación de células endoteliales 6 horas después de la exposición a CM de las ADSC armazón sembrado activado por genes y sin genes, * indica p <0.05. ¡Los datos representan la media! desviación estándar (n=3)

2.2.2. Curación y maduración de fibroblastos dérmicos

Uno de los hallazgos del estudio de angiogénesis es que a medida que madura el andamio activado por genes cargado de ADSC, ya no promueve la angiogénesis. Además, en el día 14, su potencia angiogénica fue similar a la del grupo de andamiaje libre de genes (Figura 2B, C). Por lo tanto, investigamos la influencia del día 14 envejecido CM en el cierre de la herida con fibroblastos dérmicos. Similar al resultado del estudio de angiogénesis, ambos grupos demostraron niveles similares de cierre de heridas con fibroblastos con el día 14 CM. Específicamente, ambos grupos curaron la herida en aproximadamente un 40 por ciento en 12 h (Figura 3A). Este hallazgo reveló que durante la maduración, el grupo de andamiaje activado por genes apoya, pero no promueve, el cierre de la herida por fibroblastos dérmicos.

Sin embargo, como los fibroblastos fueron estimulados con CM envejecido, estudiamos si las influencias de la expresión de proteínas de la matriz involucradas en la maduración de la herida. Como se anticipó, los fibroblastos dérmicos estimulados con CM del grupo de andamiaje libre de genes expresaron abundantemente la proteína colágeno I profibrótica (Figura 3B). Por el contrario, los fibroblastos estimulados con CM del grupo de armazón activado por genes demostraron una expresión un 50 por ciento menor (p < 0,05) de la proteína colágeno I. Mientras tanto, ambos grupos carecían por completo de la expresión de colágeno antifibrótico y no se observaron diferencias entre los dos grupos. En conjunto, implica que el andamio activado por genes mejora la respuesta moduladora de ADSCswound durante la maduración.

Figura 3. Influencia paracrina en la cicatrización y maduración dérmica. (A) El día 14 de edad, el CM de ambos grupos ejerció niveles similares de actividad de cierre de heridas en fibroblastos dérmicos adultos humanos en aproximadamente un 40 por ciento en 12 h. (B) El CM del andamio activado por genes redujo significativamente la expresión de colágeno profibrótico en los fibroblastos. " indica p < 0,05 Los datos representan la desviación estándar media=(n=3). En la Figura 3B, GAS y GFS representan andamio activado por genes y andamio sin genes, respectivamente

2.3. El andamio activado por el gen B-Klotho mejora la regeneración de la membrana basal con una respuesta antifibrótica mejorada en ADSC humanas

Habiendo observado la estimulación controlada de la funcionalidad de las ADSC por parte del andamio activado por genes, finalmente investigamos la respuesta de las ADSC hacia la regeneración de matrices y proteínas dérmicas. El andamio activado por genes mejoró considerablemente la regeneración de la membrana basal de las ADSC. Específicamente, el andamio activado por genes promovió significativamente la deposición de los componentes de la membrana basal laminina y colágeno IVFigura 4A). Después del análisis semicuantitativo, también notamos que la deposición de matriz siguió una tendencia en relación con el grupo de andamios sin genes. La tendencia observada fue fibronectina (1.0-veces) < laminina (2.1-veces, p < {{10}}.05) < colágeno IV (8.8-veces, p < 0,01). Una vez que se determinó la capacidad para regenerar la membrana basal, evaluamos la expresión de proteínas cruciales para una cicatrización cualitativa superior, como una cicatrización reducida. Las ADSC en el andamio activado por genes demostraron una expresión significativamente reducida (p < 0,05) de la proteína contráctil asociada a la cicatriz a-SMA. La expresión de a-SMA en las ADSC fue un 50 por ciento menor en relación con el grupo de andamios sin genes (Figura 4B). Por último, habiendo observado la expresión reducida de a-SMA, evaluamos la expresión de la proteína elastina de la matriz elástica. Las ADSC en el andamio activado por genes demostraron una expresión de elastina cualitativa relativamente superior a través de la deposición de una red fibrosa madura de elastina en comparación con las ADSC en el andamio sin genes (Figura 4B).

Figura 4. Deposición de proteínas de matriz favorables a la curación de heridas por parte de las ADSC en el andamio activado por genes el día 14. (A) Las ADSC en el andamio activado por genes demostraron una regeneración significativa. funcionamiento de la membrana basal en comparación con las ADSC en el andamio libre de genes. Las ADSC depositaron predominantemente una red relativamente madura de proteínas de colágeno IV, seguidas de laminina y fibronectina. (B) Las ADSC en el andamio activado por genes también expresaron 2- veces menos de la proteína SMA en comparación con las ADSC en el gen -andamio libre. En conjunto con sótano mem. regeneración de brana, las ADSC en el andamio activado por genes depositaron una matriz elástica cualitativamente mejor. Todas las imágenes fueron capturadas a través del objetivo 20x usando un microscopio Olympus IX73* y * indica p < 0.01 y p < 0.05 respectivamente. Barra de escala 50um. Los datos representan la desviación estándar media (n=3). - SMA y fibronectina se sometieron a inmunotinción doble.

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