El andamio activado por el gen Klotho antienvejecimiento promueve una respuesta de cicatrización de heridas rejuvenecedora en células madre derivadas de tejido adiposo humano

3. Discusión

Este estudio tuvo como objetivo investigar el impacto funcional de un anti-envejecimiento -Andamio activado por el gen Klotho en ADSC humanas para mejorar las aplicaciones de cicatrización de heridas. En general, encontramos que el andamio activado por genes ofrece una activación controlada de las capacidades regenerativas de las ADSC, como se muestra en la Figura5. Específicamente, el andamio activado por genes mejoró transitoriamente la potencia de las ADSC a través de la activación del factor de transcripción Oct-4. El andamio activado por genes también promovió la activación temprana del gen antifibrótico TGF- 3, un factor crucial para la curación controlada con cicatrices reducidas. Además, las ADSC activadas controlaron temporalmente la angiogénesis endotelial y apoyaron la curación de fibroblastos dérmicos a través de la señalización paracrina. Hacia la maduración, las ADSC también controlaron la activación de la respuesta profibrótica en los fibroblastos dérmicos. Mientras tanto, las ADSC en el andamio activado por genes regeneraron efectivamente la membrana basal dérmica al mejorar la deposición de laminina y colágeno IV. Esta respuesta se asoció además con una reducción asociada a la cicatriz. -Expresión de proteína SMA y depósito de matriz de elastina cualitativa mejorada. Nuestro estudio determinó colectivamente que el -Activado por el gen KlothoCistancheposee un enorme potencial paracicatrización de la heriday podríaterapia avanzada basada en células madre para rejuvenecer aplicaciones curativas.

Figura 5. Un esquema del impacto funcional del andamio activado por el gen B-Klotho en las ADSC humanas para aplicaciones de cicatrización de heridas. Los hallazgos clave de este estudio son (1) la mejora transitoria de la pluripotencia de las células madre y la respuesta antifibrótica, (2) el control paracrino mejorado hacia la angiogénesis y la remodelación del colágeno profibrótico en los fibroblastos dérmicos y, en última instancia, (3) el aumento de la maduración de la membrana basal con control sobre la expresión de proteínas asociadas a la cicatriz Las líneas punteadas para la matriz de elastina implican una deposición cualitativa mejorada.

Haz Clic Aquí Para Saber Cómo CistancheEfectos de curación de heridas

En las estrategias de cicatrización de heridas, la terapia génica basada en plásmidos se aplica para mejorar transitoriamente las respuestas celulares hasta que se complete la reparación de la herida.37]. Nuestro andamio activado por genes también muestra que la terapia -El gen Klotho se regula transitoriamente durante 14 días. La expresión significativamente mejorada (170- veces) de la -El ARNm de Klotho en el día 3 podría atribuirse al promotor CMV inmediato-temprano que se sabe que mejora la activación transcripcional del transgén codificado.38]. Sin embargo, en las MSC, el CMV podría sufrir metilación del ADN o desacetilación de histonas que pueden reducir la expresión del transgén.39]. Además, los plásmidos generalmente son episomas que no se replican, lo que limita la transferencia del transgén a las células en división y provoca una disminución en la expresión del transgén con el tiempo.40]. La presencia de marcadores heterocromáticos provenientes de las secuencias bacterianas delplásmido podría reprimir aún más la expresión transgénica [41], contribuyendo en general a una expresión génica transitoria.

Una de las vías seguidas en el tratamiento de heridas difíciles de curar es la aplicación de andamios bioactivos sembrados con células. Una de las razones es su capacidad para promover la reparación rápida de heridas. Las células metabólicamente activas en el injerto secretan factores paracrinos y se diferencian, orquestando los complejos eventos de señalización en el entorno de la herida.42]. Las células madre, en particular, tienen una capacidad única para detectar estímulos externos y modular su respuesta para restaurar la homeostasis.43]. Sin embargo, las células madre pierden su progenitor cuando se expanden in vitro para generar un gran número de células para el injerto. Nuestro estudio muestra que la sencillez se puede mejorar transitoriamente utilizando un andamio activado por genes que lleva un gen antienvejecimiento. -Klotho. Específicamente, notamos que el andamio activado por el gen antienvejecimiento mejoró la expresión del gen de la troncalidad Oct-4 en las ADSC. Oct-4 es uno de los factores transcripcionales clave en las células madre embrionarias y es esencial para el desarrollo embrionario controlado [44]. En las ADSC, la activación del gen Oct-4 puede promover su potencial de proliferación y diferenciación [45]. Por lo tanto, el aumento de la expresión de Oct-4 puede facilitar la rápida diferenciación de las ADSC en el andamio activado por genes en células huésped y ayudar en el proceso de curación.

Habiendo observado la activación del gen Oct-4 en las ADSC, luego evaluamos la potencia angiogénica de las ADSC. La angiogénesis es crucial para la integración eficiente del injerto con el tejido huésped.46]. Las células del injerto desencadenan la angiogénesis a través de la secreción de factores paracrinos. La angiogénesis también es un evento crucial para el desarrollo del tejido de granulación y su actividad disminuye a medida que el tejido de granulación madura.47]. Esta limitación programada de la actividad angiogénica en las últimas etapas de la cicatrización es esencial para controlar la cicatrización y la hipergranulación que pueden impedir la reepitelización.48]. Nuestro hallazgo también muestra que las ADSC en el andamio activado por genes pueden mejorar el brote endotelial y controlar su crecimiento a través de la señalización paracrina. Además, los aumentos significativos en la actividad metabólica de las células endoteliales y el brote en respuesta al día 3 CM demuestran el potencial del andamio activado por genes cargados de ADSC para integrarse rápidamente con el tejido huésped. Además, el uso de células madre CM es un enfoque libre de células comúnmente adoptado para mejorar la calidad de la cicatrización de heridas.49]. Como limitación, reconocemos que las células endoteliales dérmicas adultas servirían como un mejor modelo celular para estudiar la angiogénesis; sin embargo, para mantener la consistencia con nuestros estudios previos y las HUVEC son ampliamente aceptadas como el candidato celular "estándar de oro" [50], adoptamos el ensayo de angiogénesis HUVECs.

Un aumento en la actividad de remodelación de fibroblastos es una característica general de la maduración del tejido de granulación.51]. Durante esta etapa, las matrices de colágeno III se reemplazan gradualmente por fibras de colágeno I más fuertes.51]. Las fibras de colágeno promueven la contracción de la herida [52], y la contracción de la herida es indispensable para el cierre completo de la herida [53]. Sin embargo, un aumento sostenido agresivo en la deposición de colágeno I puede aumentar la formación de cicatrices.54]. El control de la cicatrización es crucial, ya que puede inhibir el desarrollo de otros apéndices de la piel, como los folículos pilosos, las glándulas sebáceas y las glándulas sudoríparas, por ejemplo, en las heridas por quemaduras [54]. Nuestro hallazgo demuestra que el CM envejecido (día 14) del grupo de andamios activado por genes podría controlar la expresión de colágeno I profibrótico en fibroblastos dérmicos adultos. Este efecto controlado sobre los fibroblastos se produjo sin influencia adicional sobre la migración de los fibroblastos o sus expresiones de colágeno III antifibrótico en relación con el grupo de armazón libre de genes. Por lo tanto, sugerimos que el andamio activado por genes cargados de ADSC puede ofrecer un mejor control para limitar la cicatrización in vivo a través de la expresión controlada de colágeno I. Li et al., también han demostrado que las ADSCs CM pueden reducir significativamente la expresión de colágeno I en fibroblastos derivados de cicatrices hipertróficas.55]. Otro estudio realizado por Wang et al. demostró una reducción similar en la expresión de colágeno I en fibroblastos derivados de queloides [56], demostrando colectivamente el potencial antifibrótico del CM de las ADSC.

Uno de los hallazgos significativos que observamos con la aplicación del -El andamio activado por el gen Klotho es la regeneración mejorada de la membrana basal en las ADSC. La regeneración de la membrana basal es esencial para la maduración de los vasos sanguíneos y la reepitelización completa.57,58]. Es importante destacar que la tendencia en la que las proteínas laminina(2.1-veces) y el colágeno IV (8.8-veces) están regulados al alza, lo que indica una mayor maduración de la membrana basal en el grupo de andamiaje activado por genes [59]. Además de actuar como factor antienvejecimiento [60], el beta klotho funciona para mejorar la sensibilidad al factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) por los receptores de FGF [61]. Además, se ha encontrado que un aumento en la señalización de FGF promueve la maduración de la membrana basal a través de la deposición de laminina y colágeno IV.62]. Por lo tanto, considerando el papel de beta klotho como co-receptor de FGF, el aumento de la maduración del sótano en el grupo de andamiaje activado por genes está potencialmente mediado por un aumento en la señalización de FGF de ADSC.

El componente de la membrana basal notablemente regulado al alza en el grupo de andamiaje activado por genes es la proteína colágeno IV. La proteína colágeno IV representa el 50 por ciento de todas las membranas basales.63] y proporciona estabilidad estructural a la membrana basal [59]. Sin embargo, el envejecimiento reduce significativamente la expresión de colágeno IV en la unión dermoepidérmica.58,64] y la falta de colágeno IV puede promover la patogénesis de la cicatriz [65]. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que el aumento de la potencia regenerativa de la membrana basal del andamio activado por genes cargados de ADSC puede ayudar significativamente a mejorar la curación en pacientes de edad avanzada. Otros estudios también han demostrado que la ECM derivada del tejido adiposo posee un tremendo potencial terapéutico para la reparación de la piel.66]. Además, los injertos de ingeniería tisular ricos en laminina y colágeno IV también son de interés para la reparación del epitelio respiratorio.67]. 

Además del control profibrótico hacia los fibroblastos, nuestro estudio muestra además que las ADSC en el andamio activado por genes también expresan una expresión 2- veces menor de la proteína asociada a la cicatriz. -SMA [68]. Aunque no evaluamos su impacto in vivo, la reducción de los efectos locales -La expresión de SMA es crucial para mejorar la curación cualitativa [69]. El uso de agentes fibróticos como la bleomicina [70] podría ser una forma de evaluar mejor las propiedades antifibróticas de las ADSC/construcción de armazón activada por genes in vitro; sin embargo, nuestro enfoque fue establecer el potencial terapéutico provisional de la construcción.

Otro indicador de que el andamio activado por genes cargado de ADSC puede mejorar la curación cualitativa es el depósito de matriz de elastina fibrosa en lugar de secreciones extracelulares irregulares en el grupo de andamios sin genes. El depósito de elastina es una de las principales actividades que impulsan la curación de heridas fetales sin cicatrices.71]. Sin embargo, las pieles adultas carecen del depósito de elastina [71]. Como tal, la tropoelastina, un precursor de la elastina, a menudo se incorpora en andamios de biomateriales para controlar la cicatrización en la cicatrización de heridas.72]. En conjunto, nuestros hallazgos implican que los ADSC/ -La construcción de armazón activada por el gen Klotho puede conferir una fuerte respuesta antifibrótica in vivo.

4. Materiales y Métodos

4.1. Preparación de andamio activado por genes

El andamio activado por genes se desarrolló mediante un proceso de 2-pasos. En primer lugar, se fabricaron armazones sólidos porosos de colágeno y sulfato de condroitina mediante una suspensión liofilizada de colágeno tipo 1 de tendón bovino y sulfato de condroitina-6-derivado de cartílago de tiburón (Sigma, Reino Unido). Se utilizó un proceso optimizado de liofilización diseñado para crear poros uniformes para producir los andamios [73]. Basado en nuestro protocolo publicado [74], los andamios liofilizados luego se trataron deshidrotérmicamente (DHT) a 105◦C al vacío para esterilización y mejora mecánica. A continuación, los andamios esterilizados se entrecruzaron químicamente con una solución de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida 14 mM y N-hidroxisuccinimida 5,5 mM (proporción molar 2,5 de EDC/NHS) (Sigma, Reino Unido) para mejorar aún más la estabilidad mecánica [75]. A continuación, los andamios reticulados se lavaron con PBS (Gibco, Paisley, Reino Unido) para eliminar los productos químicos residuales. Una vez que los andamios estuvieron listos, se prepararon poliplejos en una relación N/P10 (relación nitrógeno a fosfato) mezclando un volumen predeterminado de solución de polietilenimina ramificada (PEI) con ADN plasmídico (pDNA) que codifica para el gen beta-Klotho humano ( -Klotho), obtenido de SinoBiological, Beijing, China. La relación N/P10 se eligió en base a nuestros estudios previos que encontraron que los poliplejos formulados en una relación N/P 10 podrían formar efectivamente nanopartículas catiónicas pequeñas y estables con plásmidos tan grandes como GLuc (5,76 kb) [21,23]. Antes de su uso, los plásmidos se diluyeron en agua libre de endotoxinas para obtener una concentración de trabajode 0.5µg/µL. El plásmido contiene citomegalovirus inmediato temprano mejorado humano(CMV3) promotor para promover la expresión estable y transitoria de alto nivel del codificadogen en células de mamíferos.

La mezcla de plásmido/PEI se dejó reposar durante 30 minutos para autoensamblarse en poliplex.nanopartículas. Luego, las nanopartículas se cargaron en remojo en los andamios pipeteandovolúmenes iguales de la solución polyplex por lado del andamio. Un total de 2µg ADNp fueutilizado por andamio para desarrollar el andamio activado por genes.

4.2. Siembra celular activada -Andamio activado por genes Klotho

Las ADSC humanas (iXCells Biotechnologies, San Diego, CA, EE. UU.) se expandieron al paso 4 en el medio de crecimiento de ADSC (n.º de cat. MD0003) suministrado por la empresa. Un total de 5× 105 ADSC (2,5× 105 por lado) luego se sembraron por andamio libre de genes (control,n = 3) o andamio activado por genes (prueba,n = 3). Después de dejar que las células se asentaran durante unos 20 minutos, se añadieron 2 ml de medio de transfección OptiMEM (Gibco, Reino Unido) y los andamios celularizados se incubaron a 37ºC.◦C durante 24 horas. Después de la incubación de 24 h, los andamios celularizados libres de genes o activados por genes se transfirieron a nuevas placas de 12-pocillos y se alimentaron con 2 ml de medio de crecimiento de ADSC. A continuación, se realizó el cambio de medio cada 3 o 4 días hasta el día 14 mediante la recolección de 1 ml de medio acondicionado (CM) y su sustitución por un volumen igual de medio fresco. Todos los CM se almacenaron en−80 ◦C hasta el análisis.

4.3. Análisis qRT-PCR para determinar -Sobreexpresión del gen Klotho y activación de genes funcionales

Con el fin de determinar la regulación transitoria de los genes diana, las células se recogieron en los días 3 (temprano) y 14 (tardío) después de la siembra en los andamios sin genes o activados por genes. Las células se lisaron primero usando el reactivo de lisis Qiazol (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.). A continuación, se añadió cloroformo para separar el lisado celular en fases de proteína, ADN y ARN. Utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Manchester, Reino Unido), se extrajo el ARN y se determinó su calidad y cantidad utilizando un lector de placas Multiskan Go (Thermo Scientific, Reino Unido) con la absorbancia establecida en 260 nm. A continuación, se eliminó el ADN genómico mezclando el ARN con un tampón de eliminación de ADN genómico (Qiagen, Manchester, Reino Unido) y calentándolo a 42ºC.◦C durante 2 min. Posteriormente, se realizó la transcripción inversa para preparar el ADNc. Duplicados de ADNc por réplica (n = 3) se cargaron en las placas qRT-PCR y luego se ejecutó el ensayo utilizando los cebadores enumerados en la Tabla1. El cambio de veces en la expresión de ARNm en relación con las células en el andamio libre de genes se calculó utilizando el 2−∆∆Connecticutmétodo a partir de promedios de tres repeticiones por grupo. Se usó GAPDH humano (Hs_GAPDH_1_SG, Cat. No. QT00079247) como gen de limpieza.

4.4. Análisis de bioactividad de factores secretados por las ADSC en -Andamio activado por genes Klotho

4.4.1. Análisis de bioactividad proangiogénica

4.4.2. Análisis de curación y maduración de fibroblastos dérmicos

Después del ensayo de angiogénesis, investigamos la potencia del CM para la cicatrización dérmica empleando un ensayo de rascado de fibroblastos dérmicos adultos humanos (iXcells, Cat. n.º 10 HU-014). Para este estudio, elegimos específicamente el CM envejecido desde el día 14 para estudiar su influencia en el cierre de heridas de fibroblastos durante la maduración. Un total de 1× 104 Se sembraron células/pocillo en una 96-placa de pocillos y se incubaron durante la noche en el medio de crecimiento de fibroblastos. Al día siguiente, se creó una herida en la monocapa rascando horizontalmente una punta de pipeta de 200 uL a través del pocillo. Luego, la monocapa se enjuagó con PBS para eliminar cualquier residuo y se alimentó con el CM. El cierre de la herida se registró entre 12 y 16 h después del rasguño. La inmunotinción se utilizó para estudiar la expresión de colágeno I profibrótico (1:100, Novusbio, Reino Unido) y colágeno III antifibrótico (1:100, Novusbio, Reino Unido) en los fibroblastos. Los fibroblastos se contrastaron con rodamina (1:800, Abcam, Reino Unido) para obtener imágenes de F-actina. La inmunotinción se realizó como se describe en la Sección4.5, a excepción del procesamiento y desparafinado de tejidos. Tanto las HUVEC como los fibroblastos se usaron en el paso 4.

4.5. Imágenes de inmunofluorescencia de proteínas de matriz extracelular

Después de 14 días de cultivo, los andamios celularizados sin genes o activados por genes se recogieron para la detección de la deposición de matriz usando inmunofluorescencia. El procesamiento de las muestras se realizó como se describió anteriormente. Brevemente, los andamios se lavaron primero con PBS y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 por ciento durante 20 min. A continuación, las muestras fijadas se procesaron utilizando el protocolo estándar de desparafinización. Luego, los bloques se cortaron en 7-µm rebanadas gruesas y recolectadas en portaobjetos cargados. A continuación, las secciones se desparafinizaron con xileno, seguido de la rehidratación de la sección con gradientes decrecientes de etanol. Posteriormente, las células se permeabilizaron con 0,2 por ciento de Tween®20 (Sigma-Aldrich, Francia) solución en PBS durante 30 min (lavado de 10 min× 3) y se bloqueó usando NGS al 10 por ciento (suero de cabra normal, Invitrogen, Rockford, IL, EE. UU.)/BSA al 5 por ciento/glicina 0,3 M (preparado en solución permeabilizante) durante 1 hora. Después del bloqueo, los portaobjetos se enjuagaron en PBS y luego se incubaron a 4◦C durante la noche con los anticuerpos contra las proteínas de la matriz diana enumeradas en la Tabla2. Al día siguiente, los portaobjetos se enjuagaron en PBS tres veces durante 2 a 3 minutos cada uno para eliminar los anticuerpos primarios no unidos. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron en IgG anti-ratón de cabra conjugada con Alexa 488-(A32723, Invitrogen, Reino Unido) o IgG anti-conejo de cabra conjugada con Alexa 594-(A11012, Invitrogen, Reino Unido) a 1: Dilución 800 a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. El paso de enjuague se realizó como antes y se contrastó para núcleos utilizando el medio de montaje con DAPI (ab104139, Abcam, Reino Unido). A continuación, se tomaron imágenes de los portaobjetos utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus BX43, Japón) a 20× objetivo. Las muestras incubadas solo con anticuerpos secundarios se usaron como controles.

Cuantificación de imágenes

Se usó el software Image] (Image, NIH, MD, EE. UU.) para determinar semicuantitativamente la cantidad de proteínas expresadas. Para cada marcador, primero se determinó un valor de umbral constante a través de imágenes preliminares de varias secciones. Usando el valor de umbral establecido, se determinó la densidad integrada (área teñida x valor gris medio) de las imágenes y luego se normalizó al número de células (recuento DAPI) para dar una densidad de fluorescencia media final por célula. Se cuantificó un promedio de 8-10 imágenes aleatorias por réplica con un mínimo de tres réplicas por grupo. Los promedios obtenidos de las tres réplicas/grupo se usaron luego para medir la expresión relativa entre los grupos.

4.6. Análisis estadístico

Todos los resultados se expresan como media más desviación estándar. La prueba t de dos colas no pareada se usó generalmente para calcular la significancia estadística entre los grupos, donde p < 0.05 se consideró significativa

Este estudio mostró que laantienvejecimiento -Cistanche activada por el gen Klothoofertas controladas activación de la capacidad regenerativa de ADSCs. Los hallazgos clave de este estudio son (1)mejora transitoria de la pluripotencia de las células madre y la respuesta antifibrótica, (2)control paracrino mejorado hacia la angiogénesis, y remodelación del colágeno profibróticoen fibroblastos dérmicos y, en última instancia, (3)aumento de la maduración de la membrana basalcon control sobre la expresión de proteínas asociadas a cicatrices. En conclusión, estos resultados sugierenque los ADSC cargados -El andamio activado por el gen Klotho puede poseer un gran potencialel tratamiento de una amplia gama de heridas dérmicas.

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Conflictos de interés:Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses.

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