Actividad antinociceptiva de estolones de salsa Cistanche, creciendo en la República de Kazajstán

Material vegetal

Salsa Cistanche(CAMey.) Beck, Orobanchaceae,los estolones se recolectaron en el desierto de Moinkum, pueblo de Bakanas, en julio de 2014 en Almaty. El material vegetal fue identificado por la Dra. G. Sitpayeva del Instituto de Botánica y Fitointroducción, Ministerio de Educación y Ciencias de la República de Kazajstán, donde se depositó con el número 01-04/306.

Análisis químico

Estolones deC salsa(2 g) fueron sometidos a una extracción por microondas. Inicialmente, el material se molió a 0.001–2.000 mm y luego se colocó en un recipiente hermético para extraerlo durante 10 min a 100–1100 grados con etanol al 80 por ciento ( relación 1:10). El extracto de hidroetanol (CSHE) se analizó por HPLC-MS. El extracto crudo se disolvió en metanol (9,6 mg/ml) y se filtró a través de un filtro de 0,45mm Membrana de teflón antes del análisis. Un cromatógrafo de líquidos modelo HP 1100 Series (empresa Agilent Technologies, Inc., CA, EE. UU.), equipado con un desgasificador de vacío de flujo, una bomba de gradiente de baja presión de cuatro canales y uninyector. Los compuestos fenólicos fueron separados cromatográficamente por una columna Zorbax Eclipse XDB-C18, 2.1× 50 mm, relleno con polímero de gel de sílice de octadecilsililo (1,8μ). El análisis cromatográfico se realizó con un flujo de fase móvil de 0.2ml/min, presión de operación del eluyente de 175–200 kPa, temperatura del horno de columna de 30 grados, volumen de muestra de 2 ml, modo de alimentación de eluyente en gradiente: 0–36 min 10 % A – 90 % B; 36 min – 100 por ciento B (eluyente A: metanol, eluyente B: solución de ácido fórmico al 0,2 por ciento). La detección se realizó por UV en las longitudes de onda de 254, 334, 350, 410, 450 y 550Nuevo Méjico. La comparación de los tiempos de retención, UV y espectros de masa obtenidos con los de los compuestos de referencia se usó para la identificación de los compuestos químicos en el extracto. El análisis cuantitativo se realizó mediante el uso de verbascoside estándary equinacósido analizados en las mismas condiciones cromatográficas. Sus curvas de calibración permitieron el cálculo de la cantidad de cada uno de los fenilpropanoidesglucósido en el extracto etanólico de esta planta. El método no fue validado.

animales

Ratones Swiss Webster (20–25g, dos meses de edad) fueron utilizados en este estudio (donados por el Instituto Vital Brasil, Niterói, RJ, Brasil). Los animales se mantuvieron en condiciones estándar (ciclo de luz-oscuridad de 12 h, 22 ± 2 grados y 70-80 por ciento de humedad). Alimentos y aguaad libitum). Los animales recibieron solo agua para evitar que los alimentos interfirieran con la absorción de sustancias 12h antes del inicio de los experimentos. La aclimatación a las condiciones del laboratorio ocurrió durante al menos 1 h antes de cada prueba. Todos los protocolos se realizaron de acuerdo con las Directrices sobre normas éticas para la investigación del dolor experimental en animales y siguieron los principios y directrices adoptados por el Consejo Nacional para el Control deExperimentación Animal (CONCEA), aprobado por elInstituto de Ciencias Biomédicas/UFRJ, Comité de Ética en Investigación Animal, y recibió el número DFBCICB015-04/16. Todos los protocolos experimentales se realizaron durante la fase de luz. El número de animales por grupo se mantuvo al mínimo y de acuerdo con las normas del CONCEA. Al final de cada experimento, los ratones se sacrificaron por sobredosis de ketamina/xilazina.

Tratos

En este estudio CSHE se evaluó a los 10, 30 y 100 mg/kg. El extracto se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO, Fisher Biotech) para preparar una solución madre a 100 mg/ml. Se utilizó PBS como diluyente para la preparación de las diferentes dosis. Soluciones que contienen 10, 30 y 100mg/kg del extracto de hidroetanol deC salsaestaban preparados. Los fármacos estándar utilizados fueron morfina 2,5mg/kg (Merck, diluido en tampón de fosfato salino (PBS)), ácido acetilsalicílico 200mg/kg (Sigma Aldrich, disuelto con 5M de hidróxido de sodio(NaOH) en 0,9 por ciento de solución salina) y capsazepina 10 nMol por pata. Se administró solución salina más DMSO (a la misma concentración que en el tratamiento más alto con extracto) al grupo de control negativo. Todos los tratamientos (extracto ensayado y estándares) se administraron por vía oral. La única excepción fue la capsazepina, que se administró mediante inyección intraplantar.

Dolor agudo inducido por formalina

Se inyectó una solución de formalina al 2,5 por ciento (formaldehído al 37 por ciento) (20ul) en la región plantar de la pata trasera derecha de ratones 60min después del tratamiento (extracto de hidroetanol deC salsao ácido acetilsalicílico 200 mg/kg o morfina 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Los animales se colocaron individualmente en una cámara de vidrio transparente y se registró y analizó la duración del tiempo en segundos que pasaron lamiéndose la pata después de la inyección de formalina en dos períodos separados, dolor neurogénico de fase temprana (0-5 min después de la inyección) y dolor inflamatorio de fase tardía (15-30 min después de la inyección).

Nocicepción inducida por capsaicina

Esta prueba se basó en el método descrito por Sakurada et al. con algunas modificaciones (Sakurada et al., 1992). Capsaicina (20 ul) C18H27NO3(Galena, Campinas, SP) en la región plantar de la pata trasera derecha de los ratones (1,6 ug/pata) una hora después del tratamiento (extracto hidroetanol deC salsao capsazepina 10 nMol/pata). Los animales se colocaron individualmente en una cámara de vidrio y la duración de lamerse las patas se registró entre 0 y 5min después de la inyección de capsaicina y luego analizados.

Nocicepción inducida por glutamato

En el método descrito por Beirith et al. (2002), solución de glutamato en PBS (20 ul) (l-ácido glutámico, Sigma-Aldrich, 3,7 ng/pata) en la región plantar de la pata trasera derecha de los ratones una hora después del tratamiento (extracto de hidroetanol deC salsao morfina 2,5 mg/kg). Los animales se colocaron individualmente en una cámara de vidrio y se registró la duración de lamer la pata (segundos) entre 0 y 15 min después de la inyección de glutamato y luego se analizó.

análisis estadístico

Los datos químicos se presentan como media ± SD de cinco experimentos. Todos los grupos experimentales farmacológicos consistieron en un mínimo de seis ratones. El análisis de la varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de Dunnett permitió la visualización de la significación estadística entre los grupos utilizando el software GraphPad Prism 5.0.plos valores se consideraron significativos cuando fueron inferiores a 0.05 (p < 0.05).

Discusión

Se identificaron un total de diez glucósidos fenilpropanoides en elC salsa(que crece en Kazajstán) extracto de hidroetanol. El echinacósido (10,98 mg/g), el acteósido (9,44 mg/g) y el tubulosido B (7,94 mg/g) fueron los principales compuestos identificados. Los datos obtenidos se correlacionaron con la literatura disponible para las especies deCistanchecreciendo en diferentes regiones de Asia (Zhou et al., 2014, Xie et al., 2005, Jiang et al., 2009). El echinacósido y el acteósido son los componentes principales, que forman la base para la estandarización de las especies oficinales.C. deserticolayC. tubulosa, incluido en la Farmacopea China en 2005. Proponemos que estos compuestos también podrían usarse para la estandarización deC salsaestolones de Kazajstán, ya que son los principales en el extracto de hidroetanol estudiado.

De acuerdo con los resultados farmacológicos de este estudio es posible sugerir que el CSHE es un agente eficaz contra el dolor neurogénico y la inflamación como se observó en la prueba de formalina. A lo mejor de nuestro conocimientoC salsanunca se ha probado en relación con sus acciones antinociceptivas. Un estudio de 2002 conC. deserticola(Lin et al., 2002) ha demostrado que esta planta presentó actividades antinociceptivas y antiinflamatorias cuando se ensayó en modelos como retorcimiento total, formalina y edema de la pata. Aunque no se intentó investigar los componentes principales de los extractos activos, se consideró que el extracto de butanol y la capa de agua eran los activos. No es sorprendente que estos solventes estén en la escala de polaridad que coincide con el fenilpropanoideglucósidos que se encuentran enC salsa. Además, Lin y colaboradores establecieron que la acción antinociceptiva deC. deserticolaextractos no se debió a la acción del compuesto en el receptor de opiáceoso relacionados con el sistema inmunológico. En nuestro estudio, el extracto rico en fenilpropanoide mostró actividad en ambas fases de la prueba de formalina. La actividad observada se debió de hecho al objetivo farmacológico investigado y no a una posible alteración motora como lo demuestra la prueba de la varilla rotatoria. Los resultados de la prueba de formalina indican potencial para el dolor neurogénico, así como el dolor inducido pormediadores inflamatorios. Inicialmente decidimos investigar la ruta del dolor neurogénico. Debido a que compuestos similares de otras especies previamente estudiadas no mostraron ninguna actividad de receptor de opiáceos, decidimos probar otros modelos, como los modelos de glutamato y capsaicina.

El glutamato es un neurotransmisor excitatorioque tiene un papel importante en la modulación del dolor en todo el sistema nervioso periférico y central. Esta acción está mediada por receptores de glutamato ionotrópicos controlados por ligandos.(iGluRs) y receptores metabotrópicos de glutamato. Los iGluR se pueden dividir enN-metilo-d-aspartato (NMDA) y -amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-ácido propiónico (AMPA) (Kolber, 2015). La investigación ha demostrado que cuando se antagonizan los receptores NMDA y AMPA con ketamina ykainato, respectivamente, se observa un efecto antinociceptivo. Sin embargo, los antagonistas dirigidos a estos receptores hasta ahora han inducido un efecto adverso sustancial y, por esta razón, se ha llevado a cabo una nueva investigación centrada en mGluR con la esperanza de que la medicina mediada a través de este receptor cause menos efectos secundarios (Palacio et al., 2014). Los resultados de las pruebas del CSHE mostraron que este tratamiento fue eficaz para reducir el dolor inducido por el glutamato. Sin embargo, aún se desconoce si este efecto está mediado por receptores ionotrópicos y/o metabotrópicos. La morfina es uno de los fármacos disponibles que tiene efecto sobre la transmisión glutamatérgica (Deyama et al., 2007).). Se informa en la literatura que la activación del receptor de glutamato aumenta las respuestas TRPV1 (Szteyn et al., 2015). Por esa razón, es posible que el efecto observado para CSHE se deba a la actividad sobre TRPV1 y no necesariamente a través de una respuesta directa sobre los receptores de glutamato.

El siguiente paso de esta investigación fue realizar una prueba de lamerse las patas utilizando como agente algésico la capsaicina, que es un agonista del receptor TRPV1. Los resultados mostraron que, de hecho, CSHE disminuyó el dolor a través del receptor TRPV1.

En el caso de CSHE, en casi todas las metodologías probadas, pudimos observar que la dosis de 30 mg/kg logró mejores resultados que la de 100 mg/kg. Esto puede deberse a que la saturación de la solución conduce a compuestos precipitados y, de hecho, a una menor cantidad de fármacos biodisponibles.

Confirmar la composición química establecida para el extracto kazajo CSHE fue un paso importante porque los principales constituyentes presentes en él ya han confirmado de alguna manera sus acciones antinociceptivas/antiinflamatorias. Por ejemplo, el equinacósido se estableció como uno de los principios activos responsables de la acción antinociceptiva deEquináceas(Hostetmann, 2003). Además, un estudio previo de Schapoval y colaboradores (Schapoval et al., 1998) señaló el acteoside como uno de los principales principios activos en un extracto de etanol preparado conStachytarpheta cayennensissegún lo evaluado por edema de la pata y modelos de placa caliente. Backhouse y colaboradores (Backhouse et al., 2008) también consideraron que el acteósido es el principio activo deBuddlejaglobosautilizando varios modelos de evaluación del dolor, incluida la prueba de formalina. Ahora se están desarrollando nuevas formulaciones utilizando los conocimientos más avanzados para aumentar la estabilidad y prolongar la acción antinociceptiva del acteósido (Isacchi et al., 2016).

Conclusión

Se identificaron diez sustancias de naturaleza fenólica en los estolones del kazajoC salsapor análisis HPLC/MS. Estos compuestos podrían ser los responsables de la actividad antinociceptiva observada en los modelos experimentales realizados en este documento. Teniendo en cuenta que en el territorio de Kazajstán el géneroCistancheestá representada principalmente por especiesC salsa, podemos recomendar su recolección y estandarización utilizando echinacósido y acteosido como compuestos estándar, para obtener una materia prima de buena calidad para la Medicina Tradicional China.