Efectos antiinflamatorios sinérgicos del extracto de Laminaria Japonica Fucoidan y Cistanche Tubulosa
Mar 03, 2022
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Resumen
losantiinflamatorioefectos del fucoidan yCistanche tubulosa (CT) se investigaron en el sistema de cultivo de macrófagos in vitro y en el modelo de inflamación de la bolsa de aire inducida por carragenina in vivo.Cistanche TubulosaEl extracto inhibió la producción de óxido nítrico a partir de células macrófagas RAW 264.7 activadas, mientras que el fucoidan fue inactivo. El modelo de inflamación de la bolsa de aire in vivo, la exudación vascular inducida por carragenina y el aumento de las concentraciones de óxido nítrico y prostaglandina E2 en los exudados se suprimieron sinérgicamente mediante la administración conjunta de fucoidan oCistanche Ttubulosaextracto. Además, la inflamación del tejido se atenuó sustancialmente con la terapia combinada. Sin embargo, no hubo efecto sinérgico contra elinflamatorioinfiltración celular, aunque fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)cada extracto redujo notablemente el número de células. Por lo tanto, se sugiere que el fucoidan bloquee la infiltración deinflamatoriocélulas, mientras que CT(Cistanche tubulosa) inhibe la activación de las células, y que su tratamiento combinado podría ser un candidato prometedor para el alivio de varios tipos de inflamación.
Palabras clave: carragenina, inflamación, fucoidan, extracto de Cistanche tubulosa.
Como respuesta inmunitaria contra antígenos extraños, los macrófagos liberan citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-), interleucina-1 (IL-1 ), IL-6 y otras. [1,2]. Tales citoquinas inducen una afluencia quimiotáctica de granulocitos, monocitos, linfocitos y mastocitos al tejido dañado que promueve la eliminación del antígeno y la recuperación del tejido [3,4]. Sin embargo, la infiltración excesiva y la activación de las células agravan las lesiones tisulares, dando lugar a edema (exudación vascular) y dolor, que son fenómenos inflamatorios bien conocidos.
TNF- es un factor importante para inducir la expresión del gen de la sintasa de óxido nítrico (iNOS) en varias líneas celulares. pero también causa inflamación [8,9]. Después de la lesión tisular, la degradación por fosfolipasas de los fosfolípidos de la membrana celular genera ácido araquidónico. El ácido araquidónico se descompone aún más por la ciclooxigenasa (COX) en prostaglandinas (PG) [10]. Una cantidad excesiva de PGE2 formada por COX-II induce varias citoquinas para la inflamación. Dado que tanto el NO como la PGE2 actúan como factores principales para la inflamación y la inducción del dolor, las vías TNF- y COX-II-PGE2 son las principales corrientes del proceso inflamatorio, que son inhibidas por corticosteroides y no esteroides.antiinflamatoriomedicamentos (AINE), respectivamente [10,11].
Aunque existen varios esteroides y AINE para la terapia de enfermedades inflamatorias, estos medicamentos pueden provocar efectos adversos en el sistema inmunológico, el tracto gastrointestinal, los riñones, el hígado, el sistema nervioso central, la presión arterial y el sistema cardiovascular [12-14 ]. Por lo tanto, es necesario minimizar los efectos adversos de las terapias químicas reemplazándolas o usándolas en combinación con productos naturales.
Fucoidan, complejo polisacárido de sulfato de algas marinas como Laminaria japonica y Cladosiphonokamuranus ampliamente distribuidas en muchos países, se ha utilizado como terapéutico en la medicina oriental durante un largo período. En estudios previos, se ha demostrado que el fucoidan tiene propiedades antioxidantes, anticoagulantes, anticancerígenas yantiinflamatorioactividades [15,16]. En consecuencia, los efectos beneficiosos del fucoidan sobre las enfermedades inflamatorias, la isquemia, la disfunción inmunitaria y los tumores están atrayendo la atención de los investigadores [17,18]. Por otra parte,Cistanche tubulosa(CT) también se ha utilizado ampliamente para la medicación tradicional en China. Se informó que el extracto de CT reduce la producción de TNF-α e IL-4, que son factores importantes para la producción de NO en la vía inflamatoria [19].
Tales hallazgos previos nos llevaron a investigar la eficacia combinada de fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)extracto en las 2 principales vías de inflamación. Para dilucidar el mecanismo de acción, analizamos NO y PGE2 en los exudados de la inflamación de la bolsa de aire inducida por carragenina [20].
Materiales y métodos
Materiales
Fucoidan semipurificado y extracto acuoso de CT(Cistanche tubulosa)se obtuvieron de Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Corea). El extracto de Fucoidan y CT se mantuvo a 4oC, se mezcló (1:3) y se disolvió en agua purificada antes de su uso y se administró por vía oral en un volumen de 5 ml/kg.
Cultivo celular y cuantificación de NO
La línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7 se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, EE. UU.) y se cultivó en medio de águila modificado por Dulbecco (Sigma, St. Louis, EE. UU.) que contenía suero bovino fetal al 10 por ciento y antibióticos [100 U/ml de penicilina ( Sigma) y 100 µg/ml de estreptomicina (Sigma)]. Las células se incubaron en una atmósfera humidificada con 5 por ciento de CO2 a 37oC.
Evaluar los efectos de fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)extracto sobre la secreción de NO, se incubaron células RAW 264.7 (1×106 células/mL) con fucoidan o extracto de CT (1–320 µg/mL) durante 5 min, seguido de interferón-(IFN- , 10 U/mL) y lipopolisacárido (LPS, 10 µg/mL) durante 24 horas. En nuestros estudios preliminares, se confirmó que el tratamiento con IFN- más LPS para la activación de células RAW 264.7 no afectó la viabilidad de las células hasta 24 horas y que el extracto de fucoidan y CT no fue citotóxico hasta 1 mg/mL. La concentración de nitrito (NO2–), el producto oxidado de NO, se midió como indicador de NO. El medio de cultivo se mezcló con un volumen igual de reactivo de Griess (sulfanilamida al 1 %, naftilendiamida al 0,1 % en ácido fosfórico al 2,5 %) [21] y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. La concentración de nitrito se analizó a 540 nm, donde se utilizó NaNO2 para generar una curva estándar.
animales y tratamiento
Se compraron ratones macho ICR (7 semanas de edad) de Daehan Biolink (Eumseong, Corea) y se alojaron en una habitación con condiciones ambientales constantes (22±2ºC;40-70 porcentaje de humedad relativa; 12-horas de luz - ciclo oscuro; 150-300 brillo de lux). La alimentación en gránulos y el agua purificada estaban disponibles ad libitum. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad Nacional de Chungbuk (CBNU), Corea, y se realizaron de acuerdo con los Procedimientos operativos estándar (SOP) del Centro de investigación de animales de laboratorio, CBNU.
Los ratones (n=8/grupo) fueron tratados por vía oral con fucoidan (18 o 54 mg/kg), CT(Cistanche tubulosa)extracto (54 o 162 mg/kg), o su mezcla (18 más 54, 54 más 162 o 90 más 270 mg/kg) una vez al día durante 7 días. Las dosis bajas de fucoidan (18 mg/kg) y extracto de CT (54 mg/kg) fueron de dosis humanas estimadas de 100 mg/cuerpo (70 kg) y 300 mg/cuerpo después de la traducción del área de superficie del peso corporal (Km{{14 }} para humano/Km=3 para ratón), respectivamente. Las dosis altas de fucoidan y extracto de CT se establecieron en 3 veces, solos o en la mezcla, y la mezcla de dosis más alta se fijó en 5 veces para evaluar los efectos sinérgicos máximos.
El 1er día de fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)tratamiento con extracto, a los ratones se les inyectó por vía subcutánea 10 ml de aire estéril en la parte trasera para formar una bolsa [22,23]. Después de 2 y 5 días, la bolsa se reinyectó con 5 ml de aire. Una hora después del tratamiento final, se inyectó en la bolsa 1 ml de carragenina (1 por ciento en solución salina; Sigma) o su vehículo (solución salina).
Análisis de los exudados
La bolsa de aire se lavó con 1 ml de solución salina fría 6 horas después de la inyección de carragenina y se registró el volumen neto de líquido de lavado. Se determinaron los números totales de células inflamatorias, neutrófilos, monocitos y linfocitos usando un contador Colter. Las concentraciones de NO y PGE2 se determinaron mediante el reactivo de Griess (Sigma) y el inmunoensayo enzimático (EIA) utilizando un kit de correlato-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, AnnArboUSA), respectivamente.
Examen histopatológico
Se retiró el tejido del revestimiento de la bolsa y se fijó en una solución de formalina neutra. Los portaobjetos de tejido embebidos en parafina se tiñeron con hematoxilina-eosina y se examinaron bajo un microscopio óptico en busca de lesiones inflamatorias.
análisis estadístico
Los resultados se presentan como media ± SE. Las comparaciones de grupos experimentales se realizaron mediante un análisis de varianza unidireccional seguido de una prueba de corrección de Tukey. Un valor P<0.05 was="" considered="" statistically="">
Resultados
El cultivo de células RAW 264.7 in vitro, el tratamiento con IFN- y LPS aumentaron considerablemente la producción de NO (Figura 1). El pretratamiento con fucoidan (1–320 µg/mL) no afectó la liberación de NO de la línea celular de macrófagos (Figura 1A). En comparación, la TC(Cistanche tubulosa)extracto (32–320 µg/mL) suprimió significativamente la producción de NO, indicativo deantiinflamatorioactividad (Figura 1B).
La inyección de carragenina en la bolsa de aire del ratón aumentó notablemente el volumen de exudado dentro de la bolsa (Figura 2). Dicho aumento de la exudación fue atenuado por el tratamiento con fucoidan (18 mg/kg) y CT(Cistanche tubulosa)extracto (54 y 162mg/kg). En particular, el tratamiento combinado de fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)el extracto disminuyó aún más el volumen de exudados, en comparación con los efectos individuales, aunque las combinaciones de dosis más altas (54 más 162 mg/kg y 90 más 270 mg/kg) no mostraron una eficacia adicional a la combinación de dosis más baja (18 más 54 mg/kg) (Figura 2A). El contenido de NO en la bolsa también aumentó drásticamente después de la inyección de carragenina (Figura 2B). En comparación con el efecto leve de fucoidan, CT(Cistanche tubulosa)extracto redujo notablemente la concentración de NO. El tratamiento combinado de fucoidan y extracto de CT disminuyó aún más el nivel de NO de manera dependiente de la dosis. De manera similar, el aumento del contenido de PGE2 fue suprimido sinérgicamente por la terapia combinada de fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)extracto (Figura 2C). En paralelo con los mediadores inflamatorios en la bolsa, el número de células inflamatorias aumentó drásticamente con la inyección de carragenina: 37,8, 4,8 y 24,1 veces los niveles de control para neutrófilos, monocitos y linfocitos, respectivamente (Tabla 1) . Sin embargo, fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)El extracto redujo significativamente la infiltración de células inflamatorias, en las que el fucoidan fue algo superior al extracto CT. Inesperadamente, no se logró ningún efecto sinérgico en la infiltración de células inflamatorias con la administración conjunta de fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)extracto.
Como se deduce de la infiltración de células inflamatorias en los exudados, el tejido subcutáneo que rodea las bolsas de aire presentaba lesiones inflamatorias graves (Figura 3). Se observaron una cantidad enorme de células en el tejido subcutáneo engrosado expuesto a la carragenina (Figura 3B), en comparación con las características casi normales en los animales de control (Figura 3A). Estas lesiones inflamatorias se atenuaron notablemente con el tratamiento con fucoidan (Figuras 3C y 3D) o con TC(Cistanche tubulosa)extracto (Figuras 3E y 3F). En particular, se obtuvieron efectos antiinflamatorios más altos con la terapia combinada con fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)extracto(Figuras 3G-3I)
Discusión
Usando un modelo de inflamación de la bolsa de aire inducida por carragenina in vivo, la inyección de aire en la espalda de los roedores induce la proliferación de células que se estratifican en la superficie de la cavidad para formar una estructura similar a la membrana sinovial. En este modelo, la inyección de infiltración de células inflamatorias inducida por carragenina aumentó el exudado, lo que es indicativo de fuga vascular. La bolsa de aire sirve como reservorio de células inflamatorias y mediadores que se pueden medir fácilmente en el líquido que se acumula localmente.
Entre los diversos mediadores inflamatorios que pueden inducir la permeabilidad vascular, es bien sabido que el NO y la PGE2 son factores importantes implicados en la patogenia de muchas enfermedades inflamatorias [24,25]. También son conocidos como mediadores de la inducción y percepción del dolor[10,11]. iNOS, que se expresa y activa en diversos tipos de células mediante la estimulación con TNF- y/o LPS durante la inflamación, produce concentraciones elevadas y persistentes de NO [3,5-7]. El NO es una molécula reguladora importante en diversas funciones fisiológicas, como la vasodilatación que conduce a la fuga vascular [8,9]. La PGE2, que se genera a partir del ácido araquidónico a través de la cox, contribuye al desarrollo de muchas enfermedades inflamatorias [26,27], y la sobreproducción de PGE2 en respuesta a diversas estimulaciones inflamatorias se asocia con la regulación positiva del nivel de COX-II y la progresión de la inflamación [28]. Por lo tanto, las vías TNF- -NO y COX-II-PGE2 se han considerado dos corrientes principales de procesos inflamatorios, que son bloqueadas por inhibidores de iNOS (corticosteroides) y COX (AINE), respectivamente [22,29].
En el presente estudio, la coadministración de fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)extracto redujo el volumen de exudado en la bolsa, lo que sugiere que poseen actividad supresora contra la fuga vascular (Figura 2A). En comparación con los efectos individuales de cada fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)extracto, el tratamiento combinado aumentó aún más, lo que implica que la acción de los dos compuestos de forma sinérgica. Dichos efectos sinérgicos entre el fucoidan y el extracto de CT fueron respaldados por sus actividades sobre los niveles de NO y PGE2 en los exudados (Figuras 3B y 2C).
Curiosamente, sin embargo, se confirmó que el fucoidan no inhibe directamente la activación del ensayo in vitro de macrófagos (Figura 1A). De manera similar, el potencial inhibitorio de fucoidan sobre la acumulación de NO y PGE2 en el bioensayo fue relativamente menor que el de CT(Cistanche tubulosa)extracto (Figuras 2B y 2C). Tal mecanismo de acción de fucoidan es diferente de una inactivación directa de las células por extracto de CT (Figura 1B). En comparación, el fucoidan ejerció una alta eficacia en la inhibición de la infiltración de células inflamatorias en las bolsas (Tabla 1). Fucoidan fue superior al extracto de CT en el bloqueo de la migración de neutrófilos, monocitos y linfocitos a los sitios de lesión tisular inducida por carragenina. Curiosamente, no hubo un efecto antimigratorio sinérgico, indicativo de diferentes mecanismos de acción entre el extracto de fucoidan y CT: es decir, el fucoidan bloquea la infiltración de células inflamatorias, mientras que CT(Cistanche tubulosa)extracto inhibe la activación de las células.
Las células polimorfonucleares, especialmente los neutrófilos, son los principales componentes celulares reclutados en los sitios inflamatorios agudos inducidos por la carragenina. Además, las células inflamatorias resultantes, como los macrófagos y los linfocitos, también desempeñan un papel central en el proceso inflamatorio al secretar citoquinas [22,30,31]. Cuando se trata previamente con fucoidan o CT(Cistanche tubulosa)extracto, la cantidad de glóbulos blancos que migraron a las bolsas de aire inyectadas con carragenina se suprimió notablemente. Este resultado fue consistente con un efecto que se obtendría con corticosteroides como la dexametasona, pero no con los AINE, incluida la indometacina [23,30]. Por lo tanto, se supone que el fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)extracto tienen en parte una propiedad de los esteroides.
Además de la acción bloqueadora de la quimiotaxis de células inflamatorias, la TC(Cistanche tubulosa)El extracto pareció suprimir la activación de los macrófagos. Esto fue confirmado por sus acciones inhibitorias sobre el NO in vitro e in vivo, que es el principal mediador inflamatorio producido por los macrófagos. Así, el efecto de la TC(Cistanche tubulosa)extracto en macrófagos podría deberse a una supresión de la expresión de ARNm y/o una inhibición directa de la actividad de iNOS en estas células.
PGE2 también es uno de los principales mediadores inflamatorios. Aumenta en paralelo con el edema tisular, que es suprimido por los AINE, inhibidores de la COX [21,22]. La carragenina puede aumentar la producción de PGE2 al inducir el ARNm de COX-II y la proteína COX-II en el exudado de la bolsa [32]. En este modelo, la carragenina aumentó significativamente la cantidad de PGE2 y CT la suprimió sustancialmente.(Cistanche tubulosa)extracto. Es interesante notar que este resultado fue consistente con un efecto que sería obtenido por un AINE indometacina [23]. Por lo tanto, se infiere de los resultados que el extracto de CT tiene la propiedad adicional de los AINE. En conjunto, se cree que la TC(Cistanche tubulosa)El extracto ejerció efectos similares a los de los corticosteroides y los AINE en el modelo de inflamación inducida por carragenina, y que el fucoidan mejoró laantiinflamatorioefectos del extracto de CT al bloquear la infiltración de células inflamatorias.
Aunque definir el mecanismo exacto de acción requiere más estudio, una mezcla de fucoidan y CT(Cistanche tubulosa) extraer signos inflamatorios marcadamente atenuados mediante el bloqueo de las vías TNF--NO y COX-II-PGE2 en la inflamación de la bolsa de aire inducida por carragenina. Estos hallazgos proporcionan evidencia de que el tratamiento combinado de fucoidan y CT(Cistanche tubulosa)extracto podría ser un candidato prometedor para el alivio de varios tipos de inflamación que responden a los corticosteroides o AINE.
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