Iridoides antiinflamatorios de los tallos de Cistanche Deserticola cultivados en el desierto de Tarim

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

RESUMEN

Para determinar los componentes químicos deCistanche deserticacultivado en el desierto de Tarim, se llevó a cabo una investigación fitoquímica sistemática. Los constituyentes se aislaron mediante gel de sílice, Sephadex LH-20, gel MCI, cromatografía en columna ODS y HPLC semipreparativa. Sus estructuras se determinaron sobre la base de análisis espectroscópicos de MS y RMN, por métodos químicos y/o comparación con datos de la literatura. Las actividades antiinflamatorias de los aislados se evaluaron por sus efectos inhibitorios sobre la producción de óxido nítrico (NO) inducida por lipopolisacárido (LPS) en células microgliales de ratón BV-2. Nueve iridoides fueron aislados e identificados comodesertósido de cistancheA (1), cistanina (2), cistaclorina (3), 6-desoxicatalpol (4), glucósido (5), kankanósido A (6), ajugol (7), bartsiósido (8) y {{9 }}ácido epi-logánico (9). El compuesto 9 exhibió una potente inhibición de la producción de NO con un valor de IC50 de 5,2 μmol·L-1, comparable al control positivo quercetina (4,3 μmol·L-1). El compuesto 1 era un nuevo iridoide y los compuestos 5, 6 y 8 se aislaron de esta especie por primera vez.

[PALABRAS CLAVE] Cistanche desertica; iridoides; Elucidación de la estructura; Actividad antiinflamatoria

Cistanche desertica

Introducción

Cistanches Herba(Roucongrong en chino) perteneciente a la familia Orobanchaceae, se distribuye principalmente en el norte de África, Arabia y países asiáticos [1]. Como tónico muy conocido en la medicina tradicional china (MTC), los tallos deCistanchedeserticolayCistanchetubulosase han utilizado durante mucho tiempo en China y Japón para el tratamiento de la deficiencia renal, la infertilidad femenina, la leucorrea mórbida, la neurastenia y el estreñimiento senil [2-3]. Investigaciones fitoquímicas anteriores han

[Financiación de la investigación] Este proyecto recibió el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81222051), el Proyecto de Investigación Científica de la Medicina Tradicional China (Nº 201307002) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo de Tecnología Clave "Innovación de Nuevos Fármacos" de China.

Estos autores no tienen ningún conflicto de interés que declarar. Publicado por Elsevier BV Todos los derechos reservados indica la presencia deglucósidos de feniletanoide(PhGs), iridoides, lignanos y polisacáridos en elCistanche[4], y algunos de los aislados presentaron efectos neuroprotectores, hepatoprotectores, antiinflamatorios, antibacterianos, antivirales y antioxidantes [5-6].

A fines de la década de 1990, con el fin de proteger el campo petrolífero de Tazhong y controlar el desierto, la planta de fijación de arena Haloxylon ammodendron (CA Mey.) Bunge, el anfitrión deCistanchedeserticola, fue introducido del norte al sur de Xinjiang, y grandes cantidades deC. deserticolaeran cultos. Las condiciones climáticas y el entorno de crecimiento en el sur son muy diferentes a los del norte de Xinjiang. Si los componentes químicos deCistanchedeserticolacultivado en el sur de Xinjiang varían o no no está claro. Para determinar los componentes químicos deCistanchedeserticolacultivadas en el desierto de Tarim, en el presente estudio se llevó a cabo una investigación fitoquímica sistemática. En este documento, se informa sobre el aislamiento y la elucidación estructural de un nuevo glucósido iridoide (1) junto con ocho análogos conocidos (2–9), junto con sus actividades antiinflamatorias.

Efecto antiinflamatorio deCistanche desertica

Resultados y discusión

El extracto etanólico acuoso al 85 por ciento de los tallos deCistanchedeserticolase suspendió en H2O (10 L) y se extrajo con EtOAc (10 L × 3) y n-BuOH sucesivamente. Los extractos de EtOAc y n-BuOH se sometieron a cromatografía en columna de gel de sílice, Sephadex LH-20, gel MCI y ODS (CC) y HPLC semipreparativa para producir un nuevo (1) y ocho iridoides conocidos ({ {9}}) (Figura 1).

El compuesto 1 se aisló como un polvo amorfo blanco con rotación óptica negativa ([a]20 -118.0, c 0,1, MeOH). Su espectro IR mostró fuertes bandas de absorción alrededor de 3 393 cm−1 atribuibles a los grupos hidroxi. Tiene una fórmula molecular de C16H26O9 determinada por el ion cuasimolecular en m/z 385.148 5 [M más Na] más (Calcd. para C16H26O9Na, 385.146 9) y m/z 401 .122 8 [M más K] más (Calcd. para CHOK, 401.120 8) correlaciones de H-1 a C-1′, H-10 a C-7, C-8 y C-9, y de H-11 a C-3, C-4 y C{{32 }} también apoyó la elucidación anterior.

La estereoquímica del compuesto 1 se determinó mediante la comparación de los desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento con los datos de la bibliografía y mediante el análisis del espectro NOESY. La relación de H-5 a H-9 se determinó como cis a partir de su constante de acoplamiento (10,5 Hz) [8-9]. Para los iridoides más naturales, las configuraciones de C-1-OH, H-5 y H-9 son , y los desplazamientos químicos de RMN de 13C de C{{10} } y C-1′ están generalmente en δC 93–98 y 97–101, respectivamente. Mientras que, para los de configuración -, las resonancias de C-1 y C-1′ están, en promedio, 5–6 desplazadas hacia abajo [10-11]. Los datos de 13C NMR de com-16 26 9 en el ( plus )-HR-ESIMS y respaldados por los datos de 13C NMR (Tabla 1), que indican 4 grados de insaturación. Hidrólisis ácida-1Tabla 1 1H NMR (500 MHz) y 13C NMR (125 MHz) datos de 1 (δ en ppm, J en Hz) del compuesto 1 con 2 mol, L de ácido trifluoroacético producido D-glucosa, que fue identificado por análisis de sus derivados de silano por análisis GC. La configuración relativa en el centro anomérico del glucosilo se asignó a partir de la constante de acoplamiento de 8,0 Hz. Los datos de RMN de 1H y 13C (Tabla 1) del compuesto 1, que se asignaron sin ambigüedad mediante varios experimentos de RMN 2D, mostraron señales asignables a dos metilos en δH 1,23 (3H, s, H-10) y 1,52 (3H, br s, H-11), un metileno en δH 1,70 (1H, dt, J=13,5, 5,5 Hz, H-6 ) y 1,92–1,98 (1H, m, H -6 ), tres metinos en δH 2,47 (1H, br d, J= 10,5 Hz, H-9), 2,67–2,72 (1H, m, H-5 ), y 3,62 (1H, tipo t, J= 5,5 Hz, H-7), y un grupo acetal insaturado , δH 5,40 (1H, d, J=2. 0 Hz, H-1), 5,92 (1H, br s, H-3), junto con un protón anomérico de -D-glucopiranosilo en δH 4,61(1H, d, J=8. 0 Hz, H-1′). Los datos de RMN de 1H y 13C del compuesto 1 fueron muy similares a los del lado A de Lankan (6) excepto por las señales obvias sin blindaje de H-7 [δH 3.62 (1H, t-like, J=5 0,5 Hz)] y C-7 (δC 79,8), lo que indica la hidroxilación de la posición C-7 [7]. Esta deducción fue respaldada por análisis de 1H-1H COSY de H-1/H-9/H-5/H-6/H{{127} } y de las correlaciones HMBC de H-7 a C-5, C-6, C-8, C-9 y C-10 ( Figura 2). El otro HMBC

La libra 1 informada aquí (Tabla 1) indicó las configuraciones normales para C-1-OH, H-5 y H-9. Las configuraciones relativas de H-7 y H3-10 se determinaron a partir del espectro NOESY (Fig. 2), en el que las correlaciones de NOE entre H-1 y H3-10, y entre H3-10 y H-7 indica que estos protones están todos en la misma cara. Ninguna correlación NOESY entre H3-10 y H-9 sugirió que H-9 y H3-10 están en la cara opuesta de la molécula. Por lo tanto, la estructura del compuesto 1 se elucidó como 7-hidroxilo-Lankan lado A denominadocistadesiertosideA.

Los compuestos conocidos fueron identificados como ciertos (2) [12],cistaclorina(3) [12], 6-desoxicatalpol (4) [13], glucósido (5) [14], lado A de Lankan (6) [7], lugol (7) [15], bartsiósido (8) [16], y 8-ácido epi-orgánico (9) [17] en comparación con los datos de RMN con lo reportado en la literatura. Las actividades antiinflamatorias de estos iridoides aislados se evaluaron por sus efectos inhibidores sobre la producción de NO inducida por LPS en células microgliales BV-2, y sus citotoxicidades se probaron primero en células BV-2 con tratamiento con LPS durante 24 H. Las purezas de los aislados superan el 95 por ciento según el análisis espectroscópico de RMN de 1H. Ninguno de los aislados mostró citotoxicidad significativa a una concentración de 40 μmol·L−1 en células BV-2 (Tabla 2). El compuesto 9 mostró un potente efecto inhibidor sobre la producción de NO con un valor de CI50 de 5,2 μmol·L-1, comparable con el control positivo de quercetina (4,3 μmol·L-1), mientras que los otros no mostraron ningún efecto notable en el test. concentración de 40 μmol·L−1 (Tabla 2). El análisis preliminar de la relación estructura-actividad indicó que la presencia de un grupo carboxilo en la posición C-4 en el compuesto 9 podría estar relacionada con su actividad significativa. En resumen, se aislaron un iridoide nuevo y ocho conocidos de los tallos deC. deserticolacultivadas en el desierto de Tarim y el compuesto 9 presentó un notable efecto inhibitorio sobre la producción de NO inducida por LPS en células microgliales BV-2. Todos los iridoides conocidos han sido reportados previamente en la naturaleza.C. deserticola[7, 12-17] y, por lo tanto, no hay una diferencia obvia en la constitución química de los iridoides y los feniletanoides entre losC. deserticolacultivado en el desierto de Tarim con los otros hábitats, en consideración combinada de nuestro último informe [19].

Cistanche desertica: efecto antiinflamatorio

Experimental

Procedimientos experimentales generales

Los espectros IR se registraron en un espectrómetro infrarrojo Nicolet Nexus 470 FT. Los espectros de RMN se obtuvieron en un espectrómetro Varian Inova-500. Los espectros de masas HR se midieron en un sistema de masas Bruker APEX IV FT-MS (7,0 T) equipado con una fuente ESI. El ESI-MS se midió en un espectrómetro de MS con trampa de iones Agilent 6320. Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetro Rudolph AUTOPOL IV. Los puntos de fusión se determinaron en un aparato de punto de microfusión con pantalla digital X-4 (sin corregir). La HPLC semipreparativa se llevó a cabo en un instrumento Waters 600 con una columna ODS (Alltech, 250 mm × 10 mm DI, 5 µm). Los análisis de GC se realizaron en un cromatógrafo de gases VARIAN CP-3800 con una columna DB-5 (0,25 mm × 30 m). La cromatografía en columna se realizó en gel de sílice (malla 200–300, Qingdao Marine Chemistry Ltd., China), gel MCI (CHP20P, 75–150 μmol·L−1, Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Japón), Sephadex LH{{24 }} (Amersham Biosciences, Suecia) y ODS C18 (40–63 μm; Merck, Alemania). La TLC se llevó a cabo en placas de gel de sílice GF254 recubiertas previamente con vidrio. Las manchas se visualizaron bajo luz ultravioleta o rociando con una solución de etanol de ácido sulfúrico al 5 por ciento.

Material vegetal

Los tallos de C. deserticola se recolectaron en el desierto de Tarim, región autónoma de Xinjiang Uygur, China, y fueron identificados por el profesor TU Peng-Fei. Se depositó un espécimen de comprobante (No. CD201011) en el Herbario del Centro de Investigación Moderna de Medicina Tradicional China de la Universidad de Pekín. Extracción y aislamiento Los tallos secos de C. deserticola (15,3 kg) se cortaron finamente y se extrajeron con etanol acuoso al 85 por ciento (120 L × 1 h × 3). El residuo concentrado (4,5 kg) se suspendió en H2O (10 L) y se extrajo con EtOAc (10 L × 3) y n-BuOH (10 NAN Ze-Dong, et al. / Chin J Nat Med, 2016, 14(1 ): 6165 – 64 – L × 3) sucesivamente. Los compuestos 2–6 se obtuvieron del extracto de EtOAc, mientras que los compuestos 1 y 7–9 se obtuvieron del extracto de n-BuOH.

El extracto de EtOAc (65,8 g) se sometió a CC de gel de sílice (malla 200–300), utilizando un sistema disolvente en gradiente de CHCl3/MeOH ( 50: 1, 20: 1, 10: 1, 6: 1, 2: 1 y 1: 1), para obtener diez fracciones (Fr. 1– Fr. 10). Padre 2 (5,3 g) se separó con Sephadex LH-20 CC, eluyendo con CHCl3/MeOH (1:1) para producir tres fracciones principales (Fr. 2-1, Fr. 2-2 y Fr. 2-3). Padre 2-3 se separó con gel de sílice CC usando PE/Me2CO (50 : 1, 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 2 : 1, 1 : 1 y 0 : 1) para producir cuatro fracciones ( Fr. 2-3-1–Fr. 2-3-4). Padre 2-3-2 se separó mediante gel de sílice CC, eluyendo con PE/CHCl3/MeOH (8:8:1) para producir el compuesto 3 (20,6 mg). El compuesto 2 se obtuvo de Fr. 2-3-3 tras purificación por cromatografía sobre gel de sílice CC, eluyendo con PE/CHCl3/MeOH (5:5:1). Padre 4 (2,5 g) se separó con Sephadex LH-20 CC, eluyendo con CHCl3/MeOH (1:1), para producir tres fracciones (Fr. 4-1, Fr. 4-2 y Fr. 4-3). Padre 4-2 se sometió a gel CC MCI (MeOH/H2O, 10: 90 a 90: 10, V/V) para producir tres fracciones principales (Fr. 4-2-1, Fr. 4-2-2, y el padre 4-2-3). Padre 4-2-1 se purificó mediante HPLC semipreparativa [CH3CN-H2O (10: 80)] para producir el compuesto 4 (32,3 mg) y 5 (15,0 mg), mientras que el Fr. 4-2-2 se purificó mediante HPLC semipreparativa [CH3CN-H2O (10: 80)] para producir el compuesto 6 (8,3 mg). El extracto de n-BuOH (536 g) se sometió a gel de sílice CC (malla 200–300), usando un sistema de solventes en gradiente de CHCl3/MeOH (20: 1, 10: 1, 6: 1, 2: 1, 1: 1, 0: 1), para dar diez fracciones mayores (Fr. D1–Fr. D10). Padre D5 (3,0 g) se sometió a gel CC MCI (MeOH/H2O, 10: 90 a 80: 20, V/V) para producir tres fracciones (Fr. D5-1–Fr. D5-3 ). Padre D5-2 (120 mg) se separó con gel de sílice CC (malla 200–300, 10,0 g; PE/EtOAc/MeOH 3:3:1) para dar el compuesto 8 (12,5 mg). Padre D8 (4,5 g) se separó mediante Sephadex LH-20 CC, eluyendo con MeOH para producir tres fracciones (Fr. D8-1–Fr. D8-3). Padre D8-3 se separó sobre una columna abierta de SAO (MeOH/H2O, 20: 80 a 80: 20, V/V) para obtener tres fracciones (Fr. D8-3-1–Fr. D{{157 }}). Padre D8-3-1 se sometió a HPLC semipreparativa [CH3CN-H2O (8: 90)] para dar el compuesto 1 (2,3 mg). Padre D9 (10,1 g) se separó mediante la columna Sephadex LH-20, eluyendo con MeOH, para producir tres fracciones principales (Fr. D9-1–Fr. D9-3). Padre D9-3 se sometió a una columna de gel MCI (MeOH/H2O, 0:100 a 50:50, V/V) para dar los compuestos 7 (15,3 mg) y 9 (45,5 mg). Cistadesertósido A (1): Polvo amorfo blanco. [] 20 D -118,0 (c 0,1, MeOH); IR (KBr) νmáx: 3 393, 1 071, 1 028 cm−1 ; ( más )-HRESI-MS m/z 385.146 9 [M más Na] más (Calcd. para C16H26O9Na, 385.148 5) y m/z 401.120 8 [M más K] más (Calcd. para C16H26O9K, 401.122 8); Datos de RMN de 1H y RMN de 13C, consulte la Tabla 1.

Hidrólisis ácida del compuesto 1

El compuesto 1 (1,0 mg) se agitó a 90 grados durante 5 h con 2 mol·L−1 de CF3COOH (EtOH: H2O, 1:1, 2 mL). Después de enfriar a temperatura ambiente, la solución se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en 2 ml de piridina con clorhidrato de éster metílico de L-cisteína 0,1 mol·L-1 y se agitó a 60 grados durante 1,5 h. Después de enfriarse y concentrarse, la mezcla se trató con trimetilclorosilano (TMSCl) y hexametildisilazano (HMDS) (1:2, V/V, 0,5 mL) en piridina (2 mL), seguido de agitación a 60ºC. grado durante 0,5 h. Luego, la solución se concentró a sequedad y el residuo se repartió con H2O y n-hexano (2 × 3 ml) [18]. La fracción de n-hexano se analizó mediante GC utilizando una columna DB-5 (0,25 mm × 30 m). Las temperaturas del inyector y del detector se fijaron en 220 grados. Se aplicó un sistema de gradiente de temperatura al horno, comenzando a 140 grados durante 1 minuto y aumentando hasta 250 grados a una velocidad de 4 grados·min−1. El pico del hidrolizado de derivado de azúcar se identificó por comparación del tiempo de retención con la muestra auténtica de D-glucosa (19,24 min) después de un tratamiento similar con TMSCl/HMDS.Inhibición de la producción de NO

Las actividades inhibidoras de NO de los compuestos aislados se evaluaron contra células microgliales BV-2 inducidas por LPS mediante el método de Griess utilizando un kit de ensayo de NO (Nanjing-Jiancheng BioTech Institute, Nanjing, Jiangsu, China) como se describió anteriormente [19], y quercetina como control positivo. Además, las viabilidades celulares se evaluaron mediante ensayo MTT.

Cistanche beneficio: antiinflamatorio

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